Une plateforme de prise en charge pour la détection simultanée par PCR triplex des infections au chikungunya, à la dengue et au virus Zika

Résumé

Cet article recommande un système intégré entièrement automatisé utilisant la triple technologie PCR pour diagnostiquer simultanément les co-infections du Chikungunya, de la dengue et du virus Zika à partir d’un seul échantillon, optimisant ainsi l’efficacité des tests dans les laboratoires cliniques et de soins primaires.

Résumé

La fièvre chikungunya (CHIKF), une maladie virale aiguë transmise par les moustiques et découverte pour la première fois en Tanzanie en 1952, a montré une propagation intermittente en Chine, avec une augmentation des épidémies locales. En juillet 2025, la province du Guangdong, actuellement centre de l’épidémie, avait signalé 4 824 cas locaux, dont près de 3 000 nouvelles infections en une seule semaine. Cette hausse rapide crée un besoin urgent de technologies de diagnostic avancées. De tels outils sont essentiels pour soutenir les efforts de confinement en première ligne. Nous proposons une solution pour la détection rapide et simultanée des infections à la dengue (DENV), au chikungunya (CHIKV) et au virus Zika (ZIKV) afin de renforcer les capacités précoces de prévention et de contrôle des épidémies. Cette approche consiste à développer des protocoles de dépistage personnalisés pour les points de contrôle frontaliers et les établissements de soins primaires.

Les méthodes diagnostiques traditionnelles pour le CHIKV et le DENV manquent souvent de sensibilité ou de spécificité dans les cas de coinfection. Puisque le CHIKV, le DV et le ZIKV partagent des schémas et symptômes de transmission similaires, la surveillance simultanée est cruciale. Ce protocole présente une méthode triplex qPCR utilisant des sondes TaqMan pour détecter ces arbovirus dans un seul tube en moins de 90 minutes. Comparée aux tests de culture virale et sérologiques, cette méthode améliore l’efficacité en identifiant les infections actives et les coinfections avec une grande spécificité, tout en simplifiant le flux de travail et en éliminant les besoins en équipements spécialisés.

La validation avec des échantillons cliniques et d’évaluation de qualité externe (EQA) a confirmé une concordance de 100 % avec les tests singleplex de référence absolue. Cette méthode constitue un outil efficace pour surveiller les maladies fébriles dans les régions endémiques, en particulier dans des contextes à ressources limitées où le confinement rapide des épidémies est crucial.

Introduction

La fièvre chikungunya (CHIKF) est une maladie arbovirale de plus en plus répandue principalement transmise par les moustiques vecteurs Aedes aegypti et Aedes albopictus. Caractérisée par des épidémies récurrentes dans les régions tropicales, cette maladie se manifeste cliniquement par une affection fébrile aiguë, souvent accompagnée de douleurs articulaires sévères et d’arthrite^{persistante 1}. Au 26 juillet, le total cumulé des cas de chikungunya confirmés en laboratoire dans la ville de Foshan avait atteint 4 824, avec un remarquable 87,2 % de ces cas survenant dans le district de Shunde. Cette concentration géographique marquée impose un fardeau important aux infrastructures régionales de santé publique et entraîne des coûts importants en matière de santé, ainsi que des défis macroéconomiques plus^{larges 2}.

Dans le contexte de la circulation de plus en plus chevauchante des virus CHIKV, DEV et ZIKV, les méthodologies diagnostiques actuelles rencontrent trois limites principales. Premièrement, les tests sérologiques ne permettent pas de distinguer les infections aiguës en raison de la persistance prolongée des anticorps après l’élimination^{virale 1}. Deuxièmement, les techniques de culture virale présentent des taux de sensibilité faibles et nécessitent plusieurs jours, ce qui entrave la prise de décision clinique en temps voulu. Troisièmement, bien que les tests quantitatifs PCR démontrent une forte spécificité (dépassant 95 %), ils ne peuvent pas détecter les co-infections au sein d’une seule réaction, ce qui constitue un inconvénient important étant donné le taux de co-infection CHIKV-DENV rapporté de 12,8 % en^{Inde 3}. La surveillance phylogénétique indique un changement de paradigme. La lignée ECSA, dominante lors de l’épidémie indienne de 2019-2022, a acquis des mutations convergentes dans ses protéines enveloppantes : E1-A226V (augmentant l’infectiosité des moustiques) et E2-K252Q (associée à l’évasion immunitaire). Ces mutations ont donné naissance à un génotype avec une virulence plus élevée documentée, comme l’ont rapporté des études de surveillance récentes au Kerala et au^{Maharashtra 3}. Parallèlement, la Chine fait face à des défis liés à l’importation du génotype ECSA, documenté lors de l’épidémie du Yunnan, et à d’autres génotypes, avec une transmission autochtone signalée dans plusieurs provinces, dont le^{Yunnan 4}.

Ces réalités créent des besoins urgents et limités en ressources pour (i) le diagnostic différentiel malgré des manifestations cliniques^{chevauchantes 5}, (ii) des tests diagnostiques qui éliminent la complexité des instruments généralement requises par la PCR quantitative en temps réel (qPCR)⁶, et (iii) une validation complète de nouvelles technologies de point de soins, y compris les méthodes RT-LAMP et^{CRISPR 5}. Pour relever ces défis diagnostiques, nous proposons un test rapide triple PCR utilisant un système intégré entièrement automatisé, permettant la détection simultanée du CHIKV, du DAV et du ZIKV en une seule réaction. Nous avons validé la performance de notre test triplex qPCR par comparaison directe avec les tests singleplex^{établis 5}, qui servaient de référence standard. Les sections suivantes détaillent les procédures à la fois pour le test triplex et pour les tests singleplex de référence. L’analyse comparative des résultats des deux méthodes est présentée dans la section Résultats représentatifs.

Protocole

Cette étude respecte les directives éthiques établies par le Comité d’éthique de l’Hôpital populaire provincial du Guangdong, Université médicale du Sud, Guangzhou, Chine (n° d’approbation : KY2025-510-01). Des informations détaillées concernant les matériaux utilisés dans cette recherche (réactifs, produits chimiques, équipements et logiciels) se trouvent dans le Tableau des matériaux.

1. Sélection des participants

1. Choisissez des participants âgés de 18 à 60 ans.
2. Choisissez les participants présentant une maladie fébrile aiguë (T axillaire ≥ 38 °C) dans les 12 jours suivant l’apparition des symptômes, ainsi qu’une éruption cutanée, une arthralgie ou une lymphadénopathie cervicale, et un voyage récent dans des zones endémiques de chikungunya ; ou des individus asymptomatiques avec un historique de voyage identique.
3. Exclusion : utilisation d’antimicrobien/antiviral dans les 7 jours ou maladie fébrile attribuable à un VIH confirmé ou à une malignité.

2. Collecte et traitement des échantillons

1. Vérifiez que l’emballage extérieur de la boîte d’échantillonnage n’est pas endommagé et n’est pas périmé, puis retirez les matériaux internes.
2. Positionnez le sujet avec le bras tendu. Identifiez la veine cubitale médiane, appliquez un garrot, et désinfectez le site de la ponction venébrale avec un écouvillon d’alcool à 70 %.
3. Prélever 1~3 mL de sang de la veine antécubitale du sujet à l’aide d’un tube de collecte sanguine sans anticoagulant.
4. Inversez doucement le tube 5 à 8 fois et laissez-le coaguler à température ambiante pendant 30 minutes.
5. Centrifugez l’échantillon sanguin à 4 °C, 1000 x g sur une centrifugeuse, pendant 10 minutes. L’échantillon sérique obtenu après centrifugation peut être testé immédiatement.
6. Alignez soigneusement le sérum surnageant dans des tubes microcentrifuges stériles. Utilisez immédiatement le sérum pour les analyses, ou conservez les aliquotes à -80 °C jusqu’à une analyse supplémentaire des acides nucléiques pathogènes via qPCR.

3. Détection automatisée triplex qPCR de CHIKV, DAV et ZIKV

1. Préparation du réactif et du tube
   1. Récupérez tous les réactifs nécessaires du stockage et décongelez-les à température ambiante.
   2. Inspectez visuellement chaque tube de détection de TD scellé pour détecter des dommages ou une défaillance du joint. Jetez les tubes compromis.
   3. Faites brièvement un vortex sur le tampon d’extraction des acides nucléiques TD pendant 5 secondes pour assurer l’homogénéité.
   4. Distribuez aseptiquement 500 μL du tampon homogénéisé dans un tube réactif d’extraction TD (contenant des billes magnétiques lyophilisées violettes).
   5. Faites vibrer vigoureusement le mélange pendant 30 secondes jusqu’à ce que tous les composants soient complètement dissous et que les billes soient complètement resuspendues.
   6. Transférez toute la solution reconstituée dans un tube de détection TD pré-étiqueté.
2. Chargement d’échantillons
   1. Pipeter 200 μL de sérum clair, non hémolysé et non lipémique dans le tube de détection TD préparé.
   2. Scellez le tube solidement et inversez-le dix fois pour mélanger de façon homogène.
      REMARQUE : Lors de l’inversion, laissez la couche de paraffine flotter brièvement à l’intérieur du tube. C’est une partie normale du processus.
3. Exploitation des instruments et acquisition de données
   1. Insérez les tubes de détection scellés dans les emplacements désignés de l’analyseur.
   2. Sur l’interface tactile, saisissez les informations d’identification de l’exemple.
   3. Appuyez surDétection de tartes S pour lancer le flux de travail entièrement automatisé à tube fermé.
      REMARQUE : Le système effectuera automatiquement la numérisation des codes-barres, l’extraction d’acides nucléiques via la capture magnétique de billes et l’amplification par PCR par fluorescence sans intervention supplémentaire de l’utilisateur. Le programme standard comprend une étape de dénaturation à 95 °C pendant 3 minutes, suivie de 40 cycles d’amplification.
4. Interprétation des résultats
   1. À la fin de la séquence, observez les résultats d’amplification des trois cibles (CHIKV, DENV, ZIKV) et du contrôle interne sur le même écran.
   2. Enregistrez l’affichage généré automatiquement, « Positif », « Négatif » ou « Invalide », pour chaque pathogène cible dans son canal de fluorescence respectif.
      REMARQUE : Le logiciel interne du système utilise un seuil de cycle (Ct) de 37,0 pour l’interprétation automatique. Aucune analyse manuelle des données n’est requise.

4. Référence aux essais Singleplex qPCR pour la comparaison des méthodes

1. Préparation des réactifs d’extraction des acides nucléiques
   1. Retirez la plaque préemballée à 96 trous du kit. Tapotez doucement la plaque à 96 puits pour que les réactifs et les billes magnétiques se concentrent tous au fond de la plaque à 96 puits. Arrachez soigneusement le film d’étanchéité en aluminium en évitant les vibrations de la plaque à 96 puits pour éviter que le liquide ne s’échappe.
   2. Dans les colonnes 1 et 7 d’une plaque à 96 puits, on ajoute d’abord 20 μL de protéinase K, suivis de 200~300 μL de l’échantillon à extraire.
   3. Extraction automatisée des acides nucléiques (méthode à base de billes magnétiques)
      1. Des plaques préemballées à 96 puits (avec échantillons) sont placées dans les emplacements correspondants du système automatisé d’extraction d’acides nucléiques.
      2. Le processus d’extraction de l’acide nucléique est le suivant : Adsorber les billes magnétiques liées à l’acide nucléique à l’aide d’une tige magnétique à l’intérieur de la chambre de laboratoire. Transférez le complexe de billes dans le trou de réactif désigné suivant. Activez le dispositif de remuage pour mélanger soigneusement le liquide avec les billes magnétiques en remuant rapidement et à plusieurs reprises. Laissez l’extracteur automatisé d’acides nucléiques effectuer automatiquement les étapes suivantes : i) Lyse cellulaire : 10 minutes à 25 °C. ii) Adsorption des acides nucléiques : 15 minutes à 70 °C, avec adsorption magnétique effectuée 3 fois. iii) Lavage : mélanger pendant 2 minutes (répété 3 fois), suivi d’une adsorption magnétique deux fois (15 s chacun). iv) Élution : Effectuer deux fois (5 minutes chacun), avec une adsorption magnétique effectuée 3 fois. Finalement, on obtient des acides nucléiques de haute pureté.
   4. Pour une détection immédiate, aspirez directement l’éluat contenant l’acide nucléique des colonnes 6 et 12. Pour un stockage à long terme, transférez les échantillons d’acides nucléiques restants à -20°C.
2. Préparation des réactifs d’amplification
   REMARQUE : Pour une réaction PCR Singleplex, préparez trois tubes PCR séparés utilisant trois enzymes différentes et trois mélanges de réactions correspondants. Terminez la préparation du réactif en trois étapes distinctes. Comme les étapes de préparation sont similaires, nous ne démontrerons que les étapes de préparation pour le réactif de détection du CHIKV ci-dessous.
   1. Retirez la solution de réaction d’amplification des acides nucléiques et la solution de réaction CHIKV (amorces/sondes spécifiques au CHIKV) du kit. Après dégel, placez-les dans un environnement à 22~25 °C, mélangez soigneusement en secouant vigoureusement, puis effectuez une courte centrifugation (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Calculer le nombre total de réactions comme N + 2 (où N = nombre d’échantillons testés, +2 = un contrôle qualité négatif et un contrôle qualité positif). Préparez le Master Mix dans un tube microcentrifuge de taille appropriée en combinant les éléments suivants pour chaque réaction : solution de réaction d’amplification d’acide nucléique de 17 μL (contenant tampon, dNTP, ADN polymérase, enzyme UDG), solution de réaction CHIKV de 3 μL (contenant des amorces, sondes pour les gènes cibles CHIKV, et IC). Manipulez soigneusement le Master Mix pour garantir un mixage complet. Centrifugez brièvement le tube à 10 000 x g pendant 15 s à température ambiante (22~25 °C) pour recueillir la solution au fond. Injectez 20 μL de Master Mix dans chaque tube de réaction PCR.
   3. Ajouter des échantillons d’acide nucléique et de contrôle qualité : dans les tubes de réaction PCR préparés ci-dessus (20 μL), ajouter respectivement 5 μL d’acide nucléique provenant d’échantillons testés, contrôle positif et contrôle négatif, pour obtenir un volume final de 25 μL par tube ; Bouchons fermement les tubes et effectuez une centrifugation instantanée (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C) puis placez les tubes dans l’instrument PCR.
3. Amplification PCR
   1. Définir le programme de cyclage comme suit : pré-dénaturation : 50 °C pendant 15 minutes, puis à 95 °C pendant 15 minutes (les deux étapes ensemble constituent un cycle) ; les deux étapes suivantes pour 40 cycles : dénaturation à 94 °C pour 15 s et recuit à 55 °C pour 45 s.
   2. Définir les paramètres de détection du signal de fluorescence comme suit : marquage fluorescent FAM des gènes CHIKV ; Marquage fluorescent VIC du gène IC utilisé comme contrôle interne du kit. Collectez les données à 55 °C. À l’issue de la réaction, assurez-vous que les données sont conservées pour une analyse ultérieure.
   3. Analyser les données à l’aide d’un logiciel spécifique au qPCR
      1. Informations sur l’exemple : Dans le schéma de disposition des plaques de puits du logiciel, identifiez les types d’échantillons (par exemple, contrôle positif, contrôle négatif, échantillon inconnu, gène de référence interne, etc.) correspondant aux positions de charge de l’échantillon.
      2. Placement des tubes de réaction : Ouvrez le couvercle du module de chauffage de l’instrument, placez la plaque/les tubes PCR scellés à l’intérieur, assurez-vous qu’ils s’ajustent bien au module de chauffage, et refermez le couvercle du module hermétiquement (pour éviter les inégalités de température)
      3. Démarrage de la réaction : Après avoir confirmé que les paramètres du programme dans le logiciel sont corrects, cliquez sur Démarrer et enregistrez l’ID de l’expérience pour référence future.
      4. Arrêt de la course et retrait des tubes : Une fois le programme terminé, attendez que la température du module de chauffage descende en dessous de 50 °C. Ensuite, ouvrez le couvercle et retirez soigneusement la plaque ou les tubes PCR. Procéder à l’analyse en aval ou au stockage des échantillons selon les besoins.
      5. Analyse des données Avant de procéder à l’analyse, confirmez que : i) Les courbes d’amplification pour tous les échantillons et le contrôle interne sont typiquement en forme de S ; ii) Le seuil de fluorescence est fixé dans la phase exponentielle, donnant des valeurs de Ct ≤ 38 cycles (CV < 5 %) ; iii) Les résultats de contrôle sont valides, indiquant l’absence de contamination. Si une condition n’est pas remplie ou si un échantillon présente une amplification anormale (par exemple, une courbe atypique ou un CT à plage critique), vérifiez à nouveau l’ensemble du lot ou l’échantillon spécifique en conséquence.
      6. Traiter les données brutes avec le logiciel pour déterminer les valeurs de Ct en utilisant le seuil auto-sélectionné ; un échantillon est considéré comme positif si Ct < 38 et que sa courbe d’amplification présente une forme sigmoïde.

5. Biosécurité et élimination des déchets

1. Transférer tous les matériaux dans un contenant désigné, résistant aux perforations, et décontaminer par autoclavage avant l’élimination finale via le système institutionnel de déchets médicaux. Transférez immédiatement ces matériaux dans un contenant biohazard étanche, résistant aux perforations, marqué pour les déchets à haut risque. Conformément aux directives institutionnelles, décontaminez tous les déchets contenant des produits amplifiés par autoclaving (par exemple, 121 °C pendant 30 minutes) pour inactiver les agents pathogènes et dégrader les acides nucléiques. Enfin, éliminez les déchets stérilisés via le système de gestion des déchets médicaux désigné.
   REMARQUE : Effectuer toutes les étapes conformément aux pratiques de biosécurité de niveau 2 (BSL-2), en utilisant des équipements de protection individuelle appropriés pour minimiser les risques d’exposition.

Résultats

Pour valider la stabilité et la précision du système de détection triple PCR, nous avons sélectionné cinq échantillons cliniquement représentatifs de notre laboratoire interne et dix échantillons externes à l’aveugle EQA pour vérification. Ces cinq échantillons cliniques représentatifs comprennent à la fois des cas négatifs et positifs (S1-S5), incluant des échantillons positifs pour le CHIKV et le DENV, sélectionnés pour démontrer l’applicabilité clinique du test et soutenir la validation interne de la performance du te...

Discussion

Le CHIKV est un virus à ARN simple brin à sens positif, classé dans le genre alphavirus de la famille^{des Togaviridae 7}. L’accélération du réchauffement climatique, l’intensification du commerce international et l’expansion des réseaux touristiques ont collectivement accru le risque d’exposition humaine aux menaces^arbovirales. Au cours de la dernière décennie, l’évolution rapide du diagnostic moléculaire a fondamentalement transformé le pays...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extracteur automatisé d’acides nucléiques	DAAN	Smart 32	Pour l’extraction d’ADN
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	Pour  ; centrifugation sérique & nbsp ;
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Armoire de biosécurité
Centrifugeuse électronique	WEALTEC		Centrifugez le liquide résiduel hors de la paroi du tube
Analyseur PCR médical entièrement automatique	Bioustar&zwnj ;   ;	UP0102	Amplification quantitative par PCR fluorescente
Kit de détection d’acides nucléiques pour le virus chikungunya (méthode de la sonde PCR-fluorescente)	DAAN  ;	20250804	Détection de   ; Gènes du virus chikungunya
Kit de détection d’acides nucléiques pour le virus de la dengue (méthode de la sonde PCR-fluorescente)	DAAN  ;	202504003	Détection de   ; Gènes du virus de la dengue
Kit de détection d’acides nucléiques pour le virus de la dengue, le virus Zika et le virus chikungunya (méthode de sonde PCR-fluorescente)	Bioustar&zwnj ;   ;	20250724	Détection de   ; Gènes du virus de la dengue, du virus Zika et du virus chikungunya
Kit de détection d’acides nucléiques pour le virus Zika (méthode de sonde PCR-fluorescente)	DAAN  ;	202508041	Détection du virus Zika & nbsp ; Gènes
Kit d’extraction d’acides nucléiques	DAAN		Extraire l’acide nucléique
SLAN Système d’analyse médicale PCR entièrement automatique	HONGSHI		Analyse des données
Machine PCR en temps réel SLAN-96S	HONGSHI	SLAN-96S	Amplification quantitative par PCR fluorescente
Congélateurs ultra-basse température (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 & degrés C pour stocker les réactifs
Vortex-5	Kylin-bell		Pour le réactif de mélange