Isolement et quantification des ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux et RTddPCR

Summary

Cette étude présente une méthode robuste pour isoler les ARNm axonaux à l’aide d’inserts membranaires poreux, permettant la séparation totale des neurones par rapport aux neurites et la purification de l’ARN. Combiné à RTddPCR, cette approche permet une quantification absolue des transcrits à faible copie, facilitant les études sur le transport et la traduction locale de l’ARNm avec une grande sensibilité, une grande reproductibilité et une large applicabilité expérimentale.

Abstract

La dynamique spatiale de la localisation et de la translation de l’ARNm au sein des neurones est essentielle pour divers mécanismes de fonctionnement neuronal, notamment la connectivité neuronale, la plasticité synaptique et la réponse aux blessures. En raison de la polarité extrême des neurones, beaucoup de ces fonctions dépendent de la capacité des axones à traduire localement des transcrits spécifiques. Cependant, la quantification de ces populations d’ARN subcellulaire reste techniquement complexe. Ici, nous décrivons une approche reproductible pour obtenir des compartiments somatiques et enrichis axonalement séparés à partir de neurones de rongeurs cultivés et pour quantifier l’expression d’ARNm spécifique aux compartiments. Des neurones embryonnaires ou adultes primaires ont été cultivés sur des inserts avec une membrane poreuse de taille 1 à 3 μm. Ces membranes ne sont permissives qu’aux axones, permettant la séparation physique des compartiments somatique et axonal. L’ARN a ensuite été isolé séparément de l’ensemble du neurone et des fractions enrichies en axons, qui ont ensuite été utilisées pour la PCR numérique par gouttelettes de transcriptase inverse (RTddPCR) avec des amorces spécifiques à chaque gène. Ce système offre une comparaison absolument quantitative entre compartiments subcellulaires, permettant une détection à haute sensibilité des transcrits localisés. Cette approche mesure l’abondance d’ARN à régime permanent et facilite l’examen des changements de l’ARN axonal au fil du temps en réponse à des facteurs neurotrophes, au stress ou aux modèles de lésions. La combinaison de la compartimentation physique et de l’analyse RTddPCR réduit la contamination croisée et donne des nombres exacts de copies de transcrits rares, offrant une grande sensibilité, une grande reproductibilité et la détection d’ARNm à faible nombre de copies qui contrôlent la croissance et la régénération des axones. Cette méthode fonctionne également avec des tests en aval, tels que la mesure de la synthèse des protéines, l’étude de la stabilité de l’ARN et la réalisation d’expériences de perturbation utilisant du siRNA ou des médicaments bloquant certaines protéines. Il est important de noter que cette technique peut être adaptée à différents sous-types neuronaux, stades de développement ou modèles de lésions. En général, cette approche est une méthode flexible, sensible et reproductible pour étudier la base moléculaire de la localisation de l’ARNm axonal et comment elle affecte la fonction neuronale et les mécanismes de la maladie.

Introduction

Les neurones sont l’une des cellules les plus complexes et polarisées en biologie. Ils ont de longs processus qui peuvent parfois dépasser un mètre. Cette polarité complique la communication cellulaire et l’homéostasie des protéines de manière distincte. Une approche affinée pour répondre à ces exigences consiste à transporter les ARNm vers des compartiments éloignés tels que les axones et les dendrites, facilitant ainsi leur traduction de manière régulée en réponse aux signaux ^{localisés 1,2,3}. La traduction locale permet aux axones de synthétiser des protéines de manière spatiotemporelle. Ce processus est crucial pour le développement axonal, la plasticité synaptique, la régénération après une blessure, et les réponses aux stimuli développementaux et^{extracellulaires} 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

La capacité à analyser les fonctions des ARNm localisés dans les axones est cruciale pour comprendre leur rôle tant dans la fonction neuronale normale que dans le contexte de la physiopathologie. La dysrégulation de la translation de l’ARNm axonal a été liée à diverses maladies^{neurodégénératives16}, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA⁾17,18,19, l’atrophie musculaire spinale (SMA^)20,21 et la maladie d’Alzheimer (MA⁾²². La régénération axonale après une lésion dépend fortement de la traduction rapide et précise des protéines cytosquelettiques, des molécules de signalisation et des récepteurs 3,23,24,25,26,27,28. Malgré ces concepts novateurs, la discipline continue de rencontrer des difficultés pour quantifier et capturer efficacement les populations d’ARNm spécifiques aux axons.

L’un des défis de la transcriptomique axonale est de faire séparer proprement le soma et les axones. Comme la plupart des ARNm sont enrichis dans le soma, même de petites quantités de contamination provenant du corps cellulaire peuvent influencer les résultats lors de l’évaluation du contenu axonal d’un ARNm particulier. Les techniques conventionnelles, y compris les chambres microfluidiques 29,30,31,32 ou les chambres Campenot 33, permettent une croissance axonale directionnelle et une séparation claire entre les deux compartiments, mais le rendement axonal peut être trop faible pour des études biochimiques telles que le séquençage de l’ARN en vrac (RNA-seq), la co-immunoprécipitation de l’ARN suivie du séquençage de l’ARN, ou la réaction en chaîne quantitative de la polymérase (qPCR). L’ARN-seq en vrac et la qPCR, bien que bénéfiques, manquent fréquemment de la sensibilité requise pour identifier avec précision les transcrits à faible copie dans les axones, ce qui conduit à une estimation erronée des espèces physiologiquement significatives.

Pour relever ces défis, nous et d’autres avons utilisé des inserts membranaires perméables pour la séparation physique des axones et des somates 34,35,36,37,38,39,40,41. Ces inserts permettent aux neurones de se développer sur une surface microporeuse, et les axones peuvent s’étendre dans le compartiment inférieur à travers eux, mais pas dans le soma. Cette architecture basique mais efficace permet de cultiver un grand nombre de neurones avec une séparation physique claire du soma et des axones. La méthode à membrane est importante car elle évite les problèmes techniques liés aux dispositifs microfluidiques et fournit de grandes quantités de matière axonale pouvant être utilisée pour des études moléculaires et biochimiques. Le système d’inserts est également facile à utiliser pour des choses comme les blessures mécaniques, ce qui le rend utile dans de nombreux contextes expérimentaux liés à la réparation neuronale. La méthode décrite ici optimise davantage le rendement et la pureté neuronales en affinant les conditions de culture, en ajustant les caractéristiques des pores membranaires et en intégrant la validation basée sur la PCR numérique des gouttelettes transcriptase inverse (RTddPCR) pour des échantillons d’ARN axonal à faible rendement.

Il est également important de s’assurer que les fractions axonales sont pures. Nous n’extravons les axones de la chambre inférieure qu’après avoir soigneusement retiré tout matériau somatique restant de la surface supérieure. La validation des amorces montre un fort enrichissement des marqueurs axonaux et aucun marqueur somatique, voire négligeable. La confirmation moléculaire renforce cette distinction : les fractions axonales sont enrichies en ARNm axonaux reconnus tels que Gap43, et une expression plus faible d’Actγ⁴². Cela montre que le système d’insertion produit des échantillons axonaux contenant une teneur négligeable en soma, qui sont bons pour un examen plus approfondi.

Après avoir isolé les fractions axonales enrichies, l’obstacle suivant consiste à mesurer les ARNm présents en nombre de copies extrêmement faible. Le faible matériau de départ issu des fractions axonales et la présence de faible nombre de mRNA dans les axones repoussent les limites de sensibilité de la PCR quantitative conventionnelle à transcriptase inverse (RT-qPCR), qui utilise des courbes standard pour la quantification. De plus, la RT-qPCR ne fournit pas non plus les numéros absolus de copies d’un transcription spécifique. RTddPCR, en revanche, sépare les échantillons d’ADNc en milliers de gouttelettes, ce qui aide à obtenir un nombre exact de transcrits grâce aux statistiques de Poisson. Cela permet de trouver de manière fiable des transcrits, même si seules quelques copies de ces transcrits peuvent être présentes dans un seul nanogramme d’ARN^total 5,6,7,43.

Dans ce manuscrit, nous proposons une approche simplifiée, incluant des méthodes pour cultiver différents neurones adultes ou embryonnaires de rongeurs sur des inserts, l’isolement de l’ARN provenant de compartiments enrichis par neurone entier versus enrichi axonalement, la vérification de la pureté axonale, et la quantification absolue des copies d’ARNm basée sur RTddPCR. Ces méthodes peuvent être utilisées pour déterminer les niveaux de certains ARNm spécifiques, qui se localisent dans les axones dans des conditions basales, et comment ils évoluent lors de l’axotomie ou en réponse à la stimulation des facteurs de croissance ou à des signaux neurotoxiques. En combinant cette méthode avec les co-immunoprécipitations protéiques, on peut également évaluer la dynamique des complexes de protéines ribonucléaires (RNP) dans les axones. Par exemple, nous avons largement utilisé cette méthode pour étudier les ARNm présents dans les granules axonales de la protéine liant la protéine activatrice de la GTPase Ras (G3BP1). G3BP1 est un composant central des granules^{de stress 44}, et nos études précédentes ont montré qu’il inhibe la synthèse des protéines axonales et, à son tour, bloque à la fois la régénération des axones du SNP et du^{SNC 5}. De plus, cette méthode peut être utilisée pour étudier le rôle de la dysrégulation de la translation axonale dans diverses pathologies, notamment la SLA, l’AMS et la MA.

L’objectif de cette étude est de créer et de tester une méthode sensible, reproductible et évolutive pour mesurer les ARNm axonaux. En combinant des cultures compartimentées à base d’inserts avec la quantification basée sur RTddPCR, nous offrons au champ une solution aux problèmes persistants de transcriptomique axonale. Cette méthodologie permettra non seulement des découvertes essentielles concernant la traduction locale, mais établira également une base pour des recherches translationnelles axées sur les interventions thérapeutiques dans la réparation neuronale et la neurodégénérescence.

Protocol

1. Préparation des inserts pour l’ensemencement des cellules

1. Placez les inserts avec la taille de pore appropriée dans une plaque à 6 puits.
   REMARQUE : Utilisez une taille de pore de 1 μm pour séparer les axones du soma et une taille de pore de 3 μm pour séparer toutes les neurites (axones et dendrites) du soma.
2. Ajoutez 100 μg/mL de poly-L-lysine (PLL) à la plaque à 6 puits de façon à ce qu’elle touche le fond des inserts et le haut des inserts (2 mL/puits et 1 mL/insert).
3. Incubez toute la nuit à 37 °C.
4. Lavez les puits (le fond des inserts) et le haut des inserts avec de l’eau ultrapure stérile - 4 lavages × 5 minutes.
5. Pour les neurones du ganglion dorsal (DRG) uniquement, ajoutez 5 μg/mL de laminine (2 mL/puits et 1 mL/insert) et incubez pendant au moins 1 heure à 37 °C. Assurez-vous que le haut et le dessous de l’insert soient bien recouverts de façon uniforme.
6. Laver avec du sérum physiologique phosphaté (PBS) stérile (pH 7,4) contenant 100 U/mL de pénicilline/streptomycine - 2 lavages × 5 minutes.
7. Procéder à la dissection et à semer environ 1 × 10 cellules⁶/insert pour les neurones corticals^{embryonnaires 5},^{hippocampiques 45} et les neurones cholinergiques du cerveau antérieur^{basal 31,32}. Pour les DRG de rats adultes, placez 6-8 DRGs/insert ^5,7 (Figure 1).

2. Collection de fractions neuronales subcellulaires à partir d’inserts à 6 puits

1. Une aliquote de 250 μL de TRIzol chacun dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL par insert et un puits/insert d’une plaque à 6 puits. Mets ça de côté.
2. Dans une autre plaque à 6 puits, ajoutez 2 mL/puits de PBS stérile. Le nombre de puits/plaques doit être proportionnel au nombre d’inserts.
3. Aspirez les milieux de culture du haut et du bas de l’insert et transférez l’insert sur une plaque à 6 puits contenant du PBS.
4. À l’aide de pinces, placez délicatement l’insert et ajoutez 2 mL de PBS par-dessus. Aspirez les médias du haut et du bas de l’insert et répétez. Au total, lavez deux fois avec du PBS et laissez-le dans du PBS frais (1 mL et 2 mL respectivement en haut et en bas de l’insert).
5. Isolement de la fraction entière du neurone
   1. À l’aide d’un grattoir cellulaire stérile, grattez toute la fraction neuronale (le haut de l’insert). Appliquez juste assez de pression pour que les cellules commencent à se détacher, mais que la membrane ne se brise pas (Figure 1).
   2. Prélever le neurone entier de l’insert et le transférer dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
   3. Centrifugez le tube à 10 000 à 15 000 g pendant 2 minutes.
   4. Jetez le surnageant et résuspendez le lysat à 250 μL de TRIzol.
   5. Étiquetez ce tube comme la fraction neuronale entière.
   6. Continuez la collecte de fractions de neurite.
6. Isolation de la fraction de neurite
   1. Prenez un coton tige-tige stérile et, à l’aide d’une extrémité, déplacez-vous en zigzag de haut en bas très lentement sur tout le côté des neurones. Faites pivoter l’insert de 90 degrés et répétez le processus avec l’autre extrémité du prélèvement (si vous utilisez un coton-couvillon double face, ou utilisez un nouveau tampon pour un cochon simple côté). Jetez ce prélèvement (Figure 1).
   2. Utilisez un nouveau coton-couvillon et avancez en cercles concentriques, en commençant par le milieu de l’insert et en s’étendant vers l’extérieur. Assurez-vous aussi de nettoyer les murs (circonférence).
   3. Inversez l’insert de membrane (côté neurite vers le haut) et coupez la membrane avec une nouvelle lame de scalpel stérile tout en la tenant avec une pince. Veillez à laisser ~2-3 mm en périphérie.
   4. Placez la membrane coupée dans la plaque à 6 puits contenant du TRIzol avec le côté neurite orienté vers le bas. Assurez-vous qu’elle est submergée.
   5. Collectez le TRIzol contenant le lysat de neurite à partir de la plaque à 6 puits et transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
7. Pour les lysats du neurone entier et des neurites, procédez à l’isolation de l’ARN ou conservez les lysats à -80 °C pour les traiter plus tard.

3. Isolement et quantification de l’ARN

1. Isolation de l’ARN
   REMARQUE : Pour cette partie, travaillez toujours dans un environnement sans RNase avec des ustensiles plastiques stériles dédiés et des gants.
   1. Ajoutez 0,2 mL de chloroforme pour 1 mL de TRIzol, secouez vigoureusement pendant 15 secondes, puis faites couver pendant 2-3 minutes à température ambiante. Centrifugez à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour les séparer en couches : organique, interphase et aqueuse (contenant ARN).
   2. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, évitant ainsi l’interphase. Pour précipiter l’ARN, ajoutez 1 volume d’isopropanol et mélangez doucement. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante (ou plus longtemps à -20 °C pour un rendement plus élevé) pour précipiter l’ARN. Centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour pelleter l’ARN.
   3. Jetez le surnageant et lavez la pellete avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Un court vortex et centrifugeuse à 7 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
   4. Dissoudre l’ARN : Retirez soigneusement le lavage à l’éthanol et laissez sécher le pellet à l’air libre pendant 5 à 10 minutes, évitant ainsi une sécheresse complète. Resuspendez le pellet dans un petit volume d’eau sans RNase ou 1x tampon Tris-EDTA (TE), en incubant à 55-60 °C pour une dissolution complète. Stockez de l’ARN purifié à -80 °C.
2. Quantification de l’ARN à l’aide du test RiboGreen
   REMARQUE : Le test RiboGreen (ci-dessous) utilise un colorant fluorescent spécifique aux acides nucléiques, offrant une sensibilité, une spécificité supérieures et la capacité de détecter l’ARN intact par rapport aux méthodes d’absorption UV. Envisagez un traitement par DNase si la contamination par ADN est un problème.
   1. Préparez 1x tampon TE, diluez le tampon TE 20x fourni 20 fois avec de l’eau sans RNase. Préparez les solutions de travail RiboGreen et protégez la teinture photosensible avec du papier aluminium. Diluez le colorant concentré à 1:200 en 1x TE pour le test à haute portée (10 ng/mL-1 μg/mL), ou 1:2000 en 1x TE pour le test à basse portée (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Préparez des standards ARN par dilution sérielle de l’étalon ARN du kit en 1x TE pour couvrir la plage d’échantillons attendue. Exécuter les standards en triple exemplaire.
   2. Préparez les échantillons en diluant des échantillons d’ARN dans 1x TE pour s’adapter à la plage dynamique du test. Analysez les échantillons en triple exemplaire.
   3. Ajoutez des volumes égaux de solution de travail RiboGreen et un standard ou échantillon d’ARN (par exemple, 100 μL chacun). Incubez pendant 2 à 5 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Mesurez la fluorescence en utilisant les réglages appropriés (excitation ~500 nm, émission ~525 nm). Mesurez et soustrayez une lecture vierge de réactif (1x TE + colorant RiboGreen).
   4. Analyser et quantifier : tracer une courbe standard en utilisant les valeurs de fluorescence des étalons par rapport à leurs concentrations. Utilisez cette courbe pour déterminer la concentration d’ARN dans les échantillons (Figure 2).

4. Synthèse de l’ADNc

1. Dégelez tous les composants sur la glace. Mélangez doucement chaque tube en les faisant tourner et en les faisant tourner brièvement avant de l’utiliser. Dans un tube PCR sur glace, combinez les composants suivants pour chaque réaction :
   RT master mix (5x) : 4 μL
   Échantillon d’ARN : variable (jusqu’à 1 μg d’ARN total)
   Eau sans nucléase : jusqu’à 20 μL de volume total
   REMARQUE : Pour un contrôle sans gabarit (NTC), remplacer l’échantillon d’ARN par de l’eau sans nucléase.
2. Mélangez doucement et faites tourner les tubes pour recueillir le contenu au fond et lancez le programme thermocycleur.
   Recuissage des apprêts : 25 °C pendant 2 minutes
   Synthèse d’ADNc : 55 °C pendant 10 minutes
   Inactivation thermique : 95 °C pendant 1 minute

5. Conception et validation des amorces

REMARQUE : La conception des amorces RTddPCR suit généralement les mêmes principes que la qPCR quantitative, mais nécessite une attention supplémentaire pour assurer une séparation claire des gouttelettes positives et négatives. Utilisez des outils de conception d’apprêts de NEB, IDT ou ThermoFisher pour faciliter ce processus. Un test RTddPCR réussi se définit par une grande spécificité et une amplification robuste, ce qui génère une séparation nette entre les gouttelettes amplifiées (positives) et non amplifiées (négatives). Les identifiants d’accession NCBI RefSeq suivants ont été utilisés pour concevoir les amorces PCR :

Acte : NM_001127449.1
Attaquant 1 : CAGTCTAACAGGGGGGGAAAG
Revers 1 : CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Longueur de l’amplicon : 98
Avant 2 : GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Revers 2 : GACTTTCCCCCCCTGTTAGAC
Durée de l’amplicon : 118

Écart 43 : NM_017195,3
Attaquant 1 : GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Revers 1 : GACTCCTCAGAACGGAACAT
Longueur de l’amplicon : 122
Attaquant 2 : CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Revers 2 : CATTGCACACACACACTTGG
Longueur de l’amplicon : 116

1. Concevez un apprêt avec la longueur recommandée de 18-30 paires de bases et une teneur en GC de 40-60 %. Assurez-vous que la température de fusion (Tm) se situe entre 55 et 65 °C, et que les amorces avant et arrière soient à moins de 2 à 5 °C l’une de l’autre. Incorporez une pince GC, une ou deux bases G ou C dans les cinq dernières bases à l’extrémité 3′, pour améliorer la spécificité de la liaison, mais évitez de longues séries de G ou C.
2. Validez la spécificité des amorces en utilisant des outils d’alignement tels que le National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) afin de garantir que les amorces ne se lient qu’à la séquence cible prévue. La conception ampliconne entre 50 et 200 paires de bases, avec ~100 paires de bases optimales, car les produits plus courts amplifient plus efficacement tout en restant distinguables des amorces-dimers.
   REMARQUE : Dans cette étude, les produits PCR courts sont généralement amplifiés avec une efficacité supérieure à ceux des produits plus longs en RT-ddPCR.
3. Minimisez les dimères d’amorce en concevant des amorces contenant 50-60 % de GC, en évitant les structures secondaires et en complémentant 3'. Lors de la validation de l’amorce, utilisez l’électrophorèse sur gel d’agarose, et utilisez toujours un contrôle sans gabarit pour évaluer les dimères amorces.
4. Évitez de concevoir des amorces dans des régions du gabarit présentant un risque élevé de formation de structures secondaires, car cela peut interférer avec l’efficacité de l’amplification.

6. RTddPCR

REMARQUE : Utilisez le système QX200 ddPCR (Bio-Rad) pour effectuer la RTddPCR selon les instructions du fabricant et comme décrit précédemment par Das et al. (2022)⁴³, avec quelques ajustements mineurs pour améliorer la reproductibilité des tests.

1. Préparez les réactions RTddPCR avec un mélange universel prêt à l’emploi et des amorces spécifiques à la cible en utilisant l’ADN intégré approprié.
2. Générez les gouttelettes en utilisant le générateur de goutteles.
3. Lisez la fluorescence du point d’arrivée avec le lecteur de gouttelettes et analysez les données avec le logiciel intégré.
4. Employer les mesures de contrôle qualité suivantes pour garantir une quantification précise et la formation de gouttelettes reproductibles :
   1. Faites fonctionner des ensembles d’amorces de façon constante sur la même rangée ou colonne pour minimiser les effets de plaque.
   2. Préparez des mixages maîtres pour réduire la pipétation de petits volumes.
   3. Pipette à faible débit pour éviter les bulles et utilise des pipettes multicanaux pour une distribution uniforme des échantillons.
   4. Manipulez doucement les plaques après la génération des gouttelettes et scellez immédiatement pour éviter l’évaporation.
   5. Préparez toutes les réactions sur la glace et évitez les cycles répétés de gel-dégel pour les réactifs.
   6. Inclure des contrôles sans gabarit pour chaque ensemble d’amorce afin de surveiller la contamination.
   7. Excluez les puits contenant moins de 10 000 gouttelettes acceptées de l’analyse.
   8. Effectuez des réplications techniques pour tous les échantillons afin d’assurer leur reproductibilité.
5. Inspectez manuellement les graphiques d’amplitude de fluorescence des gouttelettes pour vérifier la précision du seuil automatique.

Results

Les neurones corticaux des rongeurs embryonnaires primaires, les neurones hippocampiques et les BFCN placés sur des inserts de 1 μm recouverts de PLL adhèrent solidement et étendent les neurites à travers la membrane pendant 5 à 7 jours in vitro (DIV). À 11 DIV, les cultures présentent des réseaux denses. Pour les DRG de rats adultes, ajouter une couche de laminine à des inserts de 3 μm recouverts de PLL permet d’obtenir une extension axonale comparable de 5 DIV. Ces observations confirment la capacité des inserts à soutenir la croissance neuronale à long terme et à fournir suffisamment de matériel axonal pour l’extraction d’ARN en aval. En cas de besoin d’échelle, nous combinons plusieurs inserts pour fournir suffisamment de matériau.

L’extraction de TRIzol à partir d’inserts individuels permet de produire suffisamment d’ARN pour la transcription inverse et la ddPCR ultérieure. La quantification RiboGreen confirme des rendements ARN constants provenant des fractions entières des neurones (212,85 ng/insert) et des rendements plus faibles provenant des fractions de neurite (42,75 ng/insert) (Figure 2). On obtient généralement ~5 à 7 fois l’ARN provenant de la fraction entière du neurone par rapport à la fraction enrichie par neurite.

Tous les amorces sont validés avant les expériences RTddPCR. Pour chaque transcript cible, au moins deux ensembles d’amorces sont ordonnés et testés à l’aide de la PCR conventionnelle sur cDNA généré à partir des mêmes échantillons neuronaux. La paire d’amorce produisant la bande la plus forte et la plus spécifique est sélectionnée pour la RTddPCR (Figure 3A). Par exemple, nous avons choisi l’ensemble d’amorces 1 pour Gap43. Dans les cas de résultats ambigus, comme ceux obtenus pour Actγ, nous réalisons une PCR en gradient pour optimiser les températures de recuit (Figure 3B). Cela garantit que seuls des amorces bien validés sont utilisés pour la quantification absolue, réduisant ainsi la probabilité d’artefacts lors de la séparation des gouttelettes.

La procédure de grattage et de prélèvement sépare de manière fiable les compartiments somatiques et névritiques. L’ARN isolé de l’ensemble des fractions neuronales montre un enrichissement de transcriptes, tels que Actγ 46,47,48,49 (Figure 4). En revanche, les fractions d’axons/neurite produisent un ARN total nettement plus faible, cohérent avec leur volume restreint, mais montrent un enrichissement de transcrits connus pour se localiser dans des processus distals, tels que Gap43 (Figure 4). Une détection croisée minimale des transcrits restreints par soma indique une grande pureté compartimentée lorsque les inserts sont manipulés avec soin et placés à une densité optimale.

Les résultats positifs se caractérisent par : (1) une morphologie neuronale intacte avec une extension axonale claire, (2) une séparation nette des compartiments sans rupture de la membrane, (3) des amorces validées produisant une séparation nette entre gouttelettes positives et négatives, et (4) des signaux RTddPCR forts pour les transcrits axonaux. Des expériences sous-optimales entraînent un faible rendement d’ARN, une contamination croisée attestée par des marqueurs de soma dans les fractions de neurites, ou des artefacts RTddPCR tels qu’une augmentation de la « pluie » de gouttelettes due à la dimérisation de l’amorce. Ces problèmes sont le plus souvent liés à des dommages à la membrane d’insert, à une pression de grattage excessive ou à une optimisation insuffisante de la température de recuit des amorces.

Figure 1 : Aperçu de l’isolation de l’ARN spécifique au compartiment à l’aide d’inserts membranaires. Les neurones des rongeurs ont été cultivés sur des inserts semi-perméables d’une taille poreuse de 1 à 3 μm, ce qui permet l’extension des neurites tout en restreignant le soma. Pour la préparation du neurone entier, les cellules du compartiment supérieur ont été grattées à l’aide d’un grattoir stérile, comprimées, puis lysées dans du TRIzol pour l’isolement de l’ARN, la synthèse d’ADNc et la RTddPCR. Les débris cellulaires résiduels ont été retirés de la membrane d’insertion à l’aide d’un coton-tige stérile. Pour la préparation des neurites, la membrane d’insertion contenant désormais uniquement des neurites a été inversée et coupée avec une lame de scalpel, puis directement immergée dans le TRIzol, suivie d’une isolation d’ARN, d’une synthèse d’ADNc et d’une RTddPCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Courbe standard de concentration d’ARN à l’aide du test RiboGreen. (A) L’intensité de fluorescence a été mesurée à l’aide du test de quantification de l’ARN RiboGreen à travers une série de dilution d’étalons d’ARN. Une analyse de régression linéaire a révélé une forte corrélation entre la concentration d’ARN et le signal de fluorescence (R² = 0,9956). La valeur R² proche de un démontre une excellente linéarité et fiabilité du test RiboGreen pour une quantification précise de l’ARN. (B) À l’aide de l’équation (y=19,738x + 14,905) pour la pente obtenue dans A, l’ARN total a été calculé pour chaque fraction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Validation de l’amorce par PCR et électrophorèse sur gel d’agarose. (A) Les produits d’amplification par PCR utilisant cDNA pour Actγ et Gap43 ont été résolus sur un gel d’agarose à 2 % pour évaluer la spécificité de la primer. Pour chaque gène, deux ensembles d’amorces indépendants (ensemble 1 et ensemble 2) ont été testés. Les marqueurs de taille de l’ADN (échelles) sont affichés dans les voies adjacentes avec des poids moléculaires indiqués (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Des bandes simples distinctes de taille attendue confirment une amplification réussie et la spécificité des ensembles d’amorces sélectionnés. (B) L’amplification par PCR a été réalisée à l’aide d’un amorce Actγ placé 2 sur un gradient de température (55-65 °C) afin de déterminer la température optimale de recuit. Les produits amplifiés ont été résolus sur un gel d’agarose à 2 % à côté d’une échelle ADN (voie 2, tailles indiquées). Des bandes uniques constantes de la taille attendue ont été observées sur toute la plage testée, l’amplification la plus forte étant détectée à 55 °C, ce qui suggère que c’est la température optimale pour cet ensemble d’amorces. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Analyse RTddPCR de transcrits sélectionnés et quantification des copies d’ARNm. (A,B) Graphiques d’amplitude unidimensionnelle représentatifs montrant la séparation des gouttelettes pour (A) Actγ et (B) Gap43. Chaque point représente une gouttelette unique, les gouttelettes bleues indiquant l’amplification positive et les gouttelettes grises indiquant l’amplification négative. L’axe Y représente l’amplitude, et l’axe X indique la position du puits dans la plaque ddPCR. Une séparation nette entre les gouttelettes positives (bleues) et négatives (grises) confirme une détection robuste des transcriptions cibles avec les ensembles d’amorces indiqués. (C) Tableau résumant le nombre de copies/μL et les copies par ng d’ARN total pour les transcriptes Actγ et Gap43 dans les fractions de neurones entiers et de neurites. Les estimations du nombre de copies ont été obtenues à partir de quantification absolue à l’aide des comptages de gouttelettes ddPCR (illustrés dans les panneaux A, B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Plusieurs étapes sont cruciales pour la reproductibilité. Le revêtement de l’insert doit être uniforme pour favoriser l’adhésion neuronale ; Un revêtement incomplet entraîne une mauvaise croissance des neurites/axons. La densité de placage cellulaire est tout aussi importante, car une densité excessive augmente le croisement dendritique, tandis qu’un placage clairsemé produit un RN axonal insuffisant. La séquence de grattage et de prélèvement doit être réalisée avec précision : trop peu de pression laisse une contamination somatique, tandis qu’une pression excessive risque d’endommager l’insert.

La validation de l’amorce représente une autre étape cruciale. L’exécution de deux ensembles d’amorces indépendants pour chaque transcript permet de sélectionner la paire la plus fiable, tandis que la PCR à gradient peut encore affiner les températures de recuit. Cette pratique réduit la formation d’amorce-dimère, augmente la clarté des gouttelettes et assure une quantification reproductible à travers les réplications biologiques. Bien que cette approche atteigne une haute pureté compartimentée, la contamination trace par le matériau somatique ne peut être totalement exclue. Les rendements d’ARN axonal sont intrinsèquement faibles, limitant la portée des analyses nécessitant une forte entrée, comme le séquençage complet du transcriptome. Une limitation critique de cette méthode est son incapacité à traiter la localisation des transcrits entre les axones distaux et proximaux. Bien que des extensions gliales ou endothéliales par les pores membranaires aient été rapportées dans certaines conditions, notre système de culture minimise cette possibilité. Dans les cultures adultes de DRG, l’ajout de cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)^5,7 et l’utilisation de milieux sans sérum pour d’autres cultures neuronales (corticales, hippocampiques et BFCN)^5,45 restreignent efficacement la prolifération des cellules gliales et endothéliales. De plus, les membranes rigides en polycarbonate ou polyéthylène téréphtalate (PC/PET) utilisées ici sont non élastiques et non permissives à la migration cellulaire active. De plus, nous utilisons des inserts de taille de pore de 3 μm pour les cultures DRG afin de permettre le passage d’axones de grand diamètre. En revanche, pour les cultures corticales ou BFCN, nous utilisons des inserts de pore de 1 μm, ce qui restreint encore la migration de la glia. Ces propriétés distinguent notre installation des microdispositifs à base de PDMS qui soutiennent la migration endothéliale via des pores flexibles. Conformément aux rapports^antérieurs 34,35,36,40, la validation moléculaire dans cette étude confirme un fort enrichissement des transcrits axonaux (par exemple, Gap43) et une détection négligeable de marqueurs somatiques (par exemple, Actγ), soutenant la spécificité neuronale du matériau traversant la membrane. Comme la contrainte physique n’abolit pas complètement la migration des glies, les chercheurs devraient également utiliser Gfap comme marqueur négatif.

Comparé aux dispositifs microfluidiques, le système d’insertion est plus simple, plus évolutif et compatible avec les flux de travail de culture courants. Il évite les équipements spécialisés tout en permettant une séparation axon-soma reproductible. En couplant les inserts avec RTddPCR, cette méthode offre à la fois accessibilité et une grande sensibilité, permettant la quantification absolue de transcrits souvent en dessous des seuils de détection de la qPCR. Ce protocole est particulièrement adapté pour sonder les modifications de la localisation des transcriptes axonaux, évaluer la translation locale en réponse à des stimuli développementaux, neurotoxiques ou de lésions, ainsi qu’étudier les défauts de transport de l’ARN impliqués dans les maladies neurodégénératives ou troubles neurodéveloppementaux. Les améliorations futures pourraient inclure la RTddPCR multiplexée pour la quantification simultanée de plusieurs ARNm, ou l’intégration avec des approches de séquençage d’ARN à faible entrée pour élargir la couverture transcriptomatique. De plus, l’adaptation de ce système pour les neurones humains dérivés de l’iPSC pourrait étendre ses applications à la modélisation des maladies et aux études régénératives.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inserts de culture cellulaire pour plaque à 6 puits, 1,0 & nbsp ; &mu ; m Taille des pores, stérile	Corning	353102	Consommables
Inserts de culture cellulaire pour plaque à 6 puits, 3,0 & nbsp ; &mu ; m Taille des pores, stérile	CELLTREAT	230603	Consommables
Élévateur à cellules avec lame étroite	VWR	76036-006	Consommables
Plaques de culture tissulaire à 6 puits CELLSTAR	VWR	82050-842	Consommables
ddPCR Plaques à 96 puits   ;	Bio-rad	12001925	Consommables
ddPCR Huile de lecteur de gouttelettes   ;	Bio-rad	1863004	Réactifs
Cartouches DG8 pour générateur de gouttelettes QX200/QX100	Bio-rad	1864008	Consommables
Laminine	Gibco/Fisher Scientific	23017-015	Réactifs
LunaScript RT SuperMix Kit	NEB	E3010L	Réactifs
Microplaques pour noirs à base de fluorescence à 96 puits	Thermo Fisher	M33089	Consommables
Étanchéité thermique de la plaque PCR, feuille d’aluminium, perforable	Bio-rad	1814040	Consommables
Poly-lysine	Sigma	P1274	Réactifs
PTC Tempo 96 Thermal Cycler	Bio-rad	12015382	Équipement
Logiciel QuantaSoft	Bio-Rad		Logiciels d’analyse de données PCR
Kit de test Quant-it RiboGreen et de test ARN	Thermo Fisher	R11490	Réactifs
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio-rad	1864034	Réactifs
Huile de génération de gouttelettes QX200 pour EvaGreen	Bio-rad	1864005	Réactifs
Générateur de gouttelettes QX200	Bio-rad	17005227	Équipement
Lecteur de gouttelettes QX200	Bio-rad	17005228	Équipement
Réactif de Trizol	Invitrogen	15-596-026	Réactifs