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Isolement des cellules épithéliales alvéolaires de type II provenant de poumons murinaux néonatals, juvéniles et adultes adaptés aux contextes expérimentaux infectieux

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DOI :

10.3791/69581

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19 décembre 2025

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole propose une méthode basée sur la cytométrie en flux pour isoler les cellules épithéliales alvéolaires de type II (AECII) viables à partir de poumons nouveau-néonaux, juvéniles ou adultes murins (infectés ou non). Cette approche permet d’étudier en aval des études moléculaires et/ou fonctionnelles de l’AECII pour identifier leur rôle lors de l’inflammation et des infections pulmonaires.

Résumé

Les cellules épithéliales alvéolaires de type II (AECII) contribuent de manière critique à la régulation immunitaire pulmonaire et sont donc des éléments clés orchestrant l’homéostasie pulmonaire. Ces fonctions rendent l’AECII particulièrement pertinente dans le contexte des infections par des virus respiratoires, qui ciblent l’épithélium inférieur des voies respiratoires et perturbent l’intégrité alvéolaire. Les modèles murins précliniques sont des outils essentiels pour élucider les rôles de l’AECII dans le contexte de l’inflammation et/ou des infections pulmonaires. Ce protocole présente un pipeline détaillé et reproductible pour isoler des AECII viables et hautement purifiés des poumons murins aux stades néonatal, juvénile et adulte. La méthodologie combine dissociation mécanique, digestion enzymatique et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour produire des populations AECII hautement enrichies, prouvées adaptées aux analyses moléculaires et fonctionnelles en aval. Pour les applications impliquant des virus pathogènes, le protocole inclut une étape optionnelle de fixation du paraformodéhyde (PFA), permettant une manipulation sûre dans des conditions de biosécurité plus faibles sans compromettre l’intégrité de l’ARN. Avec une récupération cellulaire optimisée à travers les stades de développement, obtenant jusqu’à 1,0 × 106 cellules AECII par poumon adulte, ce protocole soutient des études précliniques, par exemple, de la pathogenèse virale, de la fonction épithéliale et de la capacité régénérative.

Introduction

En raison de leurs multiples rôles dans le développement pulmonaire, la physiologie, l’immunité et les processus de réparation, les cellules épithéliales alvéolaires de type II (AECII) contribuent de manière vitale au maintien ainsi qu’au rétablissement de l’homéostasie après une lésion pulmonaire. Comme les AECII sont des cibles cellulaires principales de virus pandémiques tels que le virus de la grippe A (IAV) ou le SARS-CoV-2, leur sort et leurs fonctions ont été au centre de la recherche en biologie des infections. Dans ce contexte, des études antérieures ont indiqué que les indices intrinsèques (par exemple, statut génétique1,âge 2,3) ainsi qu’extrinsèques (par exemple, stimulimicrobiens 4) ont un impact majeur sur les phénotypes AECII et leur réactivité aux déclencheurs environnementaux tels que les agents pathogènes aéroportés. Notamment, l’inflammation pulmonaire a montré qu’elle laisse des changements durables dans le statut transcriptomique, protéomique et épigénétique de l’AECII 5,6. Les interactions cellulaires complexes de l’AECII au sein du poumon, ainsi que la contribution de divers facteurs biotiques et abiotiques à la biologie de l’AECII, soulignent l’importance de modèles in vivo adaptés permettant d’examiner ces cellules plus en détail.

Le FACS représente la technique actuelle de référence pour l’enrichissement et la purification des cellules primaires issues de tissus humains et animaux, car il permet la mise en œuvre simultanée de la sélection (ou exclusion) multiparamétrique et représente la seule méthode dans laquelle les propriétés intrinsèques des cellules telles que la taille, la granularité ou l’autofluorescence peuvent être intégrées de manière fiable dans le flux de travail de sélection/exclusion. À ce jour, quelques protocoles publiés proposent des méthodologies pour l’isolation basée sur FACS des AECII murins primaires. Sinha et Lowell ont rapporté une méthode d’isolement d’AECII à partir de souris adultes présentant un traitement tissulaire et un flux de travail similaire en cytométrie en flux, incluant l’enrichissement de l’AECII avant la FACS par épuisement magnétique par billes sur les cellulesnon cibles 7. Un autre protocole décrit l’utilisation de l’isolation à base de billes magnétiques des cellules pulmonaires EpCAM positives ou l’utilisation de souris transgéniques permettant l’isolement FACS de l’AECII basé sur l’identification de cellules SPC-positives (GFP+) à l’aide d’unmodèle 8 de souris rapporteur conditionnel. Bien que l’expression du SPC identifie de manière fiable l’AECII dans les poumons murins, cette méthodologie n’est applicable qu’en combinaison avec une souche de souris référente dédiée et exclut ainsi l’isolement de l’AECII, par exemple, de souris de type sauvage. Il est important de noter que, bien que des rendements et une pureté similaires de l’AECII aient été rapportés, aucun de ces protocoles n’a permis d’adapter l’isolement de l’AECII à partir d’hôtes néonatals, juvéniles ou infectés.

À cette fin, le protocole actuel inclut un ensemble de flux de travail adaptés pour l’isolement d’AECII hautement purs et viables à partir de souris utilisant la digestion enzymatique combinée à FACS. Cette méthodologie de pointe repose sur un protocole d’isolationAECII 9 déjà développé sur FACS et contient des améliorations importantes qui améliorent la pureté de l’AECII grâce à l’ajout de marqueurs d’identification et d’exclusion supplémentaires. Il est important de noter que ce protocole mis à jour propose la récupération AECII via des stratégies de tri « touchées » et « non touchées ». De plus, comme le développement pulmonaire postnatal est associé à des changements majeurs concernant la composition cellulaire et la réorganisation structurelle, ce protocole inclut des adaptations pour optimiser la récupération de l’AECII dans les poumons néonatals, juvéniles et adultes. Cela permet d’examiner la biologie de l’AECII lors de l’ontogenèse, par exemple dans le contexte de la maturation pulmonaire ou des études de biologie des infections. Cette approche peut être utilisée pour obtenir un AECII viable pour une culture ex vivo ultérieure et une infection par IAV. De plus, ce protocole comprend une procédure de fixation utilisant le fixateur chimique paraformaldéhyde (PFA). Cette étape nécessite l’inactivation de divers agents pathogènes respiratoires (par exemple, SARS-CoV-2, IAV) dans les suspensions cellulaires pulmonaires, ce qui permet à son tour une manipulation ultérieure des échantillons (y compris l’isolement AECII basé sur FACS) dans des installations avec moins de précautions de bioconfinement. Bien que la fixation basée sur le PFA empêche la culture ex vivo ultérieure de l’AECII pour des études fonctionnelles, elle permet la récupération de quantités significatives d’ARN intact pour le profilage transcriptomique de l’AECII afin d’élucider leur rôle biologique dans le contexte des infections respiratoires.

Protocole

Tous les animaux ont été élevés et hébergés dans l’installation vétérinaire du Centre Helmholtz pour la recherche sur les infections dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes (FPS) et conformément aux directives nationales et institutionnelles. L’euthanasie de souris naïves pour l’isolement ultérieur de l’AECII a été réalisée conformément aux directives nationales de la Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Des souris mâles avec un background génétique C57BL/6 à l’âge de 2 jours (néonatal), 3 semaines (juvénile) ou 8-12 semaines (adulte) ont été utilisées. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation du poumon de souris

  1. Sacrifier la souris (suivant les protocoles approuvés par l’institution) :
    1. Pour les souris adultes et juvéniles : administrer une surdose d’anesthésie (par exemple, kétamine/xylazine) par injection intrapéritonéale.
    2. Pour les souris nouveau-nées : décapiter.
      REMARQUE : Évitez la luxation cervicale chez les souris adultes et juvéniles car cette procédure peut endommager la trachée.
  2. Stériliser le pelage de souris avec 70 % (v/v) d’éthanol.
    ATTENTION : Liquide inflammable. Irritant oculaire. Évitez la chaleur. Gardez le récipient bien fermé et faites une incision ventrale de la ligne médiane pour exposer les organes internes.
  3. Retirez soigneusement la peau et le péritoine.
  4. Exsanglez la souris en coupant les veines jugulaires et la veine cave, permettant ainsi au sang de s’écouler du corps.
  5. Retirez soigneusement le diaphragme pour exposer le cœur et les poumons.
    REMARQUE : Faites attention à ne pas blesser les poumons. La perforation du tissu pulmonaire entraverait considérablement l’efficacité de la digestion ultérieure médiée par enzymes du tissu pulmonaire.
  6. Ouvre la cage thoracique avec des ciseaux.
  7. Insérez une canule dans le ventricule droit du cœur et perfusez avec du sérum physiologique froid tamponné au phosphate (PBS) jusqu’à ce que le sang résiduel soit éliminé du poumon et que le tissu pulmonaire devienne pâle :
    1. Pour les souris adultes : utilisez une canule de 26 g et perfonez le poumon avec 10 mL de PBS.
    2. Pour les souris nouveau-nées : utilisez une canule de 30 g et perfonez le poumon avec 1 mL de PBS.
      REMARQUE : Ne pas perfuser les poumons des souris juvéniles afin d’éviter la rupture de la structure alvéolaire par une pression excessive dans les vaisseaux sanguins pulmonaires. La perfusion peut être moins efficace dans les poumons enflammés, et le changement de couleur du tissu pulmonaire peut être moins prononcé. Si nécessaire, un lavage bronchoalvéolaire peut être effectué avant l’étape suivante chez les souris adultes et juvéniles.

2. Digestion enzymatique des tissus pulmonaires

  1. Souris adultes et juvéniles :
    1. Exposez la trachée en retirant les glandes salivaires et le muscle environnant.
    2. Insérez une canule permanente de 22 G dans la trachée, retirez son aiguille et déplacez le cathéter en plastique vers les poumons.
    3. Attachez solidement un morceau de fil autour de la trachée et du cathéter pour le maintenir en place.
    4. Préparez le tissu pulmonaire en instillant la dispase.
      ATTENTION : Peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires si inhalé. Évitez de respirer de la poussière. Portez une protection respiratoire. Éliminez votre contenu ou le contenant dans une usine d’élimination des déchets agréée.) à travers le cathéter inséré dans la trachée :
      1. Pour les souris adultes : insérer 2 mL de dispase.
      2. Pour les souris juvéniles : insérer 500 μL de dispase.
        REMARQUE : Utilisez une seringue avec une connexion à coulissement luer pour faciliter l’échange de seringues entre les étapes 2.1.4 et 2.1.5. Pour garantir une digestion enzymatique efficace du tissu pulmonaire, il est essentiel d’assurer un remplissage complet enzymatique des espaces bronchoalvéolaires.
    5. Échangez la seringue et répétez avec de l’agarose à faible fusion (1 % (p/v), 45 °C) pour maintenir la structure pendant le traitement.
      1. Pour les souris adultes : utilisez 500 μL d’agarose à faible fond.
      2. Pour les souris juvéniles : utilisez 200 μL d’agarose à faible fond.
        REMARQUE : Pour éviter le reflux des fluides, laissez la seringue attachée.
        REMARQUE : Avant utilisation : dissoudre de l’agarose à faible fusion à la chaleur (95 °C), laisser la solution d’agarose refroidir à 45 °C, par exemple dans un thermobloc.
    6. Couvrez le poumon de papier de soie de laboratoire et ajoutez de la glace pour laisser l’agarose solidifier pendant 2 minutes.
    7. Retirez la glace, le papier de soie, la seringue et la sonde.
    8. Attachez le fil pour fermer la trachée afin de maintenir l’enzyme dans les voies respiratoires inférieures.
    9. Retirez le cœur et le thymus.
    10. Coupez la trachée au-dessus du fil et retirez le poumon intact de la poitrine.
    11. Transférez le poumon dans un tube de 15 mL contenant une dispase préchauffée (37 °C) et incubez le tissu pulmonaire en dispas pendant 45 minutes à température ambiante (20-25 °C).
      1. Pour les souris adultes : couver le poumon en dispase de 2 mL.
      2. Pour les souris juvéniles : couver le poumon dans une dispase de 1,5 mL.
  2. Souris néonatales
    1. Collectez et hachez des lobes pulmonaires à l’aide de ciseaux fins dans le couvercle d’un tube de 2 mL.
    2. Ajoutez 500 μL de dispase, fermez le couvercle et inversez le tube pour s’assurer que tout le tissu est couvert de dispase.
    3. Incubez le tissu pulmonaire en dispas à température ambiante pendant 45 minutes.

3. Préparation du tissu pulmonaire

  1. Pour les souris adultes et juvéniles :
    1. Retirez le poumon de la dispas et disséquez les lobes pulmonaires de la tige bronchique.
    2. Placez les lobes pulmonaires dans une boîte de Petri (diamètre : 8,5 cm) contenant 7 mL de DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentration finale) anti-anti-CD16/32 et 100 μL d’ADNase (concentration finale ~600 unités de Kunitz).
      ATTENTION : Peut provoquer des symptômes d’allergie ou d’asthme ou des difficultés respiratoires si inhalé. Évitez de respirer de la poussière. Portez une protection respiratoire. Jetez le contenu ou le contenant dans une usine d’élimination des déchets agréée.
    3. Désintégrez le tissu pulmonaire à l’aide de pinces.
      REMARQUE : Pour garantir une digestion enzymatique efficace des tissus pulmonaires, il est essentiel d’assurer une désintégration mécanique complète des tissus.
    4. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante tout en balançant doucement à 200 tr/min.
      REMARQUE : La suspension des cellules peut être stockée à 4 °C jusqu’à l’étape suivante, si nécessaire.
  2. Pour les souris nouveau-nées :
    1. Transférer la dispase, y compris le tissu digéré, dans une boîte de Petri (diamètre : 5,4 cm) contenant 3 mL de DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentration finale) anticorps anti-CD16/32 et 100 μL d’ADN (concentration finale ~ 600 unités de Kunitz).
    2. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante tout en balançant doucement à 200 tr/min.
      REMARQUE : La suspension des cellules peut être stockée à 4 °C jusqu’à l’étape suivante, si nécessaire.
  3. À suivre pour tous les groupes d’âge :
    1. Filtrez la suspension cellulaire à travers une série de filtres en nylon avec une taille de pores décroissante (100 μm - 70 μm - 40 μm) pour éliminer les débris et les gros agrégats.
    2. Rincez soigneusement les passoires et tubes cellulaires pour minimiser la perte de cellules. Dans le cas où des échantillons sont regroupés, des suspensions cellulaires de souris du même groupe peuvent être transmises à travers les mêmes filtres cellulaires.
      REMARQUE : En cas d’obstruction, changez les filtres cellulaires.
    3. Selon le volume, transférez la suspension filtrée à cellules sur un ou plusieurs tubes de 15 mL et centrifugez la suspension à cellules pendant 12 minutes à 140 x g à 4 °C.
    4. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans le tampon de lyse érythrocytaire (tampon ACK).
      1. Pour les souris adultes et juvéniles : utilisez 2 mL de tampon de lyse érythrocytaire et incubez pendant 2 minutes.
      2. Pour les souris néonatales : utilisez 3 mL de tampon de lyse érythrocytaire et incubez pendant 3 minutes.
    5. Arrêtez la lyse des érythrocytes en remplissant le tube de 15 mL de DMEM + HEPES + 10 % (v/v) de FBS et centrifugez à nouveau pendant 12 minutes à 140 x g à 4 °C.

4. Coloration par anticorps pour le tri cellulaire activé par fluorescence

  1. Resuspendez les cellules dans une solution colorante par anticorps contenant anti-F4/80, anti-CD93, anti-CD11c, anti-CD19, anti-CD31, anti-CD11b, anti-CD16/32, anti-CD45, anti-CD24 et anti-CD326 préparés dans DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS.
    REMARQUE : Pour des résultats optimaux de coloration, utilisez uniquement des anticorps pré-titrés. Si les AECII doivent rester intacts pour le tri cellulaire, n’incluez pas d’anti-CD326 dans la solution de coloration des anticorps.
    1. Pour les souris adultes : utilisez une solution d’anticorps de 600 μL par poumon.
    2. Pour les souris juvéniles : utilisez une solution d’anticorps de 400 μL par poumon.
    3. Pour les souris nouveau-nées : Utilisez une solution d’anticorps de 200 μL par poumon.
  2. Incubez la suspension cellulaire avec les anticorps pendant 10 minutes à 4 °C dans le noir.
  3. Après l’incubation, lavez les cellules en remplissant le tube de DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS.
  4. Centrifugez pendant 12 minutes à 140 x g à 4 °C.
  5. Resuspendez les cellules DMEM + HEPES + 10 % (v/v) FBS :
    1. Pour les souris adultes : résuspendre 300 μL par poumon.
    2. Pour les souris juvéniles : Résuspendre 200 μL par poumon.
    3. Pour les souris néonatales : Résuspendre 100 μL par poumon.

5. Tri de l’AECII

REMARQUE : Préparation de l’instrument : installer une buse de 100 μm pour trier les AECII à l’aide d’un dispositif FACS.

  1. Juste avant le tri, filtrez les cellules à travers un filtre de 50 μm. Rincez la passoire cellulaire avec du DMEM complété en HEPES et 10 % (v/v) de FBS pour éviter une perte cellulaire excessive :
    1. Souris adultes : Rincez la passoire cellulaire avec 300 μL par poumon.
    2. Souris juvéniles : Rincez la passoire cellulaire avec 200 μL par poumon.
    3. Souris néonatales : Rincez la passoire cellulaire avec 100 μL par poumon.
  2. Resuspendez les cellules en faisant un vortex juste avant le tri.
  3. Porte pour AECII en identifiant les événements où I) ont une diffusion latérale élevée (SSC élevé), II) sont négatifs pour les fluorochromes de lignée, et III) sont positifs pour le fluorochrome CD326 couplé à l’anticorps anti-CD326.
    REMARQUE : Utilisez des fluorochromes avec des indices de luminosité élevés à très élevés (tels que APC, PE et BV785) pour faciliter la discrimination entre les non-AECII et les AECII. Pour une approche de tri non modifiée (exclusion d’anti-CD326 dans la solution de coloration), les AECII sont identifiés comme cellules négatives pour la lignée,SSC élevé et autofluorescence positives/hautes . L’autofluorescence AECII peut être identifiée dans les détecteurs de lumière verte, par exemple les détecteurs FITC ou GFP.
  4. Excluez les doublets ou agrégats utilisant la hauteur de diffusion directe vs. zone (FSC-H vs. FSC-A) et la hauteur de diffusion latérale vs. (SSC-H vs. SSC-A).
  5. Collectez les cellules triées dans un tube contenant du DMEM complété en HEPES et en FBS à 10 % (v/v), puis centrifugez pour une analyse ou une culture ultérieure.

6. Isolement de l’ARN à partir d’AECII fixé par PFA (optionnel)

REMARQUE : Dans le cas où l’AECII doit être isolé chez des souris ayant été infectées, par exemple, par des agents pathogènes viraux respiratoires, l’isolement de l’AECII doit être effectué dans des conditions BSL2 ou BSL3, selon le pathogène. Si l’expérimentateur n’a pas accès au tri cellulaire dans les conditions de sécurité appropriées, l’AECII isolé selon le protocole décrit ci-dessus peut être corrigé avec du PFA après coloration par anticorps. Cette étape inactive les agentspathogènes 10,11 et ainsi un tri cytométrique AECII en flux ultérieur peut avoir lieu dans des conditions BSL1. Bien que ces cellules ne puissent plus être utilisées pour des tests fonctionnels en raison du processus de fixation, elles conviennent aux analyses moléculaires.

  1. Pour l’inactivation des virus, fixer des suspensions monocellulaires marquées par anticorps dans 500 μL de PFA à 4 % (p/v).
    ATTENTION : Solide inflammable. Nocifs si avalés ou inhalés. Provoque des irritations cutanées, des dommages oculaires graves. Peut provoquer une réaction allergique cutanée, une irritation respiratoire et un cancer. Soupçonné de causer des défauts génétiques. Évitez la chaleur. SI ON L’AVALE : Appelez un CENTRE DE TRAITEMENT DES POISONS ou un médecin si vous ne vous sentez pas bien. SI INHALÉ : Évacuez la personne pour la mettre à l’air frais et gardez-la confortable pour respirer. Appelez un CENTRE DE TRAITEMENT DES POISONS ou un médecin si vous ne vous sentez pas bien. SI C’EST DANS LES YEUX : Rincez prudemment à l’eau pendant plusieurs minutes. Retirez les lentilles de contact, si elles sont présentes et faciles à faire. Continuez à rincer. SI VOUS ÊTES EXPOSÉ OU INQUIET : Obtenez des conseils ou des soins médicaux.
    REMARQUE : Conformément aux directives 3R, des AECII provenant de souris non infectées ont été utilisées dans cette étude. Les AECII étaient fixes pendant 10 minutes à température ambiante. La durée de fixation doit être testée individuellement pour chaque agent pathogène présentant un risque potentiel pour l’homme et l’environnement. Le tri ultérieur sous conditions S1 nécessite une vérification préalable dans un laboratoire BSL2 ou BSL3 qu’aucun virus reproductible n’est présent après fixation PFA.
  2. Après fixation, lavez les cellules avec du DMEM et centrifugez pendant 15 minutes à 140 x g.
  3. Resuspendez les cellules dans un DMEM de 300 μL + HEPES + 10 % (v/v) FBS et faites passer la suspension de cellules à travers une tamoire de 100 μm.
  4. Rincez la tamoire cellulaire avec un milieu supplémentaire de 300 μL de DMEM + HEPES + 10 % (v/v) de FBS pour éviter une perte cellulaire excessive.
  5. Triez les cellules comme décrit à l’étape 5. « Tri de l’AECII ».
    REMARQUE : Après une vérification expérimentale obligatoire que tout virus a été inactivé par un traitement avec 4 % (p/v) de PFA, l’AECII peut être trié selon les conditions BSL1.
  6. Pour l’isolation de l’ARN à partir de cellules fixées en PFA, utilisez le kit FFPE RNeasy.
    ATTENTION : Ce kit contient des produits chimiques dangereux. Suivez les instructions du fabricant. Faites attention à la fiche de données de sécurité incluse, avec les ajustements suivants :
    1. Après le tri, centrifugez les cellules pendant 15 minutes à 140 x g à 4 °C.
    2. Resuspendez les cellules dans un TAMPON PKD de 150 μL et transférez dans un tube de 1,5 mL.
    3. Ajoutez 10 μL de protéinase K et incubez à 56 °C pendant 15 minutes, suivies d’une incubation à 80 °C pendant jusqu’à 15 minutes, selon le nombre de cellules (voir Tableau 1).
  7. Poursuivre le processus d’isolement de l’ARN selon le protocole, incluant le traitement par DNase, les étapes de lavage et l’élution finale dans une eau sans RNase à 30 μL.

Résultats

Le protocole décrit ici représente une méthode optimisée et détaillée pour isoler et analyser l’AECII à partir de tissu pulmonaire de souris à différents stades du développement, allant du néonatal au juvénile et à l’adulte. La méthodologie implique une dissociation pulmonaire mécanique et enzymatique, combinée à un flux de travail optimisé de tri cellulaire cytométrique en flux, utilisant des protocoles personnalisés adaptés au traitement des échantillons d’animaux infectés pour un tri en flux ultérieur sous conditions BSL1.

Les données expérimentales ont révélé une forte efficacité de cette procédure d’isolement (résumée à la Figure 1) dans la production de populations AECII viables et très pures (>95 %). Le tri en flux a généré des populations pures d’AECII, avec une analyse post-tri validant une spécificité de près de 100 % pour les marqueurs cellulaires établis (Figure 2). La quantification des échantillons cellulaires post-tri a indiqué des rendements élevés entre 0,15 × 106 AECII viables provenant de poumons néonataux et 1,0 × 106 cellules provenant d’échantillons adultes par préparation pulmonaire entière (Figure 3A). Les AECII isolés ont maintenu la morphologie typique (Figure 3B) et l’intégrité cellulaire tout au long du processus d’isolement (Figure 3C). De plus, l’applicabilité du protocole aux études fonctionnelles a été confirmée par une infection ex vivo réussie utilisant un IAV adapté à la souris (H1N1, souche A/Porto Rico/8/34) exprimant la protéine rapporteure mCherry (IAV-mCherry12), avec une démonstration de la capacité des cellules à soutenir la réplication virale (Figure 4).

Pour soutenir les flux de travail expérimentaux nécessitant la fixation d’échantillons, le protocole inclut une approche spécialisée d’extraction d’ARN utilisant la fixation de PFA. Un examen approfondi de la qualité de l’ARN provenant d’AECII fixés par PFA à différents moments de traitement a indiqué que l’ARN de haute qualité susceptible d’être analysé en aval peut être extrait de manière fiable à partir d’échantillons fixes (Tableau 1). La qualité de l’ARN extrait a montré une relation directe avec la durée du traitement thermique à 80 °C pendant la procédure d’extraction, offrant des directives claires d’optimisation basées sur des besoins expérimentaux particuliers (Tableau 1, Figure 5). La validation par analyse quantitative par transcription inversée PCR (qRT-PCR) a montré une amplification réussie à la fois des gènes de maintien (protéine ribosomique S9, Rps9) et des marqueurs spécifiques à l’AECII (protéine tensioactif C, Sftpc) avec des échantillons fixés au PFA et des préparations témoins fraîches (Figure 6).

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Figure 1 : Flux de travail schématique pour l’isolement AECII à partir de poumons néonatals, juvéniles et adultes de souris utilisant la digestion enzymatique des tissus et le tri cellulaire cytométrique en flux. Le schéma illustre le traitement systématique des poumons de souris issus de différents groupes d’âge. L’euthanasie de souris et d’extraction pulmonaire est suivie d’une digestion enzymatique en plusieurs étapes avec dispase pour la désintégration tissulaire. Après une perturbation mécanique, les cellules sont purifiées par une série d’étapes de filtration avec des pores décroissants. Par la suite, les érythrocytes sont lysés. L’enrichissement spécifique de l’AECII est obtenu par sélection négative à l’aide de marquage par anticorps contre les marqueurs hématopoïétiques (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), le marqueur endothélial CD31, le marqueur plaquettaire CD93 et le marqueur des cellules épithéliales bronchiques CD24, la sélection positive des cellules épithéliales par un marquage d’anticorps contre CD326, puis un tri cytométrique en flux basé sur letaux caractéristique élevé du SSC profil d’AECII granulaire. Ce protocole permet d’isoler des AECII primaires très purs (≥ 95 %), viables pour des analyses fonctionnelles et moléculaires en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Stratégie de verrouillage représentative utilisée pour l’isolement de l’AECII des souris adultes. (A) Les suspensions monocellulaires pulmonaires ont été colorées avec des anticorps contre les antigènes suivants : F4/80, CD93, CD11c (couplé à APC), et CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (couplé à PE) et CD326 (couplé à BV785). (B) Réanalyse (A) pour l’analyse de pureté. Les AECII triés ont été réanalysés afin de confirmer la pureté de 97,2 % des AECII. (C) Images microscopiques à fluorescence représentatives de l’AECII après tri. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). La coloration intracellulaire a été réalisée à l’aide d’un anticorps anti-SPC primaire (espèce : lapin), et la coloration secondaire a été réalisée à l’aide d’IgG anti-lapin de chèvre couplée à Alexa 594 (rouge). AECII coloré uniquement avec DAPI et anticorps secondaires, et les splénocytes colorés avec des anticorps primaires et secondaires servaient de témoins pertinents, indiquant une liaison spécifique de l’anti-SPC ainsi que de l’anti-rabbitAlexa 594. Barres d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Rendement, morphologie et vitalité de l’AECII après tri cellulaire activé par fluorescence. (A) Nombre total d’AECII viables par poumon obtenu chez des souris néonatales, juvéniles et adultes. (B) Image par microscopie optique du tri post-tri AECII. Barre d’échelle : 75 μm. (C) Viabilité de l’AECII observée par coloration bleue de trypan après tri. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4 : Infection ex vivo d’AECII trié avec IAV-mCherry. Les cellules AECII isolées sur des souris adultes ont été cultivées ex vivo dans des plaques de culture tissulaire recouvertes de Matrigel pendant la nuit pour permettre l’attachement. Par la suite, les cellules ont été infectées par IAV-mCherry (multiplicité de l’infection 2) pendant 8 heures. Une augmentation dépendante du temps de l’intensité du signal mCherry a été observée. Barre d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Intégrité ARN à partir de 4 % de PFA fixe les AECII. Profils ARN représentatifs de PFA fixés et triés d’AECII après isolation ARN à l’aide du kit Qiagen FFPE RNeasy avec modifications. Les pics spécifiques pour les ARNr 18S et 28S, ainsi que le numéro de qualité ARN (RQN), représentent l’intégrité et la qualité de l’ARN pour l’ARN isolé intact provenant d’AECII fixés par le PFA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-6
Figure 6 : Courbes d’amplification du gène de maintien Rps9 et du gène spécifique à l’AECII Sftpc, provenant de l’AECII témoin (non traité) et du 4 % de PFA fixé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

ExempleTemps d’incubation à 80 °C28S/18SRQNConc. ARN [ng/μ]
Contrôle 0,5x106-2105.8
Contrôle 1x106-1.91012.3
PFA fixe 0,5x106526.45.5
PFA fixe 0,5x106101.98.13.7
PFA fixe 0,5x106151.88.22.76
PFA fixe 1 x106528.26.26
PFA fixe 1 x106101.18.45.12
PFA fixe 1 x106150.98.55

Tableau 1 : Qualité de l’ARN isolé à partir de 4 % d’AECII fixé par PFA - impact des différents temps de fixation. L’ARN de l’AECII a été isolé selon le protocole du fabricant (FFPE RNeasy Kit) avec des modifications décrites à l’étape 6. Les cellules fixées ont été incubées à 80 °C pendant 5 minutes, 10 minutes ou 15 minutes pour éluer l’ARN de l’échantillon. L’intégrité de l’ARN a été déterminée à l’aide de l’analyseur de fragments d’Agilent

Discussion

Le protocole optimisé décrit ici offre une approche fiable et reproductible pour l’isolement et l’analyse de l’AECII à partir de tissu pulmonaire de souris aux âges néonatal, juvénile et adulte. De plus, il prévoit une étape optionnelle de fixation PFA avant le tri, ce qui permet de trier les AECII à partir de souris sous conditions BSL1, même si elles ont déjà été infectées par des agents pathogènes respiratoires. Grâce à la combinaison d’une exposition pulmonaire soigneusement réalisée et d’une perfusion, suivie d’une insolation intratrachéale d’enzymes et d’une agarose à faible fusion dans le poumon, la structure tissulaire est maintenue et permet la récupération de suspensions unicellulaires de haute qualité pour une analyse en aval. L’ajout du tri cytométrique en flux sur les propriétés de diffusion latérale, le filtrage négatif et la sélection positive pour les cellules CD326 positives a donné des populations remarquablement pures d’AECII. Cette pureté est particulièrement importante pour garantir que les analyses moléculaires et fonctionnelles en aval soient représentatives de la biologie intrinsèque de l’AECII et ne soient pas perturbées par des types cellulaires contaminants, améliorant ainsi l’interprétabilité des études d’expression génique et d’interaction virus-hôte.

Le protocole mentionné ci-dessus prévoit l’exclusion des non-AECII à l’aide d’un large éventail d’anticorps marqués par fluorescence dirigés contre les antigènes leucocytaires et non leucocytaires, ainsi que la sélection positive subséquente de l’AECII via les propriétés de diffusion latérale et l’expression de la molécule spécifique aux cellules épithéliales CD326. Bien qu’il ait été démontré que cette méthodologie aboutissait à des populations AECII hautement pures (utilisant le SPC, un marqueur AECII emblématique), la pureté des populations obtenues n’a pu être confirmée jusqu’à présent qu’en utilisant une coloration intracellulaire post-tri. Ce protocole peut être appliqué pour isoler les AECII des poumons infectés par le SARS-CoV-2 et le virus grippal, dans lesquels les AECII sont principalement ciblés par le virus et présentent des adaptations cellulairesdistinctes 1. Cependant, cette méthode peut ne pas être appropriée pour isoler des AECII murins dans le cadre d’études de biologie du cancer du poumon, car EpCAM (CD326) est également exprimé par les cellules cancéreuses pulmonaires chez la souris etl’humain 13. Pour ces études, l’utilisation de souches de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes sous le contrôle transcriptionnel du promoteur Spc pourrait offrir une approche plus adaptée pour l’isolement fiable des AECII primaires.

Un rendement de 0,15 × 106 AECII viables par poumon néonatal et jusqu’à 1,0 × 106 cellules par poumon adulte illustre l’efficacité et la scalabilité du protocole. Un obstacle majeur à l’isolement réussi de grandes quantités d’AECII est la digestion enzymatique inefficace et la désintégration mécanique du tissu pulmonaire. Il est donc crucial d’assurer un remplissage complet des espaces bronchoalvéolaires avec l’enzyme à l’étape 2.1.4 et de procéder soigneusement à la désintégration mécanique des tissus à l’étape 3.1.3. Une digestion enzymatique efficace donne une suspension de cellules turbides avec une contribution minimale d’agrégats visibles qui peuvent généralement être désintégrés à l’aide d’un piston dans les étapes de filtration suivantes. Les agrégats plus gros qui ne peuvent pas être transmis à travers le filtre cellulaire apparaissent généralement en raison d’une digestion enzymatique insuffisante. Notez qu’il n’est pas conseillé de prolonger les temps de digestion enzymatique, car cela pourrait affecter négativement la immunocolorationultérieure 14 et donc la précision de l’isolement AECII basé sur FACS.

Outre l’efficacité de la désintégration enzymatique et mécanique des tissus, le fond génétique peut influencer le rendement de l’AECII. Pour ce protocole, des souris sur fond C57BL/6 ont été utilisées. Conformément aux différencesdéveloppementales rapportées entre 15 et16 immunologiques et17, 18, 19 physiologiques spécifiques à chaque souche, il est concevable que l’utilisation d’autres souches de laboratoire de souris (par exemple, BALB/c, DBA) puisse entraîner des rendements AECII différents. De plus, le rendement AECII provenant de poumons enflammés (infectieux ou non infectieux) peut être considérablement réduit. Cela peut résulter d’une mort cellulaire indirecte (inflammatoire) ou directe (médiée par un agent pathogène) de l’AECII, qui représentent des cibles majeures par exemple pour IAV20,21 et SARS-CoV-2 22,23,24.

La préservation de l’intégrité cellulaire lors de la dissociation mécanique, de la digestion enzymatique et du tri des flux est également essentielle pour les analyses moléculaires et/ou fonctionnelles ultérieures. Par conséquent, la viabilité et la fonction cellulaire de l’AECII ont été évaluées après le tri. Les AECII étaient capables de respecter Matrigel et de maintenir une morphologie riche en corps lamellaire caractéristique pendant au moins 24 heures, ce qui indique une compétence fonctionnelle après isolement et une adéquation à la culture ex vivo (y compris les modèles d’infection).

L’infection efficace des AECII triés par le virus rapporteurIAV-mCherry 12 et l’observation d’une forte réplication virale valident ce système comme une plateforme robuste pour élucider les réponses antivirales épithéliales intrinsèques. Puisque l’AECII régule les processus clés impliqués dans la biosynthèse des tensioactifs, la régénération alvéolaire et l’immunitéinnée 25,26, la capacité à examiner la cinétique de réplication de l’IAV et les réponses transcriptionnelles de l’hôte dans les populations purifiées d’AECII fournira des informations inaccessibles dans les préparations à cellules mixtes.

Une innovation clé de ce protocole est l’inclusion d’une procédure de fixation, permettant une analyse côte à côte d’échantillons frais et inactivés. La fixation du PFA et les processus d’extraction d’ARN FFPE adaptés maintiennent l’intégrité de l’ARN dans une mesure compatible avec les analyses transcriptomiques en aval, comme en témoigne la PCR quantitative par transcription inverse (qPCR) réussie.

Les temps de fixation du PFA peuvent affecter la qualité de la coloration et donc la récupération de l’AECII par le FACS. De plus, le rendement et la qualité de l’ARN sont généralement affectés par les processus de fixation. Selon le modèle d’infection in vivo utilisé, ces aspects doivent être pris en compte pour la conception expérimentale. Il est recommandé d’éviter un temps de fixation prolongé et d’optimiser plutôt la durée du traitement par APA afin d’utiliser le temps minimum nécessaire, ce qui a été prouvé expérimentalement comme garantissant une inactivation complète du virus concerné.

L’évaluation de l’abondance de l’ARN ribosomique (ARNr) à l’aide d’un instrument microfluidique sert de substitut pour estimer la qualité de l’ARNm dans les échantillons biologiques. Le protocole de fixation/isolation de l’ARN décrit par AECII permet l’isolement d’ARN intact avec une qualité suffisante pour des analyses transcriptomiques en aval, comme en témoignent les rapports rRNA 28S/18S >1 et les valeurs du nombre de qualité ARN (RQN) >8. Il est important de noter que l’étape d’incubation à 80 °C réduit de manière critique le rendement et la qualité de l’ARN. L’adaptation des temps de traitement thermique peut être appliquée en option pour augmenter le rendement et la qualité de l’ARN pour les applications en aval.

Collectivement, ces améliorations méthodologiques fournissent une boîte à outils étendue pour l’étude de la biologie de l’AECII dans le contexte de la santé, des maladies infectieuses et du développement (du nouveau-né à l’adulte). Le rendement élevé et la pureté des AECII isolés par cette approche permettent un profilage multi-omique, englobant les tests transcriptomiques, protéomiques et d’accessibilité à la chromatine, ainsi que des tests fonctionnels (par exemple, infection ex vivo ) afin de disséquer davantage les mécanismes pertinents de l’AECII in vivo.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Tatjana Hirsch et Friederike Kruse pour leur assistance technique experte, Lisa Hönicke et Justine Smout pour leurs discussions utiles, ainsi que Yoshihiro Kawaoka pour avoir fourni le virus IAV-mCherry pour le rapporteur. Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) - TRR 359 - Projet numéro 491676693 (à D.B. et J.H.), l’initiative COVIPA (KA1-Co-02, Association Helmholtz ; à D.B.), et une subvention de la Fondation allemande de recherche (BO 7036/1-1 ; à J.D.B.). Nous reconnons le soutien du Fonds de publication en accès ouvert de la Faculté de médecine de l’Université Otto-von-Guericke de Magdebourg.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon ACK--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 et micro ; L de 0. 5 M EDTA, ajoutez 1000 mL de Milli-Q, ajustez le pH à 7,2 à 7,4
anti-souris CD11beBioscience12-0112-83clone M1/70 ; PE couplé
anti-souris CD11cBiolégende117310clone N418 ; APC couplé
anti-souris CD16/32BD Biosciences553141clone 93 ; purifié
anti-souris CD16/32BD Biosciences561727clone 2.4G2 ; PE couplé
anti-souris CD19Biolégende115508clone 6D5 ; PE couplé
anti-souris CD24Biolégende101808clone M1/69 ; PE couplé
anti-souris CD31Biolégende102408clone 390 ; PE couplé
anti-souris CD326Biolégende118245clone G8.8 ; BV785 accouplé
anti-souris CD45BD Biosciences553081clone 30-F11 ; PE couplé
anti-souris CD93eBioscience17-5892-82clone AA4-1 ; APC couplé
F4/80 anti-sourisBiolégende123116clone BM8 ; APC couplé
anti-souris SPC  ;Abcamab211326Espèce hôte : lapin ; clone : EPR19839 ; purifié
Aria-FusionBD BiosciencesTrieur de cellules
Aria-II SORPBD BiosciencesTrieur de cellules
Biozym Plaque AgaroseBiozym8401011 % (v/v) dans H2O
Filtre cellulaire (100 & micro ; M, 70 & Micro ; M, 40 & Micro ; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & micro ; m)Sysmex04-004-2327
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin, 2000 unités de Kunitz/flaconSigma-AldrichD4263Teneur fraîchement dissoute de 1 flacon dans 330 & micro ; L DMEM
Dispase, 100 mL (5000 unités caseinolytiques)Corning354235effectuer une filtration stérile (pore 0,22 & micro ; m), préparer 4 mL aliquotes dans des tubes de 15 mL, stocker à -20 & degrés C
DMEMGibco31885-049faible glucose, avec le pyruvate, ajoutez le HEPES (concentration finale de 25 mM)
FACS DivaBD BiosciencesLogiciels de tri
FlowJoLogiciel d’évaluation des données FACS
Anti-Lapin des chèvresAlexa 594 couplée
Canule permanente Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE KitQiagen73504
Symphony S6 SEBD BiosciencesTrieur de cellules

Références

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

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