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Article de recherche

Effets des polysaccharides de Cordyceps sur la sénescence rénale induite par la D-galactase

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DOI :

10.3791/69579

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3 avril 2026

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1First Clinic Medical School, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Renal Division, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Un modèle de sénescence a été établi chez la souris et les cellules HK-2 en utilisant du D-galactose. Les effets des polysaccharides de Cordyceps (CCP) sur le vieillissement rénal ont été évalués à l’aide de western blotting et d’immunofluorescence, les modifications mitochondriales étant évaluées par détection d’espèces réactives de l’oxygène et coloration JC-1.

Résumé

La maladie rénale chronique (MRC) pose un risque important pour la santé mondiale. Le vieillissement des cellules épithéliales tubulaires rénales (RTEC) altère la régénération et la réparation rénales et favorise la progression de la MRC par la libération du phénotype sécréteur associé à la sénescence (SASP). Cordyceps sinensis, dont les principaux constituants bioactifs incluent les polysaccharides de Cordyceps (CCP), est intégré dans de multiples préparations cliniques pour la MRC et a démontré des bénéfices thérapeutiques. Pour examiner le rôle de la PCC dans le vieillissement rénal, un modèle de sénescence rénale induite par le D-galactose a été établi chez la souris, avec la PCC administrée comme intervention. Les résultats du traitement ont été évalués à l’aide de colorations liées à la sénescence et d’évaluations de la fonction rénale. Un modèle de vieillissement induit par le D-galactose dans les cellules HK-2 a été mis en place pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents. La coloration par JC-1 et la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été utilisées pour évaluer les modifications mitochondriales après un traitement par CCP dans des conditions sénescentes. Des immunofluorescences, un western blotting et une PCR quantitative (RT-PCR) ont été réalisés pour évaluer les effets de la CCP sur la phosphorylation de MAPK, la translocation nucléaire NF-κB et l’activation de l’inflammasome NLRP3. Les résultats montrent que la PCC atténue la sénescence des cellules tubulointerstitiales, la lésion rénale et la fibrose, tout en améliorant la fonction mitochondriale dans les modèles cellulaires et animaux de la sénescence induite par le D-galactose. Ces effets sont associés à la modulation de la voie de signalisation ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3.

Introduction

La maladie rénale chronique (MRC) est l’une des maladies rénales les plus courantes et touche une grande partie de la population dans le monde. Sa présence est étroitement liée auvieillissement 1. Les tubules rénaux sont les principales unités fonctionnelles du rein, et la sénescence cellulaire au sein des cellules épithéliales tubulaires rénales (RTEC) est un facteur majeur du déclin fonctionnelrénal 2. L’exposition aux médicaments et d’autres facteurs de stress peuvent induire une sénescence liée au stress tubulaire, entraînant une perte progressive de la fonction rénale et une progression progressive vers la maladie rénale terminale (ESKD). Par conséquent, cibler la sénescence chez les RTEC peut être une stratégie efficace pour retarder le vieillissement rénal et prévenir ou traiter la MRC.

L’inflammation chronique est une caractéristique du vieillissementde 3 ans et un facteur important de nombreuses maladies liées à l’âge. Les cytokines pro-inflammatoires libérées par les cellules sénécentes sont collectivement appelées phénotype sécréteur associé à la sénescence (SASP)4. Le SASP favorise une inflammation soutenue, induit la sénescence dans les cellules voisines et contribue à un déclin fonctionnelprogressif 5. Le modèle de sénescence induit par le D-galactose (D-gal) est l’un des modèles expérimentaux de vieillissement les plus utilisés. Des études antérieures ont montré que le traitement par D-gal conduit à une accumulation intracellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), à un dysfonctionnement mitochondrial, à une perturbation de l’homéostasie redox et à l’induction d’une sénescence cellulaire liée austress 6. Comparé aux modèles naturels de vieillissement, qui sont longs et présentent une grande variabilité interindividuelle, le modèle induit par le D-galactose présente des avantages tels que la simplicité, une induction rapide et une variabilité intra-groupe relativement faible. Ce modèle est applicable aussi bien aux études in vivo qu’in vitro. Bien qu’il ne récapitule pas entièrement le vieillissement naturel lent et sans pathologie, il est bien adapté à la modélisation de la sénescence rénale, compte tenu de la forte activité métabolique du rein et de sa susceptibilité au stress oxydatif. D’un point de vue mécanistique, le D-galactose favorise la sénescence cellulaire principalement par le stress oxydatif, conformément aux recherches portant sur la génération de ROS et le dysfonctionnement mitochondrial au cours du vieillissement.

Cordyceps sinensis est un champignon médicinal traditionnel chinois largement utilisé dans le traitement des maladiesrénales 7. Il contient de multiples composants bioactifs, notamment des polysaccharides, de l’adénosina, des acides aminés, de la cordycépine et de l’ergostérol. Les extraits et préparations fermentées de Cordyceps sinensis présentent des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et anti-âge 8,9,10,11. Par exemple, il a été démontré que les polysaccharides de Cordyceps réduisent l’infiltration inflammatoire dans un modèle murin asthmatique en inhibant la voie de signalisation TGF-β1/Smad 12. De plus, les polysaccharides de Cordyceps peuvent supprimer la phosphorylation des voies MAPK et réduire l’expression de cytokines inflammatoires telles que IL-6 et IL-1β dans les cellules RAW264.713. Des études antérieures ont démontré que Cordyceps polysaccharides (CCP), le principal constituant bioactif de Cordyceps sinensis, peuvent atténuer la sénescence des cellules épithéliales tubulaires rénales en régulant l’autophagie et en supprimant la production de SASP. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels le CCP contrebalance les dommages médiés par les SO restent incomplètement caractérisés.

La présente étude étudie les effets protecteurs du PCC contre le vieillissement rénal chez la souris et examine ses effets sur l’inflammation, le stress oxydatif et la sénescence à l’aide d’un modèle induit par le D-galactose du vieillissement des cellules épithéliales tubulaires rénales. Nous explorons également si la CCP module la production de ROS, la fonction mitochondriale et les voies de signalisation en aval, notamment la phosphorylation de MAPK, la translocation nucléaire NF-κB et l’activation de l’inflammasome NLRP3. Ensemble, ce travail vise à fournir des preuves expérimentales soutenant l’utilisation du PCC dans les études sur la sénescence rénale et les lésions rénales liées à l’âge. Le flux de travail expérimental global et le mécanisme proposé sont résumés à la Figure 1.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine chinoise de Nankin (Approbation éthique n° 202108A006). Tous les déchets générés lors des procédures de culture cellulaire et de coloration étaient collectés dans des contenants scellés et des sacs de bio-danger, puis éliminés par un service agréé de gestion des déchets médicaux.

Modèles animaux et interventions thérapeutiques

Pour minimiser la variation interindividuelle, 40 souris ont été réparties aléatoirement dans cinq groupes (n = 8 par groupe) et soumises aux interventions suivantes : (1) Groupe témoin : administration intragastrique de 0,2 mL de solution saline par souris ; (2) Groupe modèle : A reçu des injections sous-cutanées quotidiennes de D-galactose (250 mg/kg), administrées à 0,2 mL d’une solution de 25 mg/mL par souris ; (3) Groupe CCP à faible dose : Injection de D-galactose combinée à administration intragastrique de CCP à 50 mg/kg (0,2 mL d’une solution de 5 mg/mL par souris) ; (4) Groupe CCP à haute dose : Injection de D-galactose combinée à une administration intragastrique de CCP à 100 mg/kg (0,2 mL d’une solution de 10 mg/mL par souris) ; (5) Groupe vitamine E : A reçu des injections de D-galactose combinées à une administration intragastrique de vitamine E à 100 mg/kg (0,2 mL d’une solution de 10 mg/mL par souris). Après 8 semaines de traitement, les souris ont été euthanasiées, et des échantillons de sérum, d’urine et de tissu rénal ont été prélevés pour des analyses ultérieures.

Analyse de la fonction rénale

La fonction rénale a été évaluée à l’aide de kits de test commerciaux pour mesurer la créatinine, l’acide urique et les protéines urinaires selon les instructions du fabricant. Les valeurs d’absorbance ont été mesurées à 505 nm pour la créatinine, 510 nm pour l’acide urique et 585 nm pour la protéine urinaire à l’aide d’un lecteur multifonction de microplaques.

Coloration par coupe de tissu

Les tissus rénaux enfouis en paraffine ont été sectionnés à une épaisseur de 4 μm. Les sections ont été déparaffinées, incubées avec de l’hématoxyline pendant 5 minutes, rincées à l’eau courante, différenciées à l’aide d’alcool acide à 1 % pendant 5 secondes, puis rincées à nouveau. Après un lavage de 1 minute avec une solution physiologique phosphatée tamponnée (PBS), les sections ont été contre-colorées à l’éosine pendant 3 minutes, déshydratées puis montées. Pour la coloration trichrome de Masson, les sections ont été déparaffinées et colorées à l’hématoxyline comme décrit ci-dessus, suivies de Ponceau S pendant 5 minutes et de bleu aniline pendant 5 minutes. Les sections ont ensuite été déshydratées et montées.

Essai de viabilité cellulaire

Les cellules HK-2 ont été ensemencées en plaques à 12 puits à 1 × 10⁵ cellules par puits. Après une exposition de 24 heures au D-galactose et aux polysaccharides de Cordyceps, une solution de 10 % de CCK-8 a été ajoutée à chaquepuits 14. Après incubation à 37 °C pendant 30 minutes, l’absorbance a été enregistrée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. La documentation de contrôle qualité des polysaccharides de Cordyceps et l’authentification STR des cellules HK-2 sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1.

Réaction en chaîne quantitative par polymérase par transcription inverse

Après 24 heures de culture cellulaire, le milieu de culture a été retiré, et l’ARN total a été extrait à l’aide du réactif d’extraction. La concentration d’ARN a été déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques, et l’intégrité de l’ARN a été vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %. L’ADN génomique a été retiré, et l’ADNc a été synthétisé par transcription inversée. Les séquences d’amorces sont listées dans le tableau des matériaux.

Mesure des niveaux de ROS intracellulaires

Les cellules HK-2 ont été ensemencées en plaques à 12 puits à 1 × 10⁵ cellules par puits. À une confluence de 60-70 %, les cellules ont suivi un prétraitement au D-galactose pendant 12 heures. Après 24 heures d’exposition au médicament, le milieu a été éliminé et les cellules ont été rincées une fois avec du PBS. L’opération ROS intracellulaire a été détectée par incubation avec une sonde fluorescente sensible à la ROS à 37 °C pendant 20 minutes, et des images de fluorescence ont été capturées à des longueurs d’onde excitation/émission de 488/525nm 15.

Tache occidentale

Les protéines cellulaires ont été lysées à l’aide d’un tampon RIPA et clarifiées par centrifugation à 13 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Les protéines ont été dénaturées par ébullition pendant 10 minutes, et des quantités égales de protéines (20 μg par échantillon) ont été soumises à une séparation électrophorétique et transférées dans les membranes PVDF. Après un blocage d’une heure, les membranes ont été incubées toute la nuit avec des anticorps primaires. Les lavages PBST suivants ont été suivis d’une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à HRP, et la détection a été réalisée à l’aide d’un substrat à chimiluminescence améliorée (ECL) 16. Les détails des anticorps et les identifiants des réactifs sont listés dans le tableau des matériaux.

Coloration par sénescence SA-β-gal

Les cellules HK-2 étaient placées en plaques à 12 puits à une densité de 1 × 10⁵ cellules par puits. Lorsque les cellules atteignaient une confluence de 60-70 %, elles étaient prétraitées avec du D-galactose pendant 12 heures. La coloration SA-β-gal a été réalisée selon le protocole du fabricant, et les cellules colorées ont été observées au microscopeoptique 17.

Mesure du potentiel de la membrane mitochondriale

Le potentiel de la membrane mitochondriale a été évalué à l’aide de la sonde fluorescente JC-1 conformément aux instructions du fournisseur. Les monomères JC-1 ont été détectés à des longueurs d’onde excitation/émission de 490/530 nm, tandis que les agrégats JC-1 ont été détectés à 525/590 nm. Les images étaient acquises lorsque des signaux clairs de fluorescence rouge ou vert étaient observés.

Analyse statistique

Les données étaient présentées sous forme de diagrammes en barres ou de points et analysées à l’aide du logiciel référencé. Les intensités des bandes Western Blot ont été quantifiées à l’aide d’ImageJ. Les données ont été analysées par analyse de variance (ANOVA) avec des tests t ultérieurs pour des comparaisons entre groupes. La signification statistique a été définie comme une valeur P < 0,05. Les symboles indiquent des comparaisons avec le groupe témoin (*) ou le groupe D-gal (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

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Résultats

Le D-galactose a été utilisé pour établir un modèle de sénescence chez la souris, la vitamine E servant de contrôle positif anti-sénescence couramment utilisé. Les souris sénescentes ont été traitées avec différentes doses de Cordyceps polysaccharides (CCP). Les souris âgées présentaient une insuffisance rénale significative, comme en témoignent une augmentation des protéines urinaires, de l’acide urique sérique et des niveaux de créatinine (Figure 2B-D).

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Discussion

Cette étude démontre les effets protecteurs des polysaccharides de Cordyceps sur les cellules épithéliales tubulaires rénales et fournit des preuves qu’ils atténuent la sénescence inflammatoire des cellules HK-2 en modulant la voie de signalisation ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3. Ces résultats clarifient également les mécanismes potentiels sous-jacents aux effets des composés dérivés de Cordyceps sinensis dans le traitement des maladies rénales aiguës et c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n°8217150545, 82575032).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Casepase1/PAb du lapin fenduWL03450Wanlei, Shengyang, Chine
CCK-8 KitC0037Biyotime, Shanghai, Chine
PCCB21296Yuanye Bio, Shengyang, Chine
Kit de test de créatinineC011-2-1Jiancheng, Nankin, Chine
D-gal  ; HY-N0210MCE, États-Unis
ERK Rabbit pAb4695CST, États-UnisAB_390779
gapdh Rabbit pAbAC033Abclonal, Wuhan, Chine
H & Kit de coloration EG1120Solarbio, Pékin, Chine
JC-1 Kit  ; C2003SBiyotime, Shanghai, Chine
Kit de teinture MassonG1340Solarbio, Pékin, Chine
NLRP3 Rabbit pAbWLH3383Wanlei, Shengyang, Chine
P21 Rabbit pAb64016sCST, États-UnisAB_2892063
p38 PAb de lapin9212CST, États-UnisAB_330713
p50 Rabbit pAb3035CST, États-UnisAB_330564
p65 Rabbit pAb8242CST, États-UnisAB_10859369
p-ERK Rabbit pAb4370CST, États-UnisAB_2315112
Phospho-SAPK/JNK mAnticorps4668CST, États-UnisAB_823588
p-p38 Rabbit pAb4511CST, États-UnisAB_2139682
Kit de teinture ROSS0033SBiyotime, Shanghai, Chine
Anticorps SAPK/JNK9256CST, États-UnisAB_2250373
SA-β-gal KitC0602Biyotime, Shanghai, Chine
Kit de test d’acide uriqueC012-2-1Jiancheng, Nankin, Chine
Kit de détection des protéines urinairesC035-2-1Jiancheng, Nankin, Chine
Vitamine ES27812Yuanye Bio, Shengyang, Chine
< fort>Primer pour PCR
Nom du gèneAmorce avantAmorce inversé
Caspase-15'-TACAGAAGGGTGCTGAACAA-3'5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
GAPDH5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'5'-AAAGGTGGAGGGGGGTGTCG-3'
NLRP35'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'

Références

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