Caractérisation des traits stomatiques et épidermiques à l’aide de peelings, de dégagement et d’analyse d’images basée sur l’IA

Résumé

Ce protocole propose une méthode comparative pour évaluer les traits stomatiques et épidermiques de deux espèces distinctes à l’aide de peelings épidermiques, de techniques de dégagement et d’analyse d’images assistée par IA. L’objectif est de permettre une quantification à haut débit et reproductible des structures cellulaires sous-jacentes à la fonction stomatique pour des applications agricoles et la recherche végétale à grande échelle.

Résumé

Une caractérisation précise de la morphologie stomatique et des traits épidermiques environnants est essentielle pour comprendre la fonction stomatique. Un protocole comparatif est présenté à l’aide de deux techniques complémentaires — peelings épidermiques et défrichage des feuilles — pour évaluer la taille, la forme et la densité des cellules stomatiques et épidermiques chez deux espèces de dicolétônes écologiquement distinctes, Fraxinus excelsior et Taraxacum officinale. Le protocole comprend des étapes détaillées pour la préparation de l’échantillon, l’imagerie et la quantification des traits utilisant des mesures manuelles coûteuses et en main-d’œuvre (déblaiement et peeling des tissus), ainsi qu’une analyse d’images assistée par IA, avec le potentiel de faciliter des applications à haut débit. Trois outils de segmentation — un modèle de détection stomataire basé sur YOLOv8, un outil généraliste d’apprentissage profond pour la segmentation cellulaire, et un classificateur basé sur des pixels — ont été évalués pour leur précision et leur adéquation entre différentes méthodes. Des différences significatives dans les traits stomatiques et épidermiques sont constamment observées entre les techniques de peeling et de débouchage dans les analyses manuelles et IA. Les outils d’IA ont permis la quantification reproductible, avec le modèle de détection stomatique basé sur YOLOv8 (StoManager1) qui a le meilleur rendu pour les traits stomataux et un outil généraliste d’apprentissage profond pour la segmentation cellulaire (Cellpose) pour la segmentation épidermique. La détection des traits basée sur l’IA était très cohérente chez T. officinale mais limitée chez F. excelsior, les résultats divergant encore des mesures manuelles, illustrant comment l’anatomie spécifique à chaque espèce et la qualité d’image impactent l’adéquation des méthodes. Ces résultats suggèrent que, bien que l’analyse assistée par IA fournisse un cadre utile pour la quantification des traits stomatiques et épidermiques, la validation par des experts et les tests pilotes restent essentiels avant une application plus large ou à haut débit.

Introduction

Les stomates sont des pores microscopiques de l’épiderme qui jouent un rôle vital dans la régulation de l’échange gazeux et de la transpiration des plantes. Ainsi, comprendre la base morphologique du fonctionnement stomatique est essentiel pour améliorer la performance des cultures¹. Bien que la plupart des études sur la structure et la fonction des stomates se concentrent uniquement sur la morphologie stomatale, une compréhension complète de la réactivité stomatique nécessite également la caractérisation de la taille et de la forme des cellules épidermiques environnantes. La quantification précise de ces caractéristiques est fondamentale pour comprendre les relations structure-fonction sous-jacentes à l’échange gazeux et à l’amélioration des cultures.

À mesure que l’amélioration des cultures repose de plus en plus sur des approches avancées d’édition génétique, il est crucial de comprendre les traits morphologiques clés – tels que les stomates – qui influencent la photosynthèse, l’efficacité intrinsèque de l’utilisation de l’eau et le gain de carbone. Ce besoin est particulièrement pressant face aux changements environnementaux en cours, car la demande pour des cultures résilientes qui conservent à la fois la capacité photosynthétique et le rendement augmente face à des sécheresses et des vagues de chaleur plus^{fréquentes 2,3}. Par conséquent, il existe un besoin important de protocoles standardisés d’imagerie et d’analyse. Le peeling stomatal avec du vernis ou du vernis est la méthode la plus simple pour obtenir des empreintes de surface foliaire afin de mesurer la taille, la forme et la densité des stomates et^{de l’épiderme 4,5,6}. Sa procédure est rapide, non destructive, permettant un traitement rapide des échantillons. La méthode de défrichage tissulaire est une approche alternative permettant la caractérisation simultanée du réseau veineux et, potentiellement, une caractérisation plus complète de l’hydraulique foliaire.

Le déblaiement chimique adoucit et rend les tissus optiquement transparents, permettant l’imagerie in situ des stomates et des cellules épidermiques sans perturbation mécanique. Le déblaiement est largement applicable à divers types de tissus, y compris des spécimens séchés ou délicats, et peut être utilisé non seulement pour l’imagerie stomatique mais aussi pour la visualisation de réseaux de nervations, l’imagerie par fluorescence et les structures anatomiques^internes 7,8,9,10,11,12 , permettant ainsi d’analyser les traits stomatiques aux côtés d’autres traits fonctionnels. Différentes méthodes de dégagement existent, incluant des solvants organiques, des solutions aqueuses, l’hyperhydratation ou l’incorporation d’hydrogel^{13, 14, 15}. Celles-ci diffèrent en durée, compatibilité d’imagerie et disponibilité des réactifs. Le protocole utilisé ici est simple, rentable et ne nécessite aucune compétence spécialisée. Les deux techniques sont peu coûteuses et rapides comparées à des méthodes plus laborieuses comme la microscopie optique ou la microscopie électronique à balayage, qui nécessitent la fixation chimique, l’implantation et le coupement des échantillons.

Les méthodes traditionnelles d’analyse des caractéristiques stomatiques et épidermiques reposent souvent sur la segmentation manuelle des images microscopiques, qui est laborieux, chronophage et sujette à des biais de l’observateur, limitant ainsi le débit et réduisant l’efficacité du pipeline^{d’analyse 16}. De plus, des caractéristiques anatomiques telles que les trichomes et des parois cellulaires irrégulières posent des défis supplémentaires à la quantification cohérente des traits. Bien que les outils d’analyse d’images automatisés offrent un grand potentiel pour l’extraction de données à haut débit, ils ont été optimisés pour des tissus spécifiques de la plante et ne sont pas facilement transférables entre types de feuilles et méthodes de préparation. Par exemple, StoManager1 (Figure supplémentaire 1) offre une grande précision dans la détection des stomates à l’aide d’un modèle de détection d’objets basé sur YOLOv8, mais est spécifiquement entraîné pour les traits stomataux. Cellpose (Figure supplémentaire 2) est un grand modèle de segmentation généraliste pré-entraîné qui fonctionne bien lorsque les données d’entrée ressemblent à ses modèles pré-entraînés (par exemple, cyto, cyto2), basés à l’origine sur des cellules animales et des organites. Ilastik (Figure supplémentaire 3) est un outil de classification basé sur les pixels s’appuyant sur des annotations définies par l’utilisateur. Cellpose et Ilastik sont tous deux conviviaux, mais chacun peut nécessiter un réentraînement ou un ajustement fin pour s’adapter aux variations de qualité d’image, aux artefacts de fond et aux caractéristiques spécifiques aux tissus.

De plus, la morphologie stomatique et épidermique présente une grande variabilité chez l’espèce¹⁷. Des caractéristiques telles que la densité et la taille des stomates sont particulièrement variables, mais elles sont généralement inversement liées et déterminent ensemble les différences entre espèces dans la cinétique stomatale. Les stomates plus grands peuvent en partie compenser une densité plus faible, mais ils présentent généralement une cinétique 5 plus lente^, ce qui peut être désavantageux lors de vagues de chaleur de plus en plus fréquentes, où les réponses rapides des stomates sont essentielles pour maintenir l’assimilation du carbone et prévenir une perte excessive d’eau. Dans son ensemble, cette variabilité complique la mesure des traits stomataux et peut compromettre la validité du protocole sélectionné ainsi que la robustesse des résultats basés sur l’IA.

Ce protocole intègre deux techniques classiques de préparation — peelings épidermiques et clearings chimiques — avec des outils modernes d’intelligence artificielle (IA) et d’apprentissage automatique (ML) pour la segmentation et la mesure des traits. En utilisant deux espèces de dicolétolénes courantes nécessitant de la lumière et avec des stratégies écologiques contrastées (F. excelsior et T. officinale), nous avons examiné la variabilité des traits stomatiques et épidermiques afin d’évaluer comment trois méthodes se comparent et où des imprécisions potentielles peuvent survenir. Les performances de trois outils d’IA : StoManager1 (un modèle d’apprentissage profond basé sur YOLOv8 pour la détection stomatique), Cellpose (un outil généraliste de segmentation par apprentissage profond) et ilastik (un classificateur pixelisé pour les tissus épidermiques) ont été évaluées. Cette approche intégrative permet une quantification reproductible et à haut débit des traits stomataux et épidermiques, offrant un cadre robuste et évolutif pour l’analyse phénotypique tant en recherche écologique qu’agricole. Cependant, des caractéristiques anatomiques telles que des trichomes denses, des cuticules épaisses ou un faible contraste des frontières cellulaires peuvent réduire la précision de segmentation et doivent être prises en compte lors du choix entre les approches de peeling et de clearing ainsi que lors de l’application de la quantification basée sur l’IA.

À notre connaissance, il s’agit du premier protocole étape par étape qui compare directement les approches de peeling épidermique et de nettoyage chimique combinées à plusieurs outils de segmentation basés sur l’IA pour la quantification des traits stomatiques et épidermiques. En combinant les techniques classiques de microscopie avec des flux de travail ML accessibles, le protocole réduit le biais de l’utilisateur, augmente le débit et facilite le phénotypage reproductible entre espèces. Cela rend l’approche largement applicable à l’écologie, à l’amélioration des cultures et à la recherche sur le changement climatique, et fournit une base pour l’expansion continue des outils par le réentraînement des modèles ou l’apprentissage par transfert.

Protocole

REMARQUE : Aucun permis ou approbation spécifique n’a été requis pour la collecte des feuilles de T. officinale et F. excelsior , car ces espèces non protégées ont été prélevées dans des jardins accessibles au public. La collecte de tous les échantillons a respecté les directives institutionnelles et locales.

1. Collecte de matières végétales

1. Sélectionnez des feuilles saines pour une analyse comparative. Pour l’expérience actuelle, des feuilles matures saines, exposées au soleil, de deux espèces de dicothésées présentant une répartition stomatale contrastée ont été sélectionnées : l’arbre hypostomateux F. excelsior, qui ne porte des stomates que sur la surface inférieure de la feuille, et la graminée vivace amphistomate T. officinale.
2. Pour chaque type/emplacement d’échantillon, prenez 3 à 5 feuilles répliquées.
3. Détachez la feuille avec des ciseaux propres ou une lame de rasoir. Placez immédiatement la feuille coupée dans l’eau pour éviter la déshydratation.
4. Après la collecte, immergez complètement le pétiole dans l’eau et conservez-les à 4°C.
5. Procéder aux sections 2 ou 3 du protocole dans les 48 heures.

2. Préparation et observation des peelings d’impression de stomates

REMARQUE : Tous les déchets chimiques générés lors du protocole de déminage ont été traités conformément aux réglementations institutionnelles et locales de sécurité. Les solutions contenant du glutaraldéhyde ont été collectées séparément et éliminées comme déchets chimiques dangereux. Les solutions d’hydroxyde de sodium (NaOH) ont été neutralisées à un pH de 6-8 avant leur élimination, lorsque cela est autorisé. Des solutions d’eau de Javel diluées et d’éthanol ont été jetées dans les égouts avec de grandes quantités d’eau froide dans les endroits où les réglementations institutionnelles et municipales l’autorisaient. Les solutions TBO étaient collectées et éliminées sous forme de déchets chimiques conformément aux directives locales. Les utilisateurs doivent consulter leur bureau de sécurité institutionnelle pour obtenir des procédures d’élimination approuvées.

1. Si nécessaire, rincez doucement la surface de la feuille sélectionnée avec de l’eau pour enlever la poussière ou les débris. Séchez immédiatement la surface de la feuille avec du papier filtre ou un essuie-tout doux pour éliminer l’excès d’humidité. Ne pas sécher à l’air libre, car cela peut entraîner un rétrécissement du tissu, entraînant des mesures de taille inexactes des stomates et des cellules épidermiques.
2. Étiquetez la lame du microscope avec les détails de l’échantillon (par exemple, espèce, côté feuille et date de préparation) à l’aide d’un marqueur permanent afin d’assurer la traçabilité de chaque échantillon lors de l’imagerie, de l’analyse et de l’interprétation des données, et de permettre un stockage approprié de l’échantillon pour une utilisation future.
3. Pour les espèces présentant des tricomes non glandulaires (velus), retirez les tricomes de la surface foliaire avec une lame de rasoir avant la préparation du pelage, car leur présence peut obscurcir les limites cellulaires et réduire la qualité de l’image (Figure 1).
4. À l’aide d’un petit pinceau, appliquez une fine couche uniforme de vernis à ongles transparent et non extensible (évitez les formules « élastiques » ou « décollantes ») sur la zone ciblée. Choisissez toujours la partie centrale de la feuille pour la préparation de l’écorche, en évitant la pointe et la base.
5. Laissez sécher complètement le vernis (généralement 2 à 5 minutes à température ambiante). Une exposition prolongée peut provoquer une décoloration tissulaire (par exemple, une teinte rouge sur les feuilles plus douces), qui peut être visible lors de l’écaillage final, et interférer avec les analyses en aval nécessitant une coloration uniforme.
6. Une fois sec, appliquez une bande de ruban transparent sur la zone revêtue. Commencez par un bord du vernis à ongles, puis déposez progressivement le ruban sur la surface, en appuyant doucement pour assurer une bonne adhérence et éviter les bulles d’air ou les plis. Portez des gants en nitrile pour éviter les empreintes digitales.
7. Retirez soigneusement le ruban avec le film de vernis à ongles (empreinte épidermique).
8. Placez le ruban (côté collant vers le bas) sur une lame de microscope propre, en évitant les plis ou les chevauchements.
9. Conservez les lames préparées à température ambiante, à l’abri de la poussière et du soleil direct.
10. Examinez la lame sous un microscope à lumière composée à un grossissement de 400x. Enregistrez les images selon le guide logiciel, ainsi que l’échelle correspondante.

3. Préparation et observation des sections dégagées

1. Feuilles coupées d’environ 1^{cm 2}. Effectuez toutes les étapes en portant des gants en nitrile et en travaillant sous une hotte à fumée.
2. Transférer les échantillons dans un flacon marqué, les recouvrir d’une solution fixante (aldéhyde glutarique à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M, pH = 6,9) (PRÉCAUTION), et conserver à 4 °C pendant 24 heures (Tableau 1, préparation de la solution fixante).
3. Retirez la solution fixante avec une pipette et couvrez les échantillons d’eau distillée. Laissez partir pendant 30 minutes. Répétez trois fois (Figure 2A-C).
4. Retirez l’eau et couvrez les échantillons avec une solution de NaOH de 1 M (dissoudre 20 g de NaOH dans 0,5 L d’eau distillée).
5. Lors du défrichage des feuilles, la solution de NaOH devient verte. Remplacez la solution NaOH une fois par jour par une solution fraîche. Poursuivre pendant 3 à 4 jours, ou jusqu’à ce que les échantillons deviennent jaune pâle et que la solution de NaOH reste claire (Figure 2D-F).
6. Retirez la solution de NaOH et recouvrez les échantillons d’eau de Javel (5 % de NaClO). L’eau de Javel domestique commerciale avec cette concentration est appropriée.
7. Faites éclore les échantillons dans de l’eau de Javel pendant 1 à 2 minutes. Les échantillons deviendront blancs et translucides (Figure 2G-I).
8. Retirez la solution précédente et couvrez les échantillons d’eau distillée pendant 2 minutes. Déshydratez les échantillons à l’aide d’une série distillée-éthanol graduée comme suit : 75:25, 50:50, 25:75 et 100 % d’éthanol.
9. Retirez l’éthanol et recouvrez les échantillons d’une solution alcoolisée à 3 % de toluidine bleu O (TBO, dissoudre 3 g de TBO dans 100 mL d’éthanol à 100 %). Pars pour la nuit.
10. Retirez la solution de coloration et couvrez les échantillons d’éthanol à 100 % pendant 2 minutes. Répétez cette étape en utilisant une série d’eau distillée graduée et d’éthanol comme suit : 25:75, 50:50, 75:25, et enfin de l’eau distillée (Figure 2J-L). Consultez la Figure 3 pour les erreurs courantes et les étapes de dépannage associées au processus de débarrassage.
11. Gardez les échantillons dans de l’eau distillée à 4°C avant l’observation.
12. Transférez les échantillons sur une lame en verre, ajoutez une goutte d’eau distillée, puis couvrez avec une gaine de verre pour une vision microscopique et une imagerie.
13. Examinez la lame sous un microscope à lumière composée à un grossissement de 400x. Enregistrez les images selon le guide logiciel, ainsi que l’échelle correspondante. Voir le tableau des documents pour plus d’informations.

4. Analyse et mesures d’image

1. Utilisez Fiji²³ (distribution ImageJ, version 1.54p) pour le traitement et l’analyse d’image.
2. Avec l’outil Ligne, tracez une ligne sur la barre d’échelle, puis sélectionnez Analyser > Échelle, modifiez la distance connue à la longueur de la barre d’échelle, et changez l’unité de longueur en μm.
3. Va dans l’analyse > des mesures de série. Assurez-vous que les options de zone et de diamètre de feret sont vérifiées.
4. Utilisez l’outil de sélection de polygones pour définir l’objet d’intérêt. Enregistrez la mesure en appuyant sur la touche M .
5. Mesurez les caractéristiques stomatiques et épidermiques suivantes aux Fidji et calculez à la fois pour les échantillons dégagés et les pelures stomatiques (Figure 3).
6. Calculez le nombre de stomates (Ns).
   1. Déterminez la surface stomate moyenne (As).
   2. Déterminer la largeur moyenne des stomates (Ws) : en utilisant le diamètre minimum de Feret.
   3. Calculez la densité stomatique (DE), selon la formule suivante :
      
      ; par unité Ia (la surface de feuille sélectionnée pour les mesures, mm²).
   4. Déterminez la surface moyenne des cellules épidermiques (Ae).
   5. Déterminez la densité cellulaire épidermique (ECD) à l’aide de la formule suivante :
      

5. Statistiques

1. Utilisez ANOVA et le test post-hoc HSD de Tukey pour tester les différences entre les groupes d’échantillons.
2. Effectuer toutes les analyses statistiques dans R²¹.
3. Analysez un total de 3 feuilles réplicatives par espèce, et observez 3 pelures de chaque feuille.

6. Analyse assistée par IA

1. Sélectionnez les outils d’apprentissage automatique pour la segmentation.
   1. Sélectionnez des outils de segmentation basés sur l’apprentissage automatique appropriés en fonction de la structure cible (stomates ou cellules épidermiques), de la qualité de l’image et des objectifs d’analyse.
   2. Utilisez un modèle d’apprentissage profond spécifique aux stomates pour la détection et la mesure automatisées des traits stomaticaux, et utilisez des outils généralistes d’apprentissage profond ou de segmentation pixelisée pour la segmentation cellulaire épidermique.
   3. Consultez la section Outils et logiciels d’apprentissage automatique pour des implémentations logicielles spécifiques (fichier supplémentaire).
   4. Effectuer des tests pilotes sur un sous-ensemble d’images avant une analyse à grande échelle afin d’évaluer la performance de segmentation et d’identifier les sources potentielles de faux positifs.
2. Préparez l’environnement informatique.
   1. Utilisez un poste de travail équipé d’un processeur de 8 à 12 cœurs, d’au moins 32 Go de RAM, et d’un GPU NVIDIA compatible CUDA avec un minimum de 24 Go de VRAM.
   2. Utilisez un écran haute résolution (de préférence 4K) pour faciliter l’annotation et l’inspection visuelle.
   3. Installez tous les outils logiciels sélectionnés selon les instructions des développeurs et enregistrez les versions des logiciels pour garantir leur reproductibilité.
3. Préparez des images pour l’analyse de l’apprentissage automatique.
   1. Importez des images de microscopie au format TIFF ou PNG, en utilisant des images en niveaux de gris 8 ou 16 bits lorsque possible.
   2. Assurez-vous que chaque image contient une barre d’échelle visible ou a été calibrée spatialement avant analyse.
   3. Sélectionnez les régions d’intérêt avec un minimum de débris, de plis ou de bulles d’air, une illumination uniforme, et des limites cellulaires clairement définies.
   4. Excluez les images avec des bords flous, des ombres fortes ou un faible contraste, car cela réduit la précision de segmentation.
4. Effectuer la segmentation stomatique.
   1. Chargez les images dans le modèle d’apprentissage profond spécifique aux stomates (section 1 du fichier supplémentaire).
   2. Configurez les paramètres de détection, y compris les limites de taille des objets et les seuils de confiance, selon l’espèce et la résolution de l’image.
   3. Exécutez une détection automatisée pour segmenter les complexes stomataux et extraire des métriques de sortie telles que le nombre de stomataux, la surface et les diamètres de Feret.
   4. Exportez des masques de segmentation et des tables de mesure pour l’analyse en aval. Inspectez visuellement les superpositions de segmentation et excluez manuellement les objets détectés incorrectement si nécessaire.
5. Effectuer la segmentation cellulaire épidermique.
   1. Chargez les images dans un outil généraliste de segmentation en apprentissage profond ou dans un classificateur basé sur des pixels (Section de fichiers supplémentaires 2 à 4).
   2. Entraînez ou affinez le modèle à l’aide d’images représentatives avec des exemples annotés manuellement des cellules épidermiques, des frontières cellulaires et du fond.
   3. Effectuez la segmentation pour générer des masques d’objets et exportez les masques pour un post-traitement dans ImageJ/Fiji ou un logiciel d’analyse d’images équivalent.
   4. Appliquez un filtrage basé sur la taille ou par quantile pour éliminer les petits objets faux positifs et vérifier la précision de segmentation par inspection visuelle avant d’extraire des métriques cellulaires épidermiques telles que la surface cellulaire et la densité cellulaire.
6. Documentez les paramètres et effectuez le contrôle qualité.
   1. Enregistrer toutes les versions logicielles, les paramètres de commande, les seuils de filtrage et les spécifications matérielles utilisées lors de l’analyse.
   2. Conserver les superpositions de segmentation représentatives pour documenter la qualité de la segmentation.
   3. Validez visuellement les résultats automatisés de segmentation avant l’analyse statistique ou le reporting des données.
7. Préparation d’image pour tout traitement ML
   1. Imagerie par échantillon
      REMARQUE : Parce que la segmentation basée sur le ML repose sur les gradients d’intensité, la continuité des arêtes et la géométrie cohérente de l’objet plutôt que sur un contexte biologique, le prétraitement de l’image et la sélection de la région déterminent de manière critique la performance du modèle et la structure de l’erreur.
      1. Capturez des images haute résolution des surfaces de feuilles dégagées ou épluchées avec une barre d’échelle visible. Pour de bons flux de travail d’apprentissage automatique, assurez-vous que les objets mesurables sont nets, continus et à fort contraste tout au long de l’image.
   2. Sélection des régions et qualité d’image
      REMARQUE : Après l’acquisition de l’image dans la Section 6.7.1, les images sont inspectées visuellement et, lorsque l’échelle le permet, des régions d’intérêt sans artefacts sont sélectionnées manuellement pour la segmentation en aval. Sélectionnez des régions d’intérêt avec un minimum d’artefacts (par exemple, débris, plis, bulles d’air, éclairage inégal). Pour les modèles stomataux (par exemple, StoManager1), privilégiez une visibilité claire des pores et une silhouette bien définie de la cellule de garde. Pour les modèles épidermiques (par exemple, Cellpose, ilastik), assurez-vous de gradients d’intensité stables le long des contours cellulaires ; Les bords discontinus ou à faible contraste réduisent considérablement la performance de segmentation. Les images avec des frontières mal définies doivent être exclues ou retraitées avant la segmentation.
   3. Format de fichier
      Sauvegarder les fichiers au format TIFF ou PNG (niveaux de gris 8 ou 16 bits recommandés pour la segmentation).
   4. Amélioration d’image optionnelle
      1. Accentuez le contraste ou soustrayez le fond dans ImageJ/Fiji si les frontières sont faibles.
      2. Concentrez-vous sur la géométrie des arêtes, car celles-ci peuvent créer de faux gradients interprétés comme des bordures de cellule.
      3. Appliquer ces ajustements de manière cohérente sur toutes les images d’un jeu de données.
         REMARQUE : Il convient de porter une attention particulière à la géométrie des contours, car les ombres, les auréoles ou les dégradés de fond irréguliers peuvent créer des transitions d’intensité artificielles que les modèles ML peuvent mal interpréter comme des bordures cellulaires.
8. StoManager1 (version interface graphique v1.0.0)
   REMARQUE : StoManager1 permet la détection, la mesure et l’analyse automatisées et à haut débit des stomates foliaires des plantes à l’aide de réseaux neuronaux convolutionnels (YOLOv8-seg-x). L’outil quantifie des métriques stomatiques clés (surface, densité, rapport pore/cellule de garde, indices d’agrégation, etc.) à partir de divers types d’images, réduisant ainsi l’effort manuel et les biais, et facilitant des études écologiques et physiologiques à grande échelle. Une application Windows conviviale est disponible, ne nécessitant aucune compétence en codage à l’exception d’un post-traitement optionnel (Section 1 du fichier supplémentaire⁾²³.
   1. Exécution de StoManager1 : installation et configuration
      1. Accès via GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) ou l’application Windows autonome ((Section 1 du fichier supplémentaire)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
      2. Assurez-vous de versions compatibles des bibliothèques (dépendances Python) ; des conflits peuvent survenir si d’autres logiciels ML/image sont installés.
   2. Démarrez StoManager1 via l’interface graphique ou l’interface en ligne de commande.
   3. Choisissez votre répertoire d’entrée contenant les images feuilles.
   4. sélection des modèles ; Consultez le modèle YOLOv8-seg-x pour des métriques plus détaillées basées sur la segmentation. Gardez cela non coché pour le modèle de boîte englobante (YOLOv3), moins de métriques.
   5. Réglage des paramètres ; Ajustez les seuils de détection, la résolution de l’image, la dilatation du masque et les limites de taille des objets selon les besoins pour votre modalité/espèce d’imagerie. Veuillez utiliser les paramètres par défaut, lorsque certains objets stomates restent indétectés, principalement (1) diminuer le seuil de confiance de détection pour récupérer plus de stomates véritables tout en vérifiant la détection de faux positifs ; et (2) augmenter la résolution de l’image, car une valeur plus élevée peut améliorer la détection de petits stomates au prix d’une demande computationnelle plus élevée.
   6. Segmentation des exécutions :
      1. Cliquez sur « Démarrer le processus » pour détecter, segmenter et mesurer les stomates et stomates entiers.
      2. Cliquez sur « Analyse statistique » pour traiter les statistiques au niveau du groupe.
   7. Collectez les résultats. La sortie est enregistrée sur YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (mode segmentation) ou directement sur YOUR_OUTPUT_PATH (mode englobation). Les fichiers CSV contiennent des métriques par objet et des mesures de résumé ; des masques et des images de résultats sont également générés.
   8. Lancer le traitement par lots.
   9. Une fois terminé, collectez la sortie : masques de segmentation et fichiers de résultats CSV par image. Les résultats par image incluent : nombre et aire stomatale, diamètre de Feret (max/min), métriques de cellules de garde, indices d’agrégation/uniformité/divergence et rapports pores/cellules de garde.
   10. Examinez les résultats en Excel, R ou Python pour des statistiques et des visualisations supplémentaires.
   11. Contrôle qualité ; Inspectez visuellement les masques et les superpositions. Supprimer les objets aberrants par taille, forme ou conservation manuelle si nécessaire (voir ci-dessous).
       REMARQUE : Les protocoles détaillés et les étapes de post-traitement pour Cellpose et ilastik sont fournis dans le fichier supplémentaire. Pour des performances optimales avec de grands ensembles de données et des images complexes, nous recommandons un système avec un processeur de 8 à 12 cœurs, au moins 32 Go de RAM, et un GPU compatible NVIDIA CUDA avec un minimum de 24 Go de VRAM. Un grand écran haute résolution (de préférence en 4K) est également fortement recommandé pour une annotation et une visualisation efficaces.

Résultats

Comparaison des résultats entre peeling et clearing

T. officinale et F. excelsior ont tous deux montré une variabilité des traits stomatiques et épidermiques selon que les échantillons étaient dégagés ou pelés (Figure 4). Les échantillons dégagés ont généralement permis de clarifier les limites cellulaires et de visualiser plus clairement la forme et l’ouverture des pores des cellules de garde, bien que des couches tissulaires chevauchantes aient parfois obscurci les stomates plus petits et des estimations biaisées de taille vers le haut. Chez F. excelsior, la surface et la largeur moyenne des stomates étaient significativement plus élevées dans les échantillons dégagés que dans les peelings, tandis que chez T. officinale aucune différence significative n’a été observée. La densité stomatique était significativement plus élevée dans les échantillons pelés de F. excelsior, tandis qu’aucun effet de méthode n’a été détecté chez T. officinale. La surface cellulaire épidermique ne différait pas entre les méthodes chez les deux espèces, mais la densité cellulaire épidermique était légèrement plus élevée dans les échantillons pelés de F. excelsior.

Dans l’ensemble, les différences dépendantes de la méthode étaient spécifiques à chaque trait et à l’espèce, ce qui suggère que le peeling offre une option fiable pour les mesures stomatiques, en particulier lorsque la taille des stomates varie (par exemple, dans les feuilles en développement), tandis que les traits épidermiques étaient largement inchangés (Figure 5).

Les résultats de l’IA et leur résonance avec les méthodes de peeling et de clearing

Le modèle spécifique aux stomates, StoManager1, détectait les stomates de manière plus fiable sur des images écaillées (Figure 6), tandis que la performance diminuait nettement sur les échantillons effacés (Figure 7). Pour évaluer davantage la performance de StoManager1 à travers les méthodes de préparation, nous avons comparé la détection des traits stomatiques chez T. officinale et F. excelsior à l’aide à la fois de peelings et d’images dégagées (Figure 8). Chez T. officinale, le modèle détectait de manière fiable la présence et la densité stomate à travers les méthodes de préparation. Cependant, les valeurs résultantes différaient significativement des mesures manuelles (Tableau 2 et Figures 5 et 8). La plupart des traits stomaticaux différaient significativement (p < 0,05) entre les échantillons pelés et les échantillons dégagés (Figure 8), indiquant que les pipelines de détection de l’IA sont très sensibles aux méthodes de préparation et nécessitent une validation minutieuse avant une application à grande échelle. En revanche, chez F. excelsior, la détection était limitée à la surface abaxiale en raison de l’absence de stomates adaxiaux, et dans les échantillons blanchis, la détection était incohérente, avec des faux positifs fréquents (Figure 8). Ces résultats mettent en lumière la forte influence des caractéristiques anatomiques spécifiques à chaque espèce et de la qualité de l’image sur l’efficacité des analyses basées sur l’IA. Des outils d’apprentissage automatique généralistes comme Cellpose (Figure 9A) et Ilastik (Figure 9B) ont segmenté les cellules épidermiques plus efficacement sur des images pelées que sur des images effacées. Cependant, les deux outils ont produit de nombreux faux positifs avec les deux techniques de préparation (peeling et clearing), surtout dans des conditions de faible contraste ou lorsque les contours cellulaires étaient flous. Dans de tels cas, des contours stomatiques ou épidermiques indistincts étaient souvent sur-segmentés en plusieurs minuscules objets mal classés comme cellules épidermiques individuelles (voir Figure 10). Par conséquent, le post-traitement est essentiel, non seulement pour éliminer les cas aberrants mais aussi par filtrage par quantiles supérieurs, afin de conserver les cellules identifiées de manière fiable.

Figure 1 : Éclats stomatiques de feuilles de F. carica avant et après le retrait des trichomes à l’aide d’une lame de rasoir. Les gros tricomes peuvent laisser des empreintes sur la pellicule, formant des poches d’air qui entraînent des surfaces inégales et entravent la mise au point constante (visibles sous forme de grands points gris). F. carica a été incluse comme une exception pour étendre le protocole aux feuilles poilues. (A) À un grossissement de 200x, l’image avant le retrait des trichomes est partiellement obstruée par les empreintes du trihome. (B) La qualité de l’image est améliorée après le retrait des trichomes. (C) À un grossissement de 400x avant le retrait du trihome, l’image est dans la plupart des cas obstruée par des empreintes de tricomes. (D) L’obstruction est minimale à l’image après le retrait des trichomes avec une lame de rasoir. Les barres d’échelle sont 100 μm (A, B) et 50 μm (C, D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Étapes consécutives du protocole de compensation. Des images représentatives de T. officinale, F. excelsior et F. carica illustrent les étapes successives du protocole de déminage. (A-C) Feuilles fraîches. (D-F) part après avoir approuvé avec NaOH. (G-I) part après avoir blanchi avec du NaClO. (J-L) feuilles après avoir teint avec du bleu de toluidine O. Cette aide visuelle montre l’apparence attendue de l’échantillon avant de passer à l’étape suivante et met en évidence la variabilité des protocoles entre les espèces. F. carica a été incluse comme espèce aberrante pour démontrer l’applicabilité des protocoles à une plus grande variété de morphologies foliaires et nerveuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Exemples de mesures des traits stomatiques et épidermiques. Les traits mesurés sont illustrés sur l’image comme suit : As = aire stomatique ; Ls = longueur stomatique ; Ws = largeur des stomates ; Ae = aire cellulaire épidermique. La densité stomatique et la densité cellulaire épidermique ont été calculées dans la zone marquée, comme décrit dans le protocole. Image à un grossissement de 400x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Comparaison des images obtenues avec le protocole de clearing et le protocole peeling. Images représentatives de T. officinale et F. excelsior comparant les images de dégagement et d’écaillage stomatique, montrant la visibilité et la variabilité de la taille et de la densité des cellules des stomates et de l’épiderme. Barre d’échelle 50 μm, et les images sont prises à un grossissement de 400x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Différences dans les résultats manuels de mesure des traits entre les protocoles de dégagement et de peeling. Diagrammes en boîte montrant des différences dans les traits stomatiques et épidermiques entre les méthodes de débouchage et de peeling épidermique chez T. officinale et F. excelsior. (A) Surface stomatique moyenne (B) largeur moyenne des stomates (C) densité stomatique (D) surface cellulaire épidermique moyenne, et (E) densité cellulaire épidermique. Les astérisques indiquent les niveaux de signification statistique (P < 0,05 ; *P < 0,01 ; **P < 0,001). La signification statistique a été évaluée à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc HSD de Tukey. Taille de l’échantillon par groupe : n = 3-5. Abréviations : As = aire stomate ; Ws = largeur des stomates ; SD = densité stomatique ; Ae = aire cellulaire épidermique ; ECD = densité cellulaire épidermique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Exemple de résultats de segmentation utilisant un modèle de détection stomate sur un échantillon de peeling. Résultat de segmentation StoManager1 pour un échantillon pelé de T. officinale (face inférieure d’une feuille mature exposée à l’ombre), montrant une bonne précision de détection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Exemple de résultat de segmentation utilisant un modèle de détection stomatique sur un échantillon dégagé. Résultat de segmentation StoManager1 pour un échantillon dégagé de T. officinale (face inférieure d’une feuille mature exposée à l’ombre), montrant une précision de détection réduite par rapport aux échantillons pelés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Différences dans les résultats de mesure des traits assistés par IA entre les protocoles de clearing et peeling. Diagrammes de boîtes montrant des mesures issues de l’IA de traits anatomiques stomataux à partir d’images traitées par StoManager1 chez T. officinale et F. excelsior. Les caractéristiques incluent la surface stomatique (As), la largeur stomatique (Ws), la longueur stomatique (Ls) et la densité stomatique (Ds). Les unités sont comme sur la Figure 5. La signification statistique a été évaluée à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc HSD de Tukey. Les astérisques indiquent les niveaux de signification statistique (P < 0,05 ; *P < 0,01 ; **P < 0,001). Taille de l’échantillon par groupe : n = 3-5. Abréviations : As = aire stomate ; Ws = largeur des stomates ; Ls = longueur stomatique ; Ds = densité stomatale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 9 : Captures d’écran montrant la segmentation avec un outil généraliste d’apprentissage profond et un classificateur basé sur les pixels. Segmentations d’échantillons de F. excelsior pelés (surface foliaire abaxiale) avec (A) un outil généraliste d’apprentissage profond (Cellpose (cyto2)) et (B) un classificateur pixelisé (ilastik). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 10 : Masque de segmentation Ilastik pour un échantillon pelé de F. excelsior (côté abaxial d’une feuille), montrant de nombreux faux positifs. Les petits points sont mal classés comme des cellules épidermiques distinctes. Lors du post-traitement, une inspection manuelle (visuelle) est nécessaire pour fixer des seuils basés sur la taille afin de filtrer efficacement les faux positifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Solution	Préparation	Dernier volume
Base pour le tampon 1	7,12 g (Na2HPO4 *2H2O) dans 200 mL de dist. H2O	200 mL
Base pour le tampon 2	7,12 g de Na2HPO 4 *2H2O) en 200 mL de dist. H2O	200 mL
Tampon phosphate	Mélangez 36 mL de base 1, 14 mL de base 2 + 50 mL de dist. H2O	100 mL
Solution fixative	Mélangez 9,25 mL de glutaraldéhyde à 5 % avec 12,5 mL de tampon phosphate et 28,25 mL de dist. H2O	50 mL

Tableau 1 : Recette pour la solution fixante²⁴. Composition des solutions utilisées dans cette étude.

Espèces	Côté	Méthode	Homme (As)	IA (As)	Homme (victoires)	IA (Ws)	Homme (Ls)	IA (Ls)
Fraxinus	Abaxial	Peel	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Abaxial	Autorisé	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Abaxial	Peel	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adaxial	Autorisé	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adaxial	Peel	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tableau 2 : Comparaisons indicatives sur les mesures manuelles et l’IA. ML (StoManager1) a mis à l’échelle les résultats. L’homme et l’IA indiquent, en conséquence, les résultats manuels et IA (StoManager1). Les unités sont comme sur la Figure 5. Les mesures manuelles et IA diffèrent considérablement. Certaines comparaisons ne sont pas disponibles pour diverses raisons, notamment l’absence de stomates (par exemple, F. excelsior adaxial) ou la détection échouée (par exemple, les stomates étaient plus difficiles à détecter dans des échantillons effacés en raison de contours cellulaires plus flous).

Figure supplémentaire 1 : Exemples d’erreurs courantes survenant lors du déblaiement des feuilles qui influencent les résultats. Images montrées à des fins de dépannage : (A) coloration inégale due à une réhydratation incomplète de l’échantillon lors de la section 3.10 ; (B) dommages mécaniques résultant d’une mauvaise manipulation de l’échantillon très fragile traité chimiquement ; (C) teinte verte au centre de l’échantillon due à un retrait incomplet de la chlorophylle lors de la section 3.5. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure complémentaire 2 : Exemple d’interface utilisateur de StoManager1. Capture d’écran de l’interface utilisateur de StoManager1 montrant la configuration des entrées et la table des résultats (à gauche), ainsi que les vues micrographiques avec les images originales (en haut à droite) et la superposition de détection stomatique (en bas à droite, surface adaxiale d’un échantillon pelé par T. officinale ). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure complémentaire 3 : Exemple d’interface utilisateur Cellpose. Capture d’écran de la segmentation de Cellpose en cours via l’interface graphique avec des paramètres ajustables (par exemple, sélection du modèle - modèle cyto2 pré-entraîné recommandé ou modèle personnalisé, seuils et calibration du diamètre cellulaire). L’annotation manuelle supervisée des cellules épidermiques met chaque cellule en valeur dans une couleur unique pour guider l’étalonnage du modèle. La superposition montre la segmentation d’un peeling épidermique abaxial de F. excelsior . Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure supplémentaire 4 : Processus de segmentation d’Ilastik. La superposition illustre la classification basée sur les pixels sur une image de peeling épidermique abaxial de F. excelsior . (A) Capture d’écran de la segmentation d’ilastik en cours montrant un entraînement supervisé avec des classes manuellement étiquetées : cellules épidermiques (jaune), contours cellulaires (bleu), et fond non épidermique comme les trichomes (rouge). (B) Capture d’écran montrant uniquement la classe de l’épiderme (jaune), illustrant comment le classificateur isole les cellules épidermiques individuelles. Notez la présence de multiples détections « minuscules » fausse positive, en particulier dans les régions à faible contraste ou à éclairage inégal. (C) Capture d’écran montrant uniquement la classe de contour (bleu), illustrant comment le classificateur isole les frontières cellulaires du tissu épidermique environnant. Notez que certains contours sont discontinus et que plusieurs détections « minuscules » de faux positifs se produisent, en particulier dans les régions à faible contraste ou à éclairage inégal. (D) Capture d’écran montrant la classe de fond. Le masque met en évidence les complexes stomatiques, les tricomes glandulaires et divers débris (rouge), tout en excluant les corps cellulaires épidermiques. De nombreuses petites détections faussement positives « minuscules » sont visibles dans les régions épidermiques, résultant d’artefacts en niveaux de gris et de mauvaises classifications de textures. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure complémentaire 5 : Paramètres d’entraînement Cellpose. Exemple de paramètres d’entraînement Cellpose (GUI) pour un échantillon de T. officinale validé (les deux surfaces de feuilles), montrant les paramètres par défaut du modèle avant l’ajustement. Le modèle cyto2 pré-entraîné est sélectionné, avec un taux d’apprentissage de 0,1 et 100 époques d’entraînement (valeurs par défaut), qui déterminent respectivement la vitesse de mise à jour des poids du modèle et le nombre de passages d’entraînement. Ces valeurs par défaut sont couramment modifiées (par exemple, taux d’apprentissage = 0,15 ; époques = 12) pour réduire le temps d’entraînement et adapter le modèle à la morphologie épidermique des plantes ; Cependant, des nombres d’époque plus bas peuvent réduire la performance de détection et augmenter les faux positifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure complémentaire 6 : Masque « étiquette » Cellpose. Application du masque « labels » Cellpose pour un échantillon pelé de F. excelsior (surface abaxiale de feuille), montrant le résultat d’un entraînement supervisé dans lequel chaque objet segmenté se voit attribuer un identifiant unique. Les cellules épidermiques (marquées e) dominent, tandis que des paires de cellules de garde stomatiques (marquées g) sont également détectées. Les faux positifs sont visibles lorsque les trichomes sont mal classés comme cellules épidermiques (en haut à gauche) ou stomates (en bas central), ainsi que des faux négatifs lorsque les cellules épidermiques restent non marquées sur certaines parties de l’image. Ce type de masque est utilisé pour la quantification en aval et l’affinement des modèles supervisés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure complémentaire 7 : Quantification des cellules épidermiques segmentées dans ImageJ/Fiji. Captures d’écran montrant la quantification des cellules épidermiques segmentées après la classification des pixels ilastik pour un échantillon pelé de F. excelsior (surface abaxiale de la feuille). (A) Dans le masque exporté, chaque cluster de pixels détecté correspond à une particule individuelle, permettant l’extraction automatique des métriques au niveau de l’objet (par exemple, superficie, périmètre, diamètres de Feret). La fenêtre des résultats (en bas) affiche des mesures brutes pour des milliers d’objets ; Notez le nombre exceptionnellement élevé de petites particules issues du bruit de points « minuscules » et des contours fragmentaires, indiquant la présence de nombreux faux positifs. Ces artefacts nécessitent un filtrage biologiquement informé ultérieur pour isoler les véritables cellules épidermiques avant une analyse statistique en aval. (B) Filtrage en surface des objets épidermiques segmentés dans ilastiks dans ImageJ/Fiji. Les petits fragments et le bruit sont exclus en appliquant un seuil de surface minimale de 150 à 350 μm², réduisant ainsi le nombre de particules détectées d’environ un ordre de grandeur (dix fois) par rapport au masque non filtré du panneau A. Bien que cette étape de filtrage élimine substantiellement de minuscules faux positifs, une classification imparfaite persiste : des contours fragmentés et des éléments non épidermiques résiduels subsistent et nécessitent un raffinement supplémentaire, comme des seuils de circularité ou un dépistage post-examen biologiquement informé. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Figure complémentaire 8 : Post-traitement d’un masque « labels » Cellpose dans ImageJ/Fiji. En utilisant le plugin Labels to ROIs pour un échantillon pelé de F. excelsior (surface abaxiale de feuille), chaque objet segmenté du masque est converti en une région d’intérêt (ROI), permettant une inspection et une mesure individuelles des cellules épidermiques et des complexes cellulaires de garde stomatiques. Les ROI sont superposés à la micrographie originale (à gauche), tandis que la fenêtre des résultats (en bas à droite) affiche les métriques au niveau des cellules (par exemple, superficie, diamètres de Feret, périmètre). Cette étape permet une curation biologiquement informée, permettant aux utilisateurs de vérifier si chaque ROI correspond à une véritable cellule épidermique et d’éliminer des artefacts tels que les trichomes ou les stomates mal segmentés qui persistent après filtrage seuil, informant ainsi les étapes d’analyse ultérieures. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Discussion

Pour des mesures stomatiques cohérentes, il convient de prélever des pelures sur la lame centrale pour obtenir des résultats standardisés, tout en évitant les veines majeures, car la densité stomatique présente une forte variation à l’intérieur des feuilles, diminuant vers la base, la pointe et les marges de la^{feuille 25,26}. Les feuilles fraîches produisent les pelures les plus fiables, à condition d’utiliser un vernis à ongles transparent non rétractant et un ruban transparent de haute qualité pour éviter la déformation ou les artefacts. Les retards au-delà de ~12 heures réduisent la clarté des contours à cause de la déshydratation. Comme les peelings sont temporairement montés et peuvent emprisonner l’air, une imagerie précoce est recommandée, mais la qualité reste acceptable même après un mois.

Différentes méthodes de dégagement existent pour des types de tissus spécifiques, des objectifs d’imagerie et des considérations de sécurité 13,14,15. Le nettoyage chimique a été réalisé à l’aide d’un protocole aqueux basé sur le NaOH pour son accessibilité, sa faible toxicité et sa large applicabilité à travers les types de feuilles. Comme les réponses tissulaires varient selon les espèces, des tests et une optimisation sont nécessaires. Les feuilles sclérophylles peuvent nécessiter ≥2 semaines, et le tissu vert résiduel peut perturber la coloration et masquer les caractéristiques anatomiques (Figure supplémentaire 1C). Pour un défrichage plus rapide, la concentration de NaOH peut être augmentée à 2,5 M ou 5 M. Les feuilles tendres deviennent fragiles après le blanchiment (Section 3.7 ; Figure supplémentaire 1B), et une surexposition à l’hypochlorite de sodium (NaClO) peut dégrader les tissus ou provoquer la séparation des couches épidermiques. Alors que 30 s à 2 minutes de blanchiment suffisent pour la plupart des feuilles tendres, les espèces plus robustes peuvent nécessiter jusqu’à 1^{h 27}. Bien que le défrichage soit plus lent que la préparation des pelages, nécessitant ~5 jours et sans entraînement spécialisé, il peut être ajusté pour diverses espèces. Les échantillons dégagés et colorés peuvent être conservés dans de l’eau distillée à 4°C, le montage permanent étant recommandé pour une conservation à long^{terme 15,27}.

Le StoManager1 spécifique aux stomates détectait de manière fiable les complexes stomatiques sur la plupart des types d’images (Figure supplémentaire 2), avec des résultats de détection généralement compatibles avec l’annotation manuelle pour les méthodes basées sur le peel. Cependant, les mesures de la surface stomatique différaient systématiquement des mesures manuelles (Tableau 2), nécessitant un étalonnage basé sur un petit sous-ensemble mesuré manuellement (par exemple, 10 à 20 stomates par espèce) avant une analyse à grande échelle. StoManager1 augmente considérablement le débit, la vérification manuelle étant requise dans les cas non standard.

La segmentation simultanée stomates-épiderme est difficile car la netteté optimale diffère, et l’hétérogénéité morphologique et la clarté de la membrane introduisent une erreur de segmentation. De la même façon, l’entraînement sur de grands ensembles d’images (par exemple, surfaces adaxiales/abaxiales, décollées/effacées) perd en spécificité. Aucun modèle Cellpose pré-entraîné n’existe pour l’épiderme des plantes ; Les modèles standards « Cyto » et « Cyto2 », entraînés principalement sur des cellules animales, sont sous-performants sur les images épidermiques. Une formation personnalisée est donc nécessaire pour la fiabilité (Section supplémentaire 2). Même après l’entraînement, la sursegmentation et les faux positifs restent fréquents, en particulier dans les images à faible contraste ou non effacées (Figure complémentaire 3).

Dans ilastik (section complémentaire 3, figure complémentaire 4), des masques d’objet doivent être générés pour les classes cellulaires cibles (par exemple, classe 1 pour l’épiderme), tout en conservant les masques de classe pour l’audit et la correction manuelle. Le traitement par lots et les flux de travail ImageJ/Fiji suivants peuvent faire gagner du temps et réduire les erreurs manuelles. Un filtrage constant par surface, écart-type ou quantiles est essentiel pour supprimer le bruit et les détections parasites. Après filtrage, la surface médiane des cellules et les décomptes de cellules approchent les valeurs manuelles. Le benchmarking par rapport aux mesures manuelles et aux outils ML alternatifs (Weka, RootPainter) reste essentiel pour l’ajustement des paramètres et l’évaluation de la qualité de segmentation. Le traitement par lots en ML est gourmand en ressources. L’entraînement stable et la segmentation par lots à grande échelle nécessitent un GPU compatible NVIDIA CUDA et ≥32 Go de RAM. Sur les systèmes de milieu de gamme (par exemple, 16 Go de RAM avec graphiques intégrés), la formation supervisée nécessite généralement ~5 à 10 minutes pour <10 images et plantait fréquemment lorsque plusieurs classes d’annotation ou des types d’images hétérogènes étaient utilisés. CUDA augmentait la vitesse de traitement de ~10 à 20 fois par rapport à l’exécution du processeur ou du GPU intégré.

Les différences de performance entre Cellpose, ilastik et StoManager1 proviennent de leurs représentations distinctes de caractéristiques. Cellpose prédit les champs de flux vectoriel vers les centres de l’objet et est sensible aux halos optiques et aux frontières réfractives abruptes, qui perturbent l’écoulement et génèrent des groupes de faux positifs dans F. excelsior dégagé. Ilastik, en tant que classificateur de pixels guidé par l’humain, sursegmente les murs cellulaires ou halos en relief élevés, sauf indication explicite en arrière-plan. StoManager1 détecte les complexes stomataux à l’aide de motifs de formes au niveau de l’objet (cellules de garde appariées avec un pore central) et fonctionne bien lors des préparations de peeling, notamment F. excelsior²⁸ ; cependant, le flou induit par l’halo affecte la visibilité des pores lors du dégagement, produisant des faux négatifs plutôt qu’une mauvaise classification (Fichiers supplémentaires, sections 1 et 3). En conséquence, Cellpose et StoManager1 fonctionnent comme segmentateurs automatisés, tandis qu’ilastik agit comme un classificateur guidé par l’humain (Fichiers supplémentaires sections 1-3)^28,.

L’architecture cellulaire spécifique à chaque espèce module la performance de l’IA. Dans T. officinale, les marges lisses et elliptiques des cellules de garde correspondent à la distribution d’entraînement de StoManager1, permettant la détection sur des échantillons écaillés (figure supplémentaire 2), tandis que les outils généralistes confondaient fréquemment les cellules de garde et celles de pavé. Chez F. excelsior, les stomates en retrait et les cellules de chaussée à haut relief entraînent des faux négatifs sur les images effacées. Ces divergences reflètent une géométrie d’imagerie dépendante de l’espèce et de la préparation. Les différences systématiques entre les mesures manuelles et dérivées de l’IA proviennent de deux sources : l’absence d’encodage à l’échelle par l’IA et les artefacts optiques induits par la préparation. Les stratégies d’atténuation incluent le triage visuel des flous et halos issus de la préparation tissulaire, l’utilisation préférentielle des peelings dans les conditions décrites ci-dessus, l’étalonnage manuel avec correction linéaire sur un petit sous-ensemble de stomates (manuel = a + b × IA). D’autres stratégies incluent l’augmentation spécifique au taxon et la conception de classes auxiliaires pour l’entraînement (cependant, les méthodes auto-entraînées resteront probablement inférieures aux modèles pré-entraînés sur de grands ensembles de données diversifiés), ainsi que le filtrage des quantiles supérieurs post-segmentation.

Parce que les erreurs de segmentation de l’IA sont systématiques et non aléatoires, le post-traitement est essentiel. Le diagnostic de la qualité d’image peut suivre un arbre de décision simple. Commencez par vérifier le contraste et la netteté de l’épiderme : si c’est brusque, passez aux faux positifs ; Si c’est flou, attendez-vous à de petits artefacts à haute fréquence et ajustez les filtres. Si les faux positifs (par exemple, points, débris) sont minimes, le filtrage des valeurs aberrantes ±2-3 SD suffit généralement. Si de petits artefacts dominent, utilisez un filtrage basé sur des quantiles. Ensuite, comparez les distributions de caractères (par exemple, médiane Ae) avec les attentes biologiques ou les données manuelles. Affinez les seuils selon les besoins – ne garder que des quantes supérieurs de 10 à 50 % dans des ensembles de données riches en artefacts garantit des résultats significatifs (figures supplémentaires7 et 8). En raison des taux élevés de faux positifs produits par les outils d’apprentissage automatique épidermique, des estimations fiables de la densité stomatique ne pouvaient pas être obtenues automatiquement, tandis que StoManager1 fournissait des mesures stomatiques^{précises 28} lorsque les limites étaient claires (voir Figures 6 et 7). Pour la médiane épidermique, l’Ae s’est révélée robuste, étant moins sensible aux petits faux positifs que la moyenne.

Le choix de la méthode a influencé la détection des traits. Le peeling a surpassé le nettoyage pour la densité stomatique en exposant complètement les stomates (Figure 3), tandis que le déblaiement masquait souvent les stomates plus petits dans des tissus stratifiés ou pigmentés, malgré une meilleure préservation parfois de la forme stomatique²⁷. Parmi les outils d’IA, StoManager1 a systématiquement fourni des mesures stomatiques robustes avec une curation minimale, en particulier sur les préparations^{de peeling 23}, et le peeling a également amélioré les mesures épidermiques en augmentant les cellules correctement identifiées et la couverture^{image 2}. Les gains futurs proviennent le plus probablement de grands modèles pré-entraînés et taxonomiquement diversifiés, intégrés dans des pipelines d’imagerie automatisés pour l’écophysiologie et l’amélioration des cultures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nettoyant liquide désinfectant NaClO < 5%	Domestos, GB	H000023244	; Brûlures cutanées   ;
Phosphate d’hydrogène disodium dihydré (Na2HPO4. 2H2O)  ;	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Éthanol, abs. 100 % d’a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	; Très inflammable & nbsp ;
Fiole en verre 2 mL	VWR Life Science, États-Unis	548-0045
Solution glutaraldéhyde à 50 %	VWR Life Science, États-Unis	23H2856331	Mortel si inhalé. Toxique si avalée. Portez des gants de protection,   ; Vêtements,   ; lunettes.
Lames de microscope	Normax, PT	5470308A	NA
Couche de finition pour les soins des ongles à séchage rapide	BK (INEZA), LT	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 et Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Pipette et pointes de pipette	Thermo Scientific, FI	KJ16047	NA
Lames en acier à tranchant simple	Instruments d’Oxford	51-1625-0182	NA
Dihydrogène phosphate dihydré (NaH2PO4 . 2H2O) pur	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Granulés d’hydroxyde de sodium (NaOH) purs	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Brûlures graves.
Bande transparente pour papeterie	FOROFIS, LV	91231	NA
Bleu toluidine, grade polyvalent	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA