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Article de méthode

Imagerie intravitale à deux photons de la morphologie des axones sensoriels tactiles dans la peau de souris

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DOI :

10.3791/69589

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30 décembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude présente une approche in vivo d’imagerie à deux photons pour visualiser les structures des terminaisons axoniques des mécanorécepteurs (LTMR) à faible seuil dans la peau des pattes avant des souris. Utilisant des images répétées et haute résolution d’axones individuels, cette méthode offre une nouvelle plateforme pour étudier la structure et la fonction du circuit sensoriel cutané pendant le développement et chez l’adulte.

Résumé

Les mécanorécepteurs à faible seuil (LTMR) sont des neurones somatosensoriels qui détectent des stimuli légers inoffensifs tels que la vibration, la déviation des cheveux et la pression. Ils forment des terminaisons axonales spécifiques à chaque sous-type en périphérie et projettent des axones centralement vers la moelle épinière pour transmettre l’information tactile. La compréhension actuelle du développement et de l’organisation des LTMR provient de tissus fixes qui ne peuvent pas révéler les processus dynamiques et temporels du câblage et du remodelage axonaux. Ici, une méthode d’imagerie à deux photons est présentée pour visualiser la morphologie axonale LTMR de la patte avant de la souris pendant le développement et chez les adultes. La microscopie à deux photons peut obtenir une imagerie haute résolution dans une peau intacte, permettant d’imager à répétition des mêmes terminaisons axoniques à travers des moments postnatals. L’imagerie à deux photons peut être combinée avec de nouveaux outils génétiques chez la souris pour révéler le développement axonique avec spécificité de sous-type. L’imagerie chronique des LTMR permet d’étudier l’assemblage et la réparation des circuits après une blessure. Ces approches fournissent un système in vivo qui apportera de nouvelles perspectives sur les mécanismes cellulaires régulant le développement et la régénération des axones somatosensoriels.

Introduction

Le toucher est le sens le plus ancien à se développer et joue un rôle central dans la manière dont les organismes vivent et réagissent au monde physique. Le toucher est détecté par des mécanorécepteurs à faible seuil (LTMR), qui sont des sous-types de neurones ganglionnaires de la racine dorsale (DRG) qui détectent des stimuli mécaniques inoffensifs, notamment l’indentation, la vibration et la déviation descheveux 1,2. Les LTMR sont pseudounipolaires et étendent les axones périphériques dans les tissus périphériques pour former des terminaisons spécifiques à chaque sous-type. Leurs axones centraux transmettent l’information tactile au système nerveux central en formant des connexions synaptiques avec les neurones de la moelleépinière 3. Cependant, la manière dont les circuits tactiles sont établis et entretenus est mal comprise.

Des études fondamentales antérieures sur les chats dans les années 1960 et 1970 ont d’abord identifié ces mécanorécepteurs fonctionnellement distincts et leurs propriétés de réponse sur la peaupoilue 4,5. Les sous-types LTMR sont classés selon leur morphologie unique, leur vitesse de conduction et leurs propriétésde réponse 2. Les principaux sous-types LTMR sont les LTMR à adaptation rapide (RA) et à adaptation rapide (SA), les Aδ-LTMR et les C-LTMR 2,6,7. Les Aβ RA-LTMR, Aδ-LTMR et C-LTMR forment des complexes lanceolates longitudinaux autour des folliculespileux 2. Les Aδ-LTMR forment des terminaisons lancéolées polarisées autour des follicules pileux du côté caudal, une caractéristique essentielle à leur réponse sélective de direction à la déviation descheveux 7. Les terminaisons axonales dans les complexes lancéolés sont étroitement alignées avec les tiges pileuses et sont enveloppées par des processus en forme de doigts provenant des cellules terminales de Schwann, qui fournissent un soutien trophique et influencent la morphogenèseaxonale 8,9,10. Dans la peau glabre, les axones Aβ RA-LTMR se terminent dans des corpuscules de Meissner, qui sont des structures ovoïdes situées dans les papilles dermiques et accordées au mouvement sur la peau 2,11.

L’organisation des terminaux axonaux LTMR est régulée à la fois par des programmes intrinsèques et des indices dépendants de la peau lors dudéveloppement 12,13. Lorsqu’elle est endommagée, la dysfonction de la LTMR est associée à des pathologies telles que l’allodynie mécanique12,14. Cependant, les mécanismes de développement et d’entretien de la LTMR dans la peau intacte restent flous. Une grande partie de ce que l’on sait sur leur développement provient de tissus fixes, qui ne peuvent pas capturer les processus dynamiques pouvant se produire in vivo 6,15,16,17,18. Par exemple, les Aβ RA-LTMR et Aδ-LTMR présentent des innervations actives autour des follicules pileux et une taille axonale lors du développement postnatalprécoce 19. La manière dont l’innervation et l’entretien des follicules pileux sont obtenus in vivo reste inconnue.

La microscopie laser à balayage à deux photons, une technique d’imagerie avancée permettant la visualisation de structures marquées fluorescentement dans des tissus vivants, a permis l’imagerie in vivo à haute résolution des processus physiologiquesdynamiques 20,21. Lors de l’imagerie à deux photons, de brèves impulsions de lumière proche infrarouge excitent les fluorophores uniquement au niveau du plan focal, confinant ainsi le signal à un petit volume et minimisant la fluorescencefloue 21,22. Ce confinement réduit significativement la phototoxicité et permet l’imagerie tridimensionnelle et spatialement résolue des structures 20,23,24. De plus, les longueurs d’onde d’excitation plus longues utilisées en microscopie à deux photons diffusent moins à l’intérieur du tissu, permettant une pénétration plus profonde et un bruit moindre dans des environnementscomplexes 20,25,26. Par exemple, l’imagerie à deux photons a révélé une plasticité synaptique structurelle et des activités neuronales dans les neurones de la corne dorsale de la moelleépinière 27,28,29. De plus, l’imagerie chronique in vivo à deux photons des follicules pileux a révélé des informations sur leur homéostasie dans la peau de l’oreillede la souris 23. Ainsi, la microscopie à deux photons est très adaptée à l’étude des structures LTMR de la peau in vivo, notamment lorsqu’une imagerie répétée à long terme est nécessaire pour suivre les changements développementaux et chroniques.

Associée à des lignées de souris génétiquement modifiées exprimant des rapporteurs fluorescents, la microscopie à deux photons peut révéler la morphologie neuronale de lapeau 3. Dans le système somatosensoriel, la protéine fluorescente jaune (YFP), exprimée sous le contrôle du promoteur thy1 (Thy1-YFP)30, marque sélectivement les complexes lancéolés Aβ-LTMR dans la peau poilue et les corpuscules de Meissner dans la peau glabre30,31. Chez les souris Thy1-YFP, les axones marqués sont positifs pour la protéine basique de la myéline et le neurofilament, qui sont des marqueurs pour les axones Aβmyélinisés 30,31. De plus, le CreER, dans lequel la Cre recombinase inducible par tamoxifène (CreER) est entraînée par l’expression du gène TrkB (kinase réceptrice de la tropomyosine B), marque sélectivement les Aδ-LTMR lors du développement7. Sur la peau, la microscopie à deux photons est la plus efficace pour imager les RML chez des souris anesthésiées, car le mouvement de la souris affecterait l’acquisition d’imagerie haute résolution. Il faut du temps pour visualiser les protéines fluorescentes aux terminaisons axonales après l’expression induite par CreER, et la période d’attente minimale doit être déterminée pour chaque ligne transgénique. En général, cette méthodologie peut être appliquée à la visualisation des RML chez des souris de tous stades de développement et chez des adultes.

Ce protocole explique les procédures permettant d’utiliser la microscopie à deux photons pour étudier la morphologie axonique LTMR sur la peau poilue et glabre de souris en développement et adultes, à haute résolution. Le protocole inclut plusieurs conseils pour une imagerie à haute résolution et chronique optimale. Cette approche intégrative permet d’étudier les mécanismes cellulaires qui alimentent l’assemblage et la plasticité des axones sensoriels du contact in vivo.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux règlements institutionnels de soins aux animaux et ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université Vanderbilt. Pour la sécurité des expérimentateurs, toutes les procédures ont été réalisées avec des blouses de laboratoire, des gants stériles et des masques. Tous les outils ont été stérilisés soigneusement avant utilisation, et toutes les surfaces expérimentales ont été nettoyées à 70 % d’éthanol avant et après chaque expérience. Les souris utilisées dans cette étude étaient des adolescents et des animaux adultes des deux sexes et provenaient de souches de Thy1-YFP, TrkBCreER et Ai140. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des instruments

  1. Allume le laser. Laissez suffisamment de temps au laser pour chauffer. Dans ce travail, le laser Chameleon Discovery NX a été utilisé, qui a une durée d’impulsion de 100 femtosecondes (fs) et un taux de répétition de 80 ± 0,5 mégahertz (MHz).
  2. Allumez le microscope à deux photons et ouvrez le logiciel de contrôle et d’acquisition sur l’ordinateur.
  3. Allumez la bouillotte et réglez-la à 37 °C pour éviter l’hypothermie pendant l’anesthésie.

2. Préparation de l’anesthésie et de la patte avant pour l’imagerie

  1. Pour induire l’anesthésie, placez la souris dans la chambre d’induction et réglez le système à 3,5 % d’isoflurane jusqu’à ce que la souris perde son réflexe de redressement et présente une respiration régulière et régulière (suivant les protocoles approuvés par l’institution). L’air ambiant sert de support et doit être réglé à 1,0 litre par minute (L/min).
  2. Placez la souris sur la bouillotte de la plateforme d’imagerie et réduisez l’isoflurane à 1,5 % et l’oxygène à 0,5 L/min. L’isoflurane doit être administré par le cône du nez. Pour les souris plus jeunes que le 20e jour postnatal, l’isoflurane est réglé à 2-4 % pour maintenir l’anesthésie. Surveillez la profondeur anesthésique toutes les 10 minutes en évaluant la perte des réflexes pédaliques et palpébraux, la fréquence et la profondeur respiratoires, ainsi que le tonus musculaire global.
  3. Pour minimiser les artefacts de mouvement lors de l’imagerie, y compris les mouvements liés à la respiration, la souris doit être placée sur une scène séparée de la patte. Pour ce protocole, le corps de la souris repose sur une plateforme directement adjacente, mais sans toucher, la plateforme d’imagerie où la patte est montée.
  4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse lors de l’imagerie.
  5. Appliquez délicatement une crème dépilatoire sur la patte à l’aide d’un coton-tige-coton pour enlever les poils. Après avoir laissé reposer une minute sur la peau, retirez la crème, puis nettoyez la patte de souris avec 70 % d’éthanol et d’eau.
  6. Étirer doucement la peau pour stabiliser la surface de la peau. À l’aide d’une aiguille stérile de 30 G et d’encre noire, percez doucement la peau et le tatouage avec deux points adjacents de chaque côté de la région d’image souhaitée. Assurez-vous que les points sont espacés d’environ 2 millimètres (mm) l’un de l’autre. Une fois le tatouage terminé, jetez correctement l’aiguille dans un contenant pour objets tranchants.
  7. Sur une lame de microscope en verre, placez quatre points de graisse sous vide sur les coins et placez un petit morceau d’argile (par exemple, argile à modeler durcie à l’air DAS) d’environ 1 mm d’épaisseur au centre de la lame. Placez la culasse sous la lentille de l’objectif et centrez la patte de la souris directement sur le morceau d’argile (Figure 1A,B). Faites doucement rouler la patte de la souris sur la glissière pour l’aplatir et pressez-la contre l’argile. Placez soigneusement une housse de 22 mm x 60 mm sur la patte pour fixer la glissière. Ajustez l’angle de la peau de la souris en exerçant une légère pression sur chacun des coins de la couche de couverture jusqu’à ce que la surface de la couche et la peau soient parallèles au plan d’imagerie. Une force douce lors de l’imagerie aide à prévenir d’éventuelles blessures cutanées.
  8. Pour imager la peau glabre, placez la culasse sous la lentille objective et centrez la patte de la souris sur la glissière comme détaillé à l’étape 2.7. Utilisez une pince à épiler pour faire pivoter la patte afin que la peau glabre soit visible. Utilisez l’extrémité plate de la pince à épiler pour appuyer doucement la patte sur l’argile. Une fois la patte plate, placez la gaine de couverture par-dessus et appuyez vers le bas comme décrit à l’étape 2.7.

3. Imagerie à deux photons de la morphologie des LTMR

REMARQUE : Les paramètres suivants peuvent être ajustés en fonction de l’expérience spécifique. Pour cette expérience, un objectif en immersion dans l’eau de 20x avec une ouverture numérique de 1 et une distance de travail de 2,00 mm a été utilisé. Les étapes 3.1-3.6 décrivent les paramètres spécifiques utilisés pour la patte avant droite de la souris Thy1-YFP , qui peuvent servir de guide de référence.

  1. Placez une goutte d’eau distillée sur la bâtonne, directement au-dessus de la patte de souris.
  2. Abaissez la lentille objective jusqu’à ce qu’une colonne d’eau se forme.
  3. Une fois que la lentille de l’objectif est centrée sur la patte de souris, fermez la boîte du microscope et utilisez l’écran LED pour faire la mise au point sur l’échantillon via les contrôleurs X, Y et Z. L’écran LED affiche une image en direct éclairée par la LED intégrée au microscope.
    REMARQUE : Le mode LED est utilisé pour confirmer que la lentille objective est centrée sur le champ d’intérêt avant de passer en mode à deux photons. L’image LED montre des caractéristiques de surface telles que les vaisseaux sanguins et les follicules pileux, servant de guide visuel pour l’alignement et le ciblage. Les tatouages sur la patte de souris apparaissent comme des taches noires sur l’écran LED. En utilisant ces points de repère, trouvez et concentrez-vous sur la zone entre les taches noires. Cela garantit que la même zone de la patte de souris est représentée à plusieurs reprises.
  4. Une fois l’échantillon trouvé, éteignez l’écran LED. Pour effectuer une imagerie à deux photons à partir du tissu, basculez le microscope du réglage miroir vers le réglage dichroïque en basculant un levier sur le côté supérieur droit du microscope.
  5. Fermez les rideaux occultants et allumez le détecteur pour visualiser le YFP.
  6. Avec Prairie View, ouvrez l’obturateur et passez le logiciel en mode imagerie. Pour l’imagerie Thy1-YFP, allumez le laser réglable à 960 nanomètres (nm) avec un gain de 700-800. Lors de l’imagerie de la GFP, réglez le laser accordable à 920 nm.
    1. Pour les souris postnatales au 10e jour ou plus jeunes, réglez la puissance initiale du laser à 50, en augmentant jusqu’à atteindre l’intensité du signal souhaitée. Cette puissance laser initiale plus faible minimise la pénétration de la lumière et le risque de photodommages. Après que la longueur d’onde, le gain et la puissance du laser soient réglés, commencez à balayer.
      REMARQUE : Pour capturer une image haute résolution à champ de vision 1,00x ou une image de corpuscules de Meissner au bout des doigts glabres, il est recommandé d’utiliser une taille d’image de 1024 x 1024 avec un champ de vision d’imagerie de 601,9 μm x 601,9 μm, et une taille de pixel de 0,588 μm x 0,588 μm. Pour imager les terminaisons lanceolées autour des follicules pileux, il est recommandé d’avoir une taille d’image de 1024 x 1024 avec un zoom de 8,00x, un champ de vision d’imagerie de 75,2 μm x 75,2 μm, et une taille de pixel de 0,147 μm x 0,147 μm. Il est important de noter que le champ de vision de l’imagerie et la taille des pixels changent avec le réglage de zoom.
  7. Utilisez les contrôleurs X, Y et Z pour trouver le champ d’imagerie, ajustez le zoom si besoin, puis commencez l’acquisition de l’image. Une image optimale est généralement obtenue à une position de départ à environ 10-20 μm sous la surface de la peau.
    REMARQUE : Une image haute résolution de la peau poilue a généralement une taille de pas de 1 μm ou 2 μm avec environ 40 à 120 tranches. En revanche, une image haute résolution de la peau glabre a généralement une taille de pas de 2 μm à 4 μm avec environ 80 à 100 tranches. Cela donne une plage typique de z de 100 à 250 μm, et la profondeur d’imagerie maximale globale est d’environ 300 μm.
  8. La séance d’imagerie sera limitée à 25 minutes afin de minimiser la durée de l’exposition à l’isoflurane et de diminuer le risque d’effets indésirables liés à l’anesthésie pour l’animal. L’isoflurane supplémentaire est absorbé par un filtre à charbon anesthésiant, qui peut être jeté dans des déchets ordinaires.

4. Soins postopératoires

  1. Retirez la patte de souris de la glissière en verre et remettez la souris dans une cage de récupération.
  2. Gardez la cage de la souris au chaud sur un coussin chauffant jusqu’à ce que la souris se remette complètement de l’anesthésie.
  3. Replacez la souris dans sa cage d’origine, observez-la pendant 30 minutes supplémentaires pour s’assurer qu’elle s’intègre à ses compagnons de cage.

5. Imagerie chronique in vivo de la morphologie de la LTMR

  1. Placez la souris sous le microscope à deux photons en suivant les étapes 2.4 à 3.3.
  2. À l’aide de l’écran LED, localisez les points d’encre de la séance d’imagerie précédente. Orientez l’écran entre les points pour vous assurer que la zone désirée est capturée. Lors du balayage au microscope, vérifiez la présence de repères, tels que de gros nerfs ou des motifs de follicules pileux, afin de vous assurer de localiser la même zone.
  3. Une fois la zone d’imagerie trouvée, suivez les étapes 3.4 à 3.6 pour poursuivre l’imagerie.
  4. Vérifiez la qualité et l’intensité des images, ainsi que la morphologie des axones majeurs, obtenues par excitation à deux photons de la surface cutanée. Assurez-vous que les champs d’image sont comparables à ceux pris lors de la séance d’imagerie précédente.

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Résultats

Dans ce travail, la microscopie à deux photons a été utilisée pour visualiser les structures axonales Aβ RA-LTMR et Aδ-LTMR dans la peau pendant le développement et chez les adultes. Les extrémités lancéolées matures, apparaissant chez les souris vers le 20e jour postnatal et plus, sont pleinementdéveloppées 19,32. L’organisation globale des terminaisons axoniques dans la peau poilue des souris adultes a été imagée, comme le montre la projection d’intensité maxim...

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Discussion

Cette étude démontre l’utilisation de la microscopie à deux photons pour examiner la morphologie de la LTMR sur la peau intacte de souris néonatales et adultes. Cette approche d’imagerie longitudinale surmonte les limites de la fixation tissulaire et permet l’observation en temps réel des structures axonales dans des tissus intacts. Les morphologies axonales Aβ RA-LTMR et Aδ-LTMR visualisées par imagerie à deux photons sont cohérentes avec les observations des tissus fixés précédemment e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne rapportent aucune divulgation pertinente.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Hannah Elam, le Dr Snighda Mukerjee, Rachelle Larivee et le Dr Tegy J. Vadakkan pour tout leur soutien et leur aide tout au long de cette recherche. Nous remercions Ryan Michael Nuera pour son aide dans la mise en place du système isoflurane. Ce travail est soutenu par la bourse Hanna Gray de l’Institut médical Howard Hughes (Bourse# GT17518).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Objectif 20x & ndash ; Super NA 1.0Olympe1-U2B965Installation du microscope à deux photons
Carte de couverture 22x60VWR16004-330Installation du microscope à deux photons
Pâte à modeler à l’air durcie à l’airDASInstallation du microscope à deux photons
Pompe à air d’anesthésie (HF), 110VRWD Life Science Inc.R510-30Système isoflurane
Masque concentrique d’anesthésieRWD Life Science Inc.R510-MSystème isoflurane
Chambre d’induction d’anesthésie & ndash ; Souris et RatRWD Life Science Inc.V105Système isoflurane
Bruker Ultima Investigator Plus Microscope à balayage laserBruker Nano, Inc.  ;Installation du microscope à deux photons
Aiguilles papillonFisher Scientific1484041Installation du microscope à deux photons
Chameleon Discovery NX avec TPC : DualCohérent1385777Installation du microscope à deux photons
Masque conique avec tube pour souris néonatalesRWD Life Science Inc.68680Système isoflurane
Filtres à double émission (et525/70m et et595/50m) et t565lpxr  ; Séparateur de faisceau dichroïqueNikonINVP-01Installation du microscope à deux photons
Ensemble de filtres à épi-fluorescence ET-GFP ET470/40x et ET252/50m ; dichroïque T495LPXR  ;Nikon518065Installation du microscope à deux photons
ÉthanolDecon Laboratories Inc.Installation du microscope à deux photons
Tapis de chauffage infrarouge lointain avec contrôleur (alimentation AC)Kent ScientificRT-0515Installation du microscope à deux photons
Détecteurs GaAsp (2)  ;Hamamatsu Photonics  ;HED-UP-2  ;Installation du microscope à deux photons
Filtre à gazRWD Life Science Inc.R510-31-6Système isoflurane
Graisse à haute teneur sous videSigma AldrichZ273554Système d’imagerie
Isoflurane, USP (250 mL)Piramal Soins Intensifs6679-017-25Système isoflurane
Boîte de couverture laser   ;Technologie TecoSystème d’imagerie
Souris : B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Souris : B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP, CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Souris : B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JRivière Charles3709
Crème dépilante NairAmazon28001Installation du microscope à deux photons
Fichiers de données brutesZenodo10.5281/zenodo.17370834
Pied rigide avec grand support rectangulaire pour insertsThorlabsMP15MInstallation du microscope à deux photons
Plateforme d’Opération d’Anesthésie pour Petits AnimauxRWD Life Science Inc.R510-PGLSystème isoflurane
Pommade oculaire lubrifiante apaisanteBausch + LombInstallation du microscope à deux photons
Lames de microscope Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Installation du microscope à deux photons

Références

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