Standardisation du modèle MCAO intraluminal Rat : un protocole détaillé avec des mesures de contrôle qualité

Résumé

Ce protocole démontre une technique optimisée d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) de 60 minutes chez les rats. Le protocole est validé à l’aide d’approches multimodales, atteignant un taux de réussite de 87,5 % avec une mortalité minimale et des résultats reproductibles sur les infarctus et comportementaux pour la recherche sur l’AVC.

Résumé

Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) chez le rat reste la référence pour élucider la physiopathologie de l’AVC ischémique et valider les thérapies neuroprotectrices. Cependant, des déviations chirurgicales subtiles peuvent profondément modifier le volume de l’infarctus et les résultats comportementaux. En utilisant un cadre « visualiser puis systématiser », nous avons réexaminé chaque étape de l’établissement et de la validation du modèle. Une documentation photographique détaillée des principaux repères chirurgicaux et des étapes critiques a été réalisée pour standardiser l’orientation anatomique et le placement des filaments. La coloration au chlorure de 2,3,5-Triphényltétrazolium (TTC) a été utilisée pour cartographier précisément le volume et la topologie des infarctus à 24 h et 72 h après la reperfusion. Les déficits neurologiques ont été classés selon les échelles Zea-Longa, Bederson et Garcia modifiées. Vingt-quatre rats mâles de Sprague-Dawley ont subi une MCAO transitoire de 60 minutes ; Les scores de volume d’infarctus et neurologiques ont été évalués à 24 h et 72 h. Environ 87,50 % des animaux ont réussi à bloquer le flux sanguin cérébral (Zea-Longa ≥ 1 et infarct défini défini par la TTC sans équivoque), avec une mortalité globale de 12,50 %, attestant de la haute fidélité du modèle. Ce protocole standardisé fournit une base techniquement affinée et reproductible pour la recherche préclinique sur l’AVC, facilitant la cohérence interlaboratoire dans les études sur la physiopathologie de l’AVC et les interventions thérapeutiques.

Introduction

L’AVC est la deuxième cause de décès et la troisième cause d’invalidité dans le monde ^1,2. L’AVC touche de manière disproportionnée les pays à revenu faible et intermédiaire, où il survient en moyenne 15 ans plus tôt que dans les pays à revenu^{élevé 1}. Les deux principaux types sont l’AVC ischémique (85 %) et l’hémorragie intracérébrale (15 %). L’AVC ischémique, qui représente la grande majorité des AVC, résulte d’une obstruction du flux sanguin cérébral, entraînant la mort cellulaire et un infarctus^{cérébral 4}. La cascade ischémique implique de multiples événements biochimiques, dont des processus pro-oxydatifs importants ^5,6.

Malgré de nombreux efforts précliniques et cliniques, seules quelques thérapies — notamment la thrombolyse intraveineuse avec activateur de plasminogène tissulaire et thrombectomie mécanique — se sont révélées efficaces, et ces traitements sont limités par des fenêtres thérapeutiques étroites et des critères stricts de sélection des patients. Par conséquent, il est urgent d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la lésion ischémique, à la réparation neurovasculaire et à la récupération post-AVC. Un modèle animal reproductible et cliniquement pertinent est indispensable pour atteindre cet objectif.

Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO) est largement utilisé pour étudier l’AVC ischémique chez^{les rongeurs 7,8}. La méthode d’occlusion par filament intraluminique est l’une des techniques MCAO les plus classiques et largement^{utilisées 9}. Cette technique peut modéliser à la fois des occlusions permanentes et transitoires sans nécessiter de craniectomie. Une technique transfémorale plus récente utilisant des fils endovasculaires a montré des promesses pour induire la MCAO transitoire chez les rats, offrant des résultats plus^{cohérents 10}. Ce modèle consiste à occulter l’artère cérébrale moyenne, généralement à l’aide d’une technique de filament^{intraluminal 11}. Le MCAO provoque une hypoperfusion cérébrale focale, entraînant une ischémie et une lésion de la reperfusion¹².

Bien que le MCAO soit précieux pour étudier la physiopathologie de l’AVC et les traitements potentiels, il peut produire des volumes de lésions^{variables 7}. Ainsi, des améliorations apportées au modèle MCAO — telles que l’affinement des techniques de reperfusion, l’établissement de protocoles opérationnels standardisés et l’élaboration de critères d’évaluation unifiés — peuvent réduire la variabilité de la localisation et du volume de l’infarctus, renforçant ainsi son utilité dans la recherche sur l’AVC ischémique.

Ce protocole nécessite une courbe d’apprentissage d’environ 10 à 15 interventions chirurgicales pour obtenir des résultats^{constants 13}. Les taux de réussite peuvent varier en fonction de l’expérience de l’opérateur et de la souche^{du rat 14}. Le modèle convient à l’étude de l’AVC ischémique aigu mais peut ne pas reproduire entièrement les comorbidités humaines telles que l’hypertension ou^{le diabète 15}. En conséquence, nous avons cherché à concevoir et valider rigoureusement un protocole MCAO optimisé visant à réduire la variabilité expérimentale grâce à des procédures standardisées et des mesures rigoureuses de contrôle qualité. Quatre innovations complémentaires ont été intégrées pour obtenir des gains doubles en standardisation et fiabilité des données : (1) Évaluation longitudinale à double point temporel — les scores neurologiques des échelles Zea-Longa, Bederson et Garcia modifiée ont été obtenus en parallèle avec des volumes d’infarct dérivés du chlorure de 2,3,5-Triphényltétrazolium (TTC) à 24 h et 72 h après la réperfusion, délimitant la relation temporelle entre la résolution de l’œdème et la récupération fonctionnelle ; (2) Validation croisée à triple échelle — un score aveuglé, à double enquêteur avec calibration intégrée à trois échelles — augmentait significativement la sensibilité et la précision de l’évaluation comportementale ; (3) Une coupe rapide hypothermique sur toute la chaîne — une procédure opérationnelle standard (SOP) de « 90 s d’extraction par bain de glace suivie d’une tranche coronale en une seule étape de 2 mm dans des moules pré-refroidis » a été mise en place pour minimiser l’autolyse et l’erreur humaine, garantissant des mesures volumétriques à haute fidélité ; (4) Cadre intégré de contrôle qualité — une procédure opérationnelle opérationnelle opérationnelle opérationnelle (SOP) complète couvrant le jeûne préopératoire, le contrôle de la profondeur anesthésique, la thermorégulation préopératoire et la prévention de la contamination croisée — a été construit afin de fournir une procédure opérationnelle standard MCAO reproductible et facilement transférable, posant une base solide pour la cohérence inter-laboratoire et la comparabilité inter-études.

Protocole

L’expérience a été approuvée et supervisée par le Comité des expériences animales institutionnelles et du bien-être expérimental des animaux de la Capital Medical University. Tous les protocoles conformes au NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publ. 80-23, rév. 1996), ainsi que des équipements stériles ainsi que des techniques aseptiques sont nécessaires.

1. Sélection des animaux

1. Utilisez des rats mâles de Sprague-Dawley (âgés de 6 à 8 semaines, pesant 240 à 270 g) obtenus auprès d’un fournisseur certifié d’animaux de laboratoire (Licence n° SCXK (Pékin) 2021-0011) pour établir un modèle de MCAO.
2. Héberger les animaux de manière conventionnelle avec de la nourriture et de l’eau ad libitum ; toutes les procédures suivaient le Code international d’éthique.
3. Utilisez les critères suivants basés sur le poids corporel animal pour la sélection de la taille du filament afin d’assurer une occlusion cohérente :
   - 220–250 g : 0,33–0,35 mm de diamètre
   - 250–280 g : diamètre 0,35–0,38 mm
   - 280–310 g : 0,38–0,40 mm de diamètre
   REMARQUE : Ces spécifications tiennent compte des augmentations liées à l’âge du diamètre du vaisseau et réduisent l’incidence de l’AS ou de l’occlusion^{incomplète 13}.

2. Taille de l’échantillon

1. Calculez la taille de l’échantillon à l’aide d’un logiciel de calcul de taille d’échantillon. Sur la base de données préliminaires montrant un volume d’infarctus attendu de 35 % ± 10 % (moyenne ± SD) dans le groupe MCAO contre 0 % ± 2 % dans le groupe SHAM, estimez une taille d’effet (d de Cohen). Pour un test Mann-Whitney U à deux queues (alternative non paramétrique au test t), avec α = 0,05 et puissance (1-β) = 0,80, calculer une taille minimale d’échantillon.
   REMARQUE : La taille de l’effet a été estimée à 3,5 et la taille minimale de l’échantillon était de 6 animaux par groupe.
2. Pour tenir compte de la mortalité anticipée (12,5 %) et du taux d’exclusion (5–10 %), incluez 24 rats du groupe MCAO et 6 rats du groupe SHAM, fournissant une puissance suffisante (>0,90) pour le critère principal (volume d’infarctus à 24 heures).

3. Critères d’inclusion et d’exclusion

1. Inclure les animaux s’ils remplissaient les critères suivants : (1) rats mâles de Sprague-Dawley, 240–270 g, âgés de 6 à 8 semaines ; (2) absence de déficits neurologiques préexistants (score neurologique préopératoire = 0) ; (3) induction réussie de l’anesthésie sans complications.
2. Exclure les animaux de l’analyse s’ils présentaient : (1) une hémorragie sous-arachnoïdienne (SAH) évidente lors de la nécropsie ; (2) décès prématuré (<24 h post-réperfusion) sans lien avec l’intervention expérimentale ; (3) échec de l’occlusion (score neurologique = 0 et absence d’infarctus défini selon la tentative de conception) ; (4) défaillance chirurgicale technique (par exemple, rupture de la CCA).
   REMARQUE : Ces critères ont été prédéfinis avant le début de l’étude afin de minimiser le biais de sélection.
3. Politique de remplacement animal : Remplacer uniquement les animaux exclus en raison d’une défaillance chirurgicale technique ou d’un décès intraopératoire afin de maintenir la puissance statistique. Ne remplacez pas les animaux par des modélisations infructueuses (occlusion ratée), mais signalez-les dans le calcul du taux de réussite afin d’éviter une réduction artificielle de la variabilité.

4. Préparations pré-chirurgicales

1. Préparez des outils autoclavés, du filament stérile et un champ drapé.
2. Aucun jeûne régulier n’est requis ; Lorsque nécessaire, limitez la durée du jeûne à 2 à 4 heures. Induire l’anesthésie avec de l’isoflurane (3–4 %) et maintenir une anesthésie à 1,5–2 % dans 30–40 % d’O₂ pendant la procédure. Confirmez la profondeur de l’anesthésie par la perte du réflexe de redressement et la pincée des orteils.
3. Maintenez la température corporelle à 37 ± 0,5 °C à l’aide d’un coussin chauffant à rétroaction avec surveillance rectale.
4. Raser le cou et le cuir chevelu, puis nettoyer la zone avec de l’iode povidone, suivi d’un traitement à 70 % d’éthanol.
5. Administrez la buprénorphine (0,05 mg/kg, sous-cutanée) 30 minutes avant l’opération et toutes les 12 heures postopératoires pendant 48 heures, ou du méloxicam (1 mg/kg, sous-cutané) une fois par jour pendant 3^{jours 16}. Évaluer la douleur en surveillant le comportement de toilettage, la posture et l’activité spontanée ; Administrez des analgésiques supplémentaires si les signes d’inconfort persistent.

5. Occlusion de la MCA

1. Placez le rat en couché dorsal avec la tête doucement tendue pour exposer le cou ventral.
2. Réalisez une incision cervicale médiane (1,5–2,0 cm) à l’aide de ciseaux à iris.
3. Séparez de manière directe les muscles sternomastoïdien et omohyoïdien à l’aide de pinces courbées pour exposer la bifurcation de l’artère carotide commune gauche (ACC).
4. Liguez l’artère carotide externe (ECA) distalement avec une suture permanente en soie 4-0 et proximalement avec une ligature temporaire. Créez une petite incision entre les deux ligatures ECA à l’aide de microciseaux.
5. Obstruer temporairement l’ACC et l’artère carotide interne (ACI) à l’aide de pinces microvasculaires (pression de 60 g).
6. Insérez un monofilament recouvert de silicone 4-0 (0,35–0,40 mm de diamètre) à travers l’incision ECA. Avancez-la rétrogradément dans le CCA, puis redirigez-la vers l’ICA au-delà de la bifurcation du CCA.
   REMARQUE : Assurez-vous que le filament pénètre dans l’ACI vers la base crânienne, et non vers l’artère ptérygopalatine (PPA) qui se ramifie latéralement. Si une résistance est rencontrée à <10 mm, rétractez le filament, faites pivoter la tête de l’animal de 30° vers le côté contralatéral, puis redirigez pour dépasser l’origine PPA.
7. Avancez le filament de 18 à 20 mm depuis la bifurcation CCA jusqu’à ce qu’une légère résistance indique une occlusion de l’origine MCA. Vérifiez la profondeur à l’aide de la ligne de référence pré-marquée sur le filament (positionnée 2 mm proximal du bouchon en silicone), mesurée avec un pied à coulisse depuis le point d’insertion du moignon ECA. Relâchez la serre CCA une fois que le filament est en place.

6. Réperfusion

1. Après 60 minutes d’occlusion, rouvrez l’incision et desserrez la ligature temporaire de l’ECA.
2. Retirez doucement le filament jusqu’à ce que sa pointe franchisse le moignon de l’ECA, restaurant ainsi la circulation sanguine. Placez rapidement une ligature permanente proxime du moignon pour éviter les saignements de dos. Refermer la plaie en couches.
3. Transférez le rat dans une cage de récupération chauffée pour une surveillance continue.

7. Chirurgie simulée

1. Préparez l’animal en suivant la même procédure décrite ci-dessus pour le MCAO (jeûne, anesthésie, contrôle de la température, drapage stérile).
2. Effectuer une incision cervicale et une exposition à la bifurcation CCA comme indiqué ci-dessus.
3. Disséquez et exposez le vaisseau. N’insérez pas le filament.
4. Laissez les artères rester pertes ; Ne provoquez pas d’ischémie cérébrale.
5. Fermez l’incision en couches après 10 minutes d’exposition. Transférez l’animal dans une cage de récupération chauffée pour la surveillance.

8. Scores neurologiques postopératoires

1. Évaluer à 24 h et 72 h après la réperfusion, juste avant le sacrifice pour la mesure du volume de l’infarctus.
2. Habituez l’animal dans une pièce calme, à 25 °C pendant 30 minutes.
3. Faites en sorte que deux enquêteurs indépendants soient aveugles à l’attribution des groupes. Faire enregistrer à chaque enquêteur les scores sur des feuilles séparées sans consultation ; Toute différence entre évaluateurs ≥1 point déclenche une réévaluation.
4. Échelles (dans l’ordre d’administration) : Effectuer les scores^{Zea-Longa 17} (Tableau 1), Bederson¹⁸ (Tableau 2) et Garcia¹⁹ modifié (Tableau 3), suivant les derniers protocoles publiés pour des critères cohérents.
5. Utilisez la moyenne des deux observateurs pour l’analyse statistique. Excluez les données de tout animal si les scores moyens diffèrent de >10 % et remplacez-les par un nouveau sujet.

9. Mesure du volume d’infarctus cérébral

1. À 24 h et 72 h après la réperfusion, on anesthésie profondément les rats avec 5 % d’isoflurane. Confirmez l’anesthésie profonde par la perte du réflexe de redressement et de la réponse de pincement des orteils, ainsi qu’une respiration stable, avant de poursuivre.
2. Retirez rapidement le cerveau dans les 90 secondes suivant la confirmation d’anesthésie profonde, rincez avec du PBS bien froid, puis découpez en tranches coronales de 2 mm à l’aide d’une matrice cérébrale de rat refroidie. Lors du tranchement, respectez les précautions suivantes
   1. Gardez toute la procédure sur glace à 0–4 °C ; Prélève le cerveau dans les 90 secondes et positionne-le à plat dans une matrice pré-refroidie.
   2. Utilisez une lame tranchante pour effectuer des coupes uniques et nettes pour des coupes coronales précises de 2 mm, en collectant chaque tranche en ordre rostro-caudal dans un PBS glacé.
   3. Nettoyez immédiatement la matrice et la lame avec 75 % d’éthanol entre les animaux pour éviter la contamination croisée.
3. Après avoir pré-réchauffé 2 % en essayant de faire 37 °C, immergez complètement les tranches et faites couver dans le noir pendant 20 minutes, en faisant doucement tourner toutes les 5 minutes à 20 minutes.
4. Arrêtez immédiatement la réaction en rinçant trois fois avec un PBS à 4 °C. Ensuite, ajoute du paraformoldéhyde à 4 % à 4 °C pendant la nuit.
5. À 300 dpi, photographiez les deux côtés de chaque tranche une fois.
   1. Utilisez un éclairage fixe sur un fond blanc pour éliminer les ombres et les reflets.
   2. Posez les tranches à plat sans chevauchement, et incluez une barre d’échelle et une étiquette d’identification dans chaque image. Tenez l’appareil perpendiculaire aux sections et gardez la distance focale et la balance des blancs constantes tout au long du projet.
6. Quantifiez le volume d’infarctus à l’aide d’ImageJ.
   1. Importez l’image 300 dpi (format RVB) et convertissez en niveaux de gris 8 bits (Image > Type > 8 bits).
   2. Appliquez l’auto-seuil d’Otsu (Image > Ajustez > Seuil Automatique > sélectionnez Otsu) pour séparer l’infarctus (blanc) du tissu viable (rouge).
   3. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour délimiter la frontière de l’hémisphère ipsilatéral.
   4. Mesurez la surface (analysez > mesurez) et enregistrez le nombre de pixels.
   5. Calculer le volume de l’infarctus : Σ (aire de l’infarct × épaisseur de tranche [2 mm]) × (volume de l’hémisphère contralatéral/volume de l’hémisphère ipsilatéral), exprimé en pourcentage de l’hémisphère controlatéral.

10. Analyse statistique

1. Présentez les données en moyenne ± écart-type (DE) ou médiane [intervalle interquartile] selon le cas.
2. Effectuer des comparaisons entre groupes en utilisant le test t de Student non apparié ou le test Mann-Whitney U pour des données anormalement distribuées.
3. Fixer la signification statistique à P < 0,05. Effectuez toutes les analyses à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié.

Résultats

Les animaux ont été répartis aléatoirement dans des groupes de survie post-reperfusion de 24 heures (n = 10) ou 72 heures (n = 10) pour la coloration terminale des TTC. Quatre rats supplémentaires ont subi un MCAO mais sont décédés avant la date finale prévue (taux de mortalité de 12,5 %). Le groupe SHAM comprenait n = 6. Ainsi, le nombre total d’animaux utilisés était de 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Les rats ont subi une MCAO de 60 minutes pour induire une ischémie cérébrale (Figure 1). La reperfusion a été initiée par le retrait du filament intraluminal et la libération de la ligature proximale lors de l’ECA. Parmi les 24 rats MCAO, 3 sont morts dans les 72 heures ; l’un a montré un infarctus important lors de la coloration post-mortem en TTC dans les 24 heures, tandis que l’autre est décédé de causes indéterminées en 72 heures. Deux rats supplémentaires ont été exclus en raison d’un manque de modélisation infructueux (les scores neurologiques ne répondaient pas aux critères, et la coloration en tentant de concevoir n’a révélé aucun infarctus). Ainsi, le taux de mortalité sur 72 heures était de 12,50 %. Nous avons défini l’établissement réussi du modèle comme la survie sur 24 heures plus un score de Longa de 1 à 3, et le taux de modélisation réussi a atteint 87,50 %.

La fonction neurologique a été évaluée à 24 h et 72 h après le début de l’AVC (avant la mesure du volume de l’infarctus). Les trois échelles les plus couramment utilisées rapportées dans la littérature — Zea-Longa, Bederson et Garcia modifiée — ont été employées pour fournir une évaluation complète (Figure 2). À 24 heures, les rats (n = 20) ont obtenu un score de 2,02 ± 0,41 sur l’échelle Zea-Longa, 2,80 ± 0,41 sur l’échelle de Bederson, et 8,15 ± 1,18 sur l’échelle Garcia modifiée ; ces déficits restaient marqués à 72 h (Zea-Longa : 1,65 ± 0,59 ; Bederson : 1,93 ± 0,38 ; Garcia modifié : 11.00 ± 1.34). Le volume d’infarctus, exprimé en pourcentage de l’hémisphère controlatéral, était de 37,61 ± 2,81 % à 24 h après MCAO et a diminué à 28,32 ± 4,18 % à 72 h.

Figure 1 : Schéma de la physiologie artérielle cervico-cérébrale gauche et de l’embolie de l’artère cérébrale moyenne chez le rat. Schéma de (A) l’anatomie artérielle cervico-cérébrale, (B) la pré-insertion, (C) la post-insertion, et (D) la malposition du filament dans l’artère ptérygopalatine. ACC : artère carotide commune ; ACI : artère carotide interne ; ECA : artère carotide externe ; PPA : artère ptérygopalatine ; MCA : artère cérébrale moyenne. « Triangle noir » : le site de l’incision ; Ligne bleue : le filament. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Mesure du volume de l’infarctus et évaluation neurologique comportementale après une occlusion de l’artère cérébrale chez les rats. (A) Coloration des coupes cérébrales à la tentative de conception. (B) Le volume d’infarctus à 72 h est plus faible qu’à 24 h. (C,D) Les scores Zea-Longa et Bederson à 72 h sont plus faibles qu’à 24 h. (E) Les scores Garcia modifiés à 72 h sont plus élevés qu’à 24 h. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Manifestation	Score / points
Aucun déficit neurologique	0
Membre antérieur controlatéral fléchi et adduit pendant la suspension de la queue (déficit neurologique léger)	1
Tournée spontanée vers le côté controlatéral en rampant (déficit neurologique modéré)	2
Tomber du côté controlatéral en étant debout ou en marchant	3
(déficit neurologique sévère)
Aucun mouvement spontané accompagné d’une conscience altérée	4

Tableau 1 : Score Zea-Longa^.

Manifestation	Score/points
Saisissez la queue de l’animal et soulevez-la de façon à ce que le corps soit suspendu à 10 cm au-dessus du banc. Chez les rats normaux, les deux membres antérieurs restent étendus vers le sol. Les rats présentant des déficits neurologiques peuvent présenter les comportements suivants :
Aucun déficit neurologique	0
Le membre antérieur parétique est fléchi et maintenu près de l’abdomen, tandis que le membre non affecté s’étend vers le banc	1
En plus du comportement décrit dans le 1, la résistance à la poussée latérale vers le côté parétique est nettement réduite lorsque l’animal est placé allongé sur le banc	2
En plus des comportements décrits dans les numéros 1 et 2, l’animal tourne en rond vers le côté parétique en marchant	3

Tableau 2 : score de ^Bederson.

Objet	Manifestation	Score/points
a) Mouvement spontané	Activité normale	3
(Observez l’activité du rat dans sa cage pendant 5 minutes)	Légèrement altéré	2
	Modérément altéré	1
	Aucun mouvement spontané	0
b) Mouvement symétrique des membres	Posture symétrique	3
	Posture asymétrique	2
	Hémiplégie	1
c) Extension du membre antérieur	Symétrique	3
(Saisir la queue et approcher les membres antérieurs du bord de la table ; observer l’extension de la patte avant)	Légèrement asymétrique	2
	Nettement asymétrique	1
	Hémiplégie	0
d) Prise en main et capacité à grimper	Grimpe fortement avec une prise ferme	3
	Déficit unilatéral observé	2
	Incapable de grimper ou de tourner en rond	1
e) Réflexe tactile bilatéral sur le corps	Symétrique des deux côtés	3
	Réponse lente d’un côté	2
	Aucune réponse d’un côté	1
f) Réponse touchante des vibrisses bilatérales	Symétrique	3
	Asymétrique	2
	Pas de réponse	1

Tableau 3 : Score Garcia modifié. Score total : 0–18 points ; des scores plus élevés indiquent une meilleure fonction neurologique.

Discussion

Il est important de préciser que l’objectif principal de cette étude était la standardisation méthodologique plutôt que la découverte biologique. Le développement d’un protocole MCAO standardisé est essentiel pour réduire la variabilité inter-laboratoire et améliorer la reproductibilité dans la recherche sur l’AVC ischémique. Ce protocole améliore la transparence procédurale grâce à des mesures rigoureuses de contrôle qualité et corrige les lacunes techniques courantes dans la modélisation MCAO, notamment l’insertion standardisée des filaments, la régulation de la température et le traitement histologique.

Si la réduction observée du volume d’infarctus de 24 h à 72 h et la récupération neurologique partielle représentent des phénomènes physiopathologiques attendus dans le MCAO transitoire, la contribution de cette étude réside dans l’établissement de la fiabilité temporelle de ces critères d’évaluation à l’aide d’une procédure rigoureusement standardisée. En fournissant un cadre technique détaillé et par étapes, ce protocole garantit que les futures études mécanistes — qu’il s’agisse d’enquêter sur des cascades neuroinflammatoires, des voies apoptotiques ou des interventions thérapeutiques — soient construites sur des données de base reproductibles et comparables. Nous positionnons explicitement ce travail comme une ressource technique cohérente avec le périmètre de JoVE, fournissant une base pour la recherche préclinique standardisée sur l’AVC plutôt que pour faire progresser des connaissances mécanistiques.

Plusieurs étapes de ce protocole sont particulièrement cruciales pour garantir une ischémie et une réperfusion cohérentes. Premièrement, il est essentiel d’avancer précisément la ligne d’occlusion jusqu’à ce qu’une légère résistance soit ressentie pour obtenir un MCAO reproductible, car une légère déviation de la profondeur d’insertion peut entraîner une occlusion incomplète ou une hémorragie sous-arachnoïdienne^20,21. Deuxièmement, maintenir une température corporelle normale stricte pendant l’opération (37 ± 0,5 °C) et une gestion de la température postopératoire sont essentiels, car une température corporelle trop basse ou trop élevée peut modifier significativement la zone de l’infarctus et les résultats^{neurologiques 12,22}. Troisièmement, retirer rapidement le cerveau en moins de 90 s et effectuer un refroidissement par bain de glace peut minimiser l’autolyse et maintenir l’intégrité des tissus, garantissant ainsi la précision de la coloration TTC et de l’analyse de volume²³. Si ces étapes peuvent être mises en œuvre de manière cohérente, elles amélioreront significativement la fidélité et la comparabilité des modèles entre les études.

Nous avons amélioré la méthode traditionnelle MCAO pour en améliorer la reproductibilité et la facilité d’utilisation. L’utilisation de moules à tranches cérébrales pré-refroidies et de protocoles de tranche standardisés a réduit les erreurs humaines et les artefacts de tranche. De plus, l’adoption d’une évaluation de la fonction neurologique à trois échelles (Zea-Longa, Bederson et Garcia modifiée) par deux chercheurs aveugles a accru la robustesse et la sensibilité de l’évaluation^{fonctionnelle} 17,18,19. Grâce à des procédures opérationnelles standard détaillées couvrant chaque étape du programme, il aide à identifier des problèmes courants tels que la mauvaise position du filament, la réperfusion prématurée ou l’hypothermie postopératoire. Les conseils de dépannage pour les complications courantes incluent : (1) Ligne d’occlusion mal placée (entrée PPA), identifiée par l’absence de résistance à 10–12 mm et une amélioration neurologique immédiate — si rencontrée, rétracter immédiatement le filament, faire pivoter la tête de l’animal de 30° vers le côté contralatéral, puis avancer à nouveau avec une légère angulation médiale vers la base crânienne ; (2) Réperfusion prématurée, indiquée par une amélioration neurologique soudaine lors de l’occlusion — s’assurer que le bouchon en silicone est solidement fixé au niveau du moignon ECA, vérifier que le diamètre du filament correspond à la taille de l’artère (0,35–0,40 mm pour les rats de 240 à 270 g), et envisager l’utilisation d’un filament plus long (augmenter le revêtement en silicone de 0,5 mm) si le déplacement persiste ; et (3) hypothermie postopératoire (température rectale <36ºC) — augmenter la température de la bouillotte à 38 °C, placer une lampe chauffante à 30 cm au-dessus de l’animal, et administrer une solution stérile tiède (0,5 mL, intrapéritonéale, 37ºC).

Malgré ces avancées, ce protocole présente plusieurs limitations. Premièrement, la technique nécessite une courbe d’apprentissage substantielle (10 à 15 opérations) pour obtenir des taux de réussite constants, et des variations individuelles dans l’anatomie vasculaire du rat peuvent influencer le placement des^{filaments 21,24}. Deuxièmement, le protocole actuel repose sur une vérification post-hoc (notation neurologique et coloration TTC) plutôt que sur la surveillance intraopératoire du flux sanguin cérébral (LDF ou LSCI), qui limite le contrôle qualité pendant la chirurgie et empêche l’exclusion précoce des animaux présentant une occlusion^{incomplète 25}. Troisièmement, la validation était limitée aux jeunes rats mâles de Sprague-Dawley, restreignant la généralisation aux femelles, aux animaux âgés et aux modèles^{comorbides 26,27}. Les études futures devraient intégrer : (1) les deux sexes pour aborder le sexe comme variable biologique ; (2) rats âgés (12–18 mois) présentant des comorbidités vasculaires ; et (3) la surveillance en temps réel du CBF afin d’améliorer la reproductibilité dans les études d’intervention médicamenteuse.

Cette méthode est particulièrement précieuse dans le dépistage préclinique des médicaments, car la cohérence et la pertinence translationnelle de ses résultats sont d’une importance cruciale. Le protocole standardisé décrit dans cet article présente un grand potentiel pour renforcer la rigueur et la reproductibilité de la recherche sur l’AVC ischémique. Les applications futures de ce protocole incluent : (1) le dépistage préclinique des agents neuroprotecteurs administrés pendant la fenêtre de reperfusion ; (2) études mécanistes de la lésion ischémie-réperfusion en utilisant les points temporels de 24 heures et 72 heures ; (3) l’étude de la neuroplasticité post-AVC et de la récupération fonctionnelle ; et (4) la validation des cibles thérapeutiques en combinaison avec des interventions génétiques ou pharmacologiques. En fournissant une procédure de motivation détaillée et supportée par vidéo, notre objectif est de faciliter l’adoption généralisée de cette méthode dans des laboratoires de divers niveaux professionnels, contribuant ainsi à une recherche préclinique sur l’AVC plus fiable et cliniquement pertinente.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2% TTC staining solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL ready-to-use
Absorbable suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 teeth, 12 cm
Dumont curved forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm length, 0.05 mm fine tip
Feedback heating pad	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0.3 °C closed loop
ImageJ	National Institutes of Health	version 1.53k
Iris scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Curved tip, 10 cm
Micro-vascular clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1.5 cm curved clip
Non-absorbable silk	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Black silk thread
PASS software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	version 15.0	Sample size calculation software
Rat brain matrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm coronal slots
Silicone-coated nylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm silicone tip, EO-sterile
Small-animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isoflurane vaporizer, induction chamber & mask included
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	version 26.0	Statistical analysis software
Vannas micro-scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Curved tip, 8 cm