Modèles animaux standardisés induits par l’instabilité pour les études précliniques de l’arthrose

Résumé

Ce protocole vise à établir des modèles animaux adaptés à la recherche sur l’arthrose.

Résumé

En tant que maladie articulaire la plus répandue au monde, l’arthrose du genou (ARO) représente un fardeau sanitaire mondial important, ce qui a conduit à des recherches approfondies sur sa pathogenèse et ses stratégies de traitement. Malgré de nombreuses études, les méthodologies standardisées pour l’établissement des modèles restent insuffisantes. Ainsi, pour combler cette lacune, nous présentons des protocoles complets et reproductibles pour développer des modèles animaux d’arthrose induits par l’instabilité, en particulier le modèle de déstabilisation du ménisque médian (DMM) chez la souris et le modèle de déchirure du ménisque médial (MMT) chez les rats. De plus, nous décrivons une procédure simple et facilement mise en œuvre pour évaluer les seuils de douleur postopératoire et la stabilité spatiale de la démarche, visant à promouvoir la cohérence méthodologique dans la recherche préclinique sur l’arthrose. La validation histologique et comportementale a confirmé le succès des deux modèles, les scores de l’Osteoarthritis Research Society International (OARSI) étant nettement élevés, la longueur de foulée significativement modifiée, et les seuils de douleur mécanique sensiblement réduits dans les groupes DMM et MMT par rapport aux témoins, indiquant une dégénérescence articulaire prononcée et une hypersensibilité. Ces résultats de validation soulignent la reproductibilité et la pertinence translationnelle des deux modèles. Ainsi, en fournissant une documentation vidéo détaillée, ce travail favorise la normalisation procédurale et facilite la cohérence entre laboratoires, améliorant ainsi la fiabilité et la comparabilité des résultats de recherche en OA.

Introduction

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire dégénérative très répandue et l’une des principales causes d’incapacité dans le^{monde 1,2}. Malgré de nombreuses recherches, le développement de médicaments OA modificateurs de la maladie (DMOAD) efficaces a été relativement lent³. Il est désormais largement reconnu que l’AOA est une maladie multifactorielle impliquant des modifications pathologiques complexes dans plusieurs tissus péri-articulaires, notamment le cartilage articulaire, l’os sous-chondral, les tendons et le^{synovium 4,5}. Une recherche préclinique efficace sur les divers processus pathologiques de l’arthrose nécessite l’utilisation de modèles animaux bien définis et appropriés. Bien qu’une variété de modèles animaux d’AAO aient été établis et^rapportés 6,7,8,9,10,11, de nombreuses études continuent d’utiliser des modèles animaux inadaptés, limitant la pertinence translationnelle de leurs résultats. Pour répondre à cette problématique, nous présentons des modèles standardisés d’OA induit par l’instabilité, incluant les procédures de déstabilisation reproductible du ménisque médian (DMM) et de déchirure du ménisque médian (MMT), sous un format vidéo servant de référence pratique pour la recherche préclinique sur l’arthrose et la standardisation des modèles.

Comme rapporté dans des études antérieures, l’instabilité méniscelle est un facteur majeur contribuant à la dégénérescence de l’articulation du genou dans les cas cliniques. Par conséquent, l’instabilité ménisscale induite chirurgicalement chez la souris et le rat constitue une approche efficace pour l’induction expérimentale de l’OA. Dans ce contexte, nous présentons deux modèles représentatifs d’OA induits par l’instabilité, incluant le modèle DMM chez la souris et le modèle MMT chez les rats. Le modèle DMM chez la souris est particulièrement précieux pour étudier les mécanismes moléculaires de l’OA, car celles-ci sont susceptibles de manipuler les transgènes, et ce modèle présente une progression progressive et prolongée de la maladie, imitant étroitement l’OA humaine. Cependant, il est important de noter que le modèle DMM est moins adapté aux études portant sur les altérations pathologiques de l’os sous-chondral, où des modèles alternatifs peuvent offrir une meilleure pertinence translationnelle.

De plus, nous avons établi le modèle MMT chez les rats pour compléter le modèle DMM chez la souris. La procédure MMT induit des lésions structurelles plus étendues impliquant à la fois le cartilage articulaire et l’os sous-chondral, reflétant ainsi mieux les caractéristiques pathologiques avancées de l’arthrose observées en milieu clinique. Cela rend le modèle MMT chez le rat particulièrement adapté à la bio-ingénierie et à la recherche translationnelle, y compris l’évaluation de biomatériaux, de thérapies régénératives et de systèmes d’administration de médicaments ciblant la réparation articulaire. Bien que les techniques chirurgicales MMT et DMM aient été décrites dans des études antérieures, il subsiste un manque de protocole visuel complet, étape par étape, garantissant la standardisation, la reproductibilité et la précision technique dans les laboratoires de recherche. Ainsi, pour combler cette lacune, nous avons développé une démonstration détaillée basée sur la vidéo illustrant chaque étape critique de l’établissement du modèle, de la préparation animale aux soins postopératoires. De plus, nous introduisons deux méthodes d’évaluation comportementale couramment utilisées, l’une pour évaluer le seuil de douleur et une autre pour analyser la stabilité spatiale de la marche afin de fournir un cadre cohérent pour l’évaluation fonctionnelle après l’induction de l’arthrose. Ainsi, en intégrant les protocoles chirurgicaux et comportementaux, ce manuscrit vise à promouvoir la standardisation méthodologique dans la recherche préclinique sur l’arthrose (OA), améliorant ainsi la comparabilité des données et la pertinence translationnelle entre les études.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux directives du Comité d’éthique et de bien-être animal de l’Université médicale chinoise du Zhejiang et ont été approuvées sous le protocole numéro IACUC-20251020-11. Pour la chirurgie DMM, des mâles C57BL/6 souris âgées de 10 à 12 semaines ont été utilisés, tandis que des rats mâles Sprague-Dawley pesant entre 200 et 225 g ont été sélectionnés pour la procédure MMT. Tous les animaux ont été hébergés dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes (SPF) et ont bénéficié d’une période d’acclimatation d’une semaine avant l’expérimentation. Les conditions d’élevage standard ont été maintenues, avec la nourriture, l’eau et la litière remplacées au moins deux fois par semaine afin d’assurer le bien-être animal et la cohérence expérimentale.

1. Préparation animale

1. Administrez une analgésie appropriée (par exemple, buprénorphine) avant la chirurgie conformément aux directives institutionnelles. Anesthésiez l’animal à l’aide d’un anesthésique inhalatoire (par exemple, 2 % d’isoflurane à 0,4 L/min avec un débit de gaz frais de 4 L/min dans une chambre d’induction) et maintenez l’anesthésie tout au long de la procédure via un cône nasal. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en veillant à l’absence de réflexe de retrait des pédales.
2. Appliquez une bande de 2 à 3 mm de pommade ophtalmique lubrifiante dans le sac conjonctival de la paupière inférieure et massez doucement la paupière pour assurer une répartition uniforme de la pommade sur la surface oculaire.
3. Rasez la fourrure autour de l’articulation droite du genou et désinfectez le site chirurgical à l’aide d’une procédure de nettoyage en trois étapes avec de la povidone-iode suivie d’un éthanol à 70 %. Placez l’animal sur une table d’opération stérile.

2. Chirurgie DMM chez la souris

REMARQUE : Cette procédure induit une déstabilisation articulaire en transperceant le ligament méniscotibial médial (MMTL), mis en évidence en rouge dans la Figure 1, qui ancre normalement le ménisque médian au plateau tibial.

1. Placez la souris anesthésiée en position couchée et réalisez une petite incision cutanée parapatulienne médiale (environ 3-5 mm) au-dessus du genou droit.
2. Disséquez soigneusement les tissus mous qui le surplombent pour exposer la capsule articulaire. Réalisez une incision médiale au tendon rotulien et déplacez doucement la rotule latéralement pour visualiser l’articulation du genou. Confirmez que le MMTL apparaît comme une fine bande ligamentaire reliant la corne antérieure du ménisque médial au plateau tibial. Utilisez un stéréomicroscope pour améliorer la visualisation et minimiser le risque d’endommager le cartilage articulaire.
3. Tranchez soigneusement l’attache tibiale du MMTL à l’aide de micro-ciseaux, d’une lame de scalpel #11 ou d’une aiguille de seringue pliée. Lors de l’utilisation d’une aiguille de seringue pliée, le bord émoussé aide à protéger le cartilage articulaire sous-jacent. Confirmez la transection réussie en observant la déstabilisation résultante du ménisque médian.
4. Fermez la capsule articulaire incisée avec 8-0 Sutures absorbables, suivies de la fermeture de l’incision cutanée avec des clips de plaie ou des points 6-0.
   REMARQUE : Veillez à ne pas percer ou endommager le cartilage articulaire lors de la suture et veillez à ce que la tension articulaire soit correctement maintenue lors de la fermeture de l’incision.
5. Laissez l’animal récupérer sur un coussin chauffant et surveillez-le de près jusqu’à ce qu’elle retrouve une mobilité complète.

3. Chirurgie MMT chez le rat

REMARQUE : Cette procédure induit l’arthrose en créant une déchirure complète du ménisque médian après la transection du ligament collatéral médial (MCL), générant ainsi une instabilité articulaire et une dégénérescence progressive du cartilage.

1. Positionnez le rat anesthésié de manière appropriée et réalisez une incision parapatulienne médiale, d’environ 6 à 8 mm de long, au-dessus du genou droit.
2. Effectuez une dissection contondante pour séparer les couches musculaires et exposer clairement le LCM (Figure 2).
3. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, transpercez complètement le LCM à son point médian.
4. Rétractez doucement le MCL sectionné pour exposer le ménisque médian sous-jacent. À l’aide de pinces fines, saisir le ménisque et effectuer une transection à toute épaisseur à sa région la plus étroite pour créer une déchirure complète.
5. Repositionnez les tissus mous et refermez l’incision en couches, en utilisant des points de suture 5-0 absorbables pour le muscle et le fascia, suivis de clips de plaie ou de sutures 5-0 non absorbables pour la fermeture de la peau.
6. Laissez l’animal récupérer en suivant la même procédure décrite à l’étape 2.5.

4. Évaluations comportementales

1. Effectuer des évaluations de base avant l’opération et des évaluations répétées à des moments postopératoires désignés (par exemple, 2, 4 et 8 semaines).
   REMARQUE : Pour minimiser la variabilité entre opérateurs, des tests comportementaux ont été réalisés par le même opérateur formé qui a été aveuglé par le regroupement expérimental. Chaque mesure a été répétée trois fois par animal, et la valeur moyenne a été utilisée pour l’analyse.
   1. Test de seuil de retrait mécanique simplifié
      1. Placez les souris dans des compartiments individuels sur une plateforme surélevée en treillis métallique et laissez-les s’acclimater pendant au moins 30 minutes avant le test. La sensibilité mécanique à la douleur est ensuite évaluée à l’aide d’un anesthésimètre électronique von Frey.
      2. À l’aide d’un filament de Von Frey, appliquez la sonde sur la surface plantaire de la patte arrière droite de la souris et augmentez progressivement la force^{de 12}.
      3. Notez la réaction, en notant qu’une réaction positive est signalée par un retrait soudain de la patte, des sursautes ou des léchages. Évaluer la présence ou l’absence d’une réponse cohérente afin d’évaluer les changements de sensibilité au fil du temps.
   2. Analyse de l’allure
      1. Utilisez un système automatisé d’analyse de la démarche pour l’évaluation.
      2. Laissez l’animal marcher volontairement sur la passerelle vitrée de l’appareil. Définissez un essai valide comme un essai où l’animal avance à un rythme régulier sans pause. Attendez que le logiciel système identifie automatiquement les empreintes de pattes et calcule plusieurs paramètres de démarche. Analysez les indicateurs clés pour le membre postérieur droit (opéré), y compris la durée de phase de la posture, la vitesse de balancement et la pression de la patte, et comparez-les à ceux du membre controlatéral et des contrôles opérés par simulation.
         REMARQUE : Tous les animaux ont été acclimatés à l’appareil de test avec des séances d’entraînement quotidiennes avant l’évaluation de base. Pour chaque animal, trois courses ont été enregistrées par moment précis, et seuls les essais où l’animal a maintenu une vitesse constante sans pause ont été considérés comme valides. Toutes les mesures ont été effectuées par des opérateurs entraînés selon un design en double aveugle afin de minimiser la variabilité entre opérateurs, et les répétitions ont été moyennées pour garantir la reproductibilité des données.

Résultats

Caractérisation et validation du modèle souris DMM OA
Après une période d’acclimatation d’une semaine, le modèle d’arthrose (OA) induite par DMM chez la souris a été établi selon la procédure illustrée à la Figure 1. Des évaluations pathologiques et comportementales ont été réalisées deux semaines après l’opération. Comme montré à la Figure 2A, les changements dégénératifs les plus prononcés étaient localisés à l’articulation fémorotibiale mé...

Discussion

Ce protocole fournit un cadre standardisé pour l’induction et l’évaluation de deux modèles chirurgicaux d’AOS largement utilisés. Ces modèles sont particulièrement précieux car ils reproduisent étroitement les caractéristiques physiopathologiques de l’arthrose post-traumatique humaine, offrant ainsi une forte pertinence translationnelle. Le modèle DMM implique la transection du ligament méniscotibial médian, tandis que le modèle MMT implique une déchirure directe du ménisque médian. Dans...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’analyse de la démarche	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposique			Pommade ophtalmique
Souris	Institut des animaux modèles de Nankin	C57/BL6
Système de test de la douleur	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	Anesthésiomètre électronique de von Frey
Rat	Institut des animaux modèles de Nankin	S/D