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Article de méthode

Génération et manipulation génétique des organoïdes cervicales humains

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DOI :

10.3791/69617

⸱

10 mars 2026

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole détaillé pour établir et manipuler génétiquement les organoïdes cervicales humains.

Résumé

Le cancer du col de l’utérus est le quatrième cancer le plus fréquent chez les femmes et touche le plus fréquemment l’ectocol utérin. L’ectocol utérin est tapissé d’un épithélium squameux stratifié, composé de cellules basales et de cellules parabasales et suprabasales différenciées. La régénération observée après conisation cervicale suggère la présence d’une activité robuste des cellules souches. Cependant, notre compréhension de l’identité et des mécanismes régulateurs des cellules souches cervicales ainsi que de leur processus de transformation maligne a été limitée en raison de l’accès restreint aux tissus cervicaux humains et du manque de systèmes optimaux pour évaluer l’activité des cellules souches dans l’ectocol utérin. Les organoïdes cervicales humains récemment établis peuvent aider à surmonter ces limites et offrir de nouvelles opportunités d’étude de la physiologie et de la pathologie cervicales. Cependant, aucune méthode standardisée n’existe pour isoler et établir les organoïdes cervicales humains. Ici, nous décrivons une méthode pour établir des organoïdes ectocervicoïdaux humains. Plus précisément, nous présentons un protocole visant à isoler des cellules isolées de l’épithélium ectocervical humain. En incubant le tissu cervical dans une solution enzymatique optimisée, nous retirons l’épithélium cervical afin de maximiser le rendement cellulaire tout en minimisant la contamination par des fibroblastes. Nous exposons également les conditions nécessaires à la culture des organoïdes cervicales humains en utilisant une formulation optimisée de substrat. De plus, nous détaillons les procédures pour le passage et la manipulation génétique des organoïdes cervicaux. Ce protocole offre une approche très efficace pour établir des organoïdes cervicales humains et les utiliser pour étudier les cellules souches et maladies cervicales.

Introduction

L’ectocol utérin est le site le plus fréquent pour le cancer du colde l’utérus 1,2. Bien que le cancer du col de l’utérus ait diminué après l’introduction du vaccin contre le papillomavirus humain (HPV) dans les pays développés, il reste à l’échelle mondiale le quatrième cancer le plus fréquent chezles femmes 3,4. De plus, l’incidence des lésions précancéreuses du col de l’utérus continue d’augmenter dans certainspays 5,6. Alors que la lésion intraépithéliale squameuse de bas grade (LSIL) régresse souvent d’elle-même, la lésion intraépithéliale squameuse de haut grade (HSIL) comporte un risque de progression vers un cancer invasif et nécessite généralement une intervention chirurgicale, telle qu’une excision ou une conisation. Ces interventions peuvent raccourcir l’ectocol et augmenter le risque de fausse couche ou d’accouchementprématuré 7,8. Une compréhension plus approfondie de la biologie cervicale, associée au développement de la thérapie régénérative, pourrait aider à relever ces défis mais nécessite des systèmes modèles robustes et physiologiquement pertinents.

Les modèles animaux ont considérablement fait progresser notre compréhension de l’homéostasie cervicale, des mécanismes pathologiques et des stratégies thérapeutiques. Cependant, leurs différences inhérentes à la biologie et à la pathologie humaines limitent leur valeur translationnelle. En alternative, les organoïdes sont devenus des plateformes puissantes pour modéliser la biologie humaine et les maladies. Les organoïdes sont des microstructures tridimensionnelles dérivées des cellules souches qui récapitulent l’histologie et les signatures moléculaires de leur tissud’origine 9,10,11. Ils ont été utilisés pour identifier diverses cellules souches des tissus humains à travers plusieurs tissus, notamment la trachée, l’œsophage etle col de l’utérus 12, 13 et 14. De plus, les organoïdes permettent la manipulation génétique, permettant la modélisation de la pathogenèse de diverses maladies, notamment les cancers et lafibrose 15, 16, 17. De plus, les organoïdes servent de plateforme efficace pour évaluer l’efficacité et la toxicité des médicaments ou des thérapiescellulaires 18,19,20,21.

Récemment, deux groupes indépendants ont établi des systèmes organoïdes cervicoïdauxhumains 22,23. En s’appuyant sur ces avancées, nous avons considérablement amélioré l’efficacité de la culture organoïde cervicale et identifié les cellules souches cervicaleshumaines 13. De plus, en retirant l’épithélium cervical, nous avons minimisé l’inclusion de fibroblastes sous l’épithélium cervical. En utilisant des organoïdes du col de l’utérus par manipulation génétique, nous avons découvert le rôle des métabolites microbiens et leurs voies ultérieures dans le maintien de l’homéostasie cervicale et la prévention de la progression précancéreuse. Ainsi, un protocole standardisé et optimisé pour générer, maintenir et modifier génétiquement les organoïdes cervicaux servira d’outil essentiel pour étudier la biologie et la pathologie cervicales.

Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé et optimisé pour générer et faire passer des organoïdes cervicales humains. Nous décrivons également un protocole pour leur manipulation génétique par électroporation.

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Protocole

L’isolement cellulaire et la culture organoïde utilisant des tissus cervicolins humains ont été approuvés et réalisés conformément à toutes les réglementations éthiques pertinentes par les comités internes de revue du DGIST, Daegu, Corée, et de l’hôpital universitaire national Chilgok Kyungpook, Gyeongsangbuk-do, Corée (DGIST-20210401-BR-112-01 et KNUCH-2020-12-020-001). Les tissus ectocervicolicaux humains ont été fournis par le département d’obstétrique et de gynécologie de l’hôpital universitaire national Chilgok Kyungpook. Des tissus cervicaux sains ont été obtenus chez des patientes ayant subi une hystérectomie laparoscopique totale pour leurs maladies utérines bénignes. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.

1. Isolation unicellulaire des tissus ectocervicaux

REMARQUE : Ce protocole commence par un échantillon de biopsie d’ectocol humain d’environ 5 mm × 5 mm × 5 mm (Figure 1).

  1. Placez le tissu biopsié dans une boîte de Petri de 10 cm et lavez-le une fois avec du DPBS glacé (sans calcium ni magnésium) pour éliminer le sang et les débris.
    REMARQUE : Les tissus cervicoles humains ont été transportés au laboratoire dans les 3 heures suivant l’opération dans un DMEM/F12 avancé glacé et traités immédiatement à leur arrivée.
  2. Transférez le tissu dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de solution de dispase (2,4 U/mL) et incubez pendant 1 heure à 37 °C avec une légère agitation sur un rotateur de tube (20 tr/min).
    REMARQUE : La solution de dispase (2,4 U/mL) a été préparée fraîchement immédiatement avant utilisation, en dissolvant la poudre de dispase à la concentration de travail dans un DPBS glacé.
  3. Transférez l’échantillon dans une nouvelle boîte de Petri de 10 cm. Séparez soigneusement la couche épithéliale blanche du reste du tissu à l’aide de pinces.
  4. Utilisez des pinces pointues pour décoller doucement la surface épithéliale comme une feuille intacte. Transférez immédiatement la couche épithéliale isolée dans un tube conique de 50 mL conservé sur la glace.
    REMARQUE : Si l’épithélium de surface ne se décolle pas facilement, grattez la surface avec des pinces à extrémité émoussée.
  5. Ajoutez 1 mL d’une solution de dissociation à base de trypsine recombinante à l’échantillon pelé ou gratté, puis transférez le mélange entier dans un tube conique de 50 mL.
  6. Conservez le tissu restant de l’étape précédente dans l’autre tube conique de 50 mL.
  7. Incubez la sonde conique de 50 mL contenant l’épithélium cervical à 37 °C pendant 5 minutes avec une légère agitation sur un rotateur tubulaire (20 tr/min).
  8. Ajoutez 10 mL de tampon bloqueant fraîchement préparé (PBS avec 2 % de sérum de veau bovin (BCS)) à la suspension cellulaire pour stopper la réaction enzymatique.
  9. Centrifugez le tube à 450 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
    REMARQUE : Si le sang est observé visuellement dans le tissu dissocié ou si le tissu apparaît collant, procédez à l’étape suivante. Sinon, passez à l’étape 1.13.
  10. Ajoutez 1 mL de tampon de lyse 1X pour globules rouges et 20 μL de DNase (10 U/μL de stock) au pellet. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges et décomposer l’ADN collant.
  11. Ajoutez 10 mL de tampon bloqueant glacé (PBS avec sérum de veau bovin à 2 % (BCS)) à la suspension cellulaire pour stopper la réaction enzymatique.
  12. Centrifugez le tube à 450 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
  13. Lavez le granule cellulaire avec un tampon blocant glacé (PBS avec 2 % de sérum de veau bovin (BCS)).
  14. Centrifugez le tube à 450 × g pendant 5 minutes. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
  15. Resuspendez la granule cellulaire dans 200-500 μL de milieu de culture organoïde.
  16. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’hémocytomètre avec une solution de bleu de trypan. Le rendement cellulaire attendu se situe entre 50 000 et 500 000 cellules par échantillon de biopsie.

2. Ensemencement et culture d’organoïdes ectocervicales

  1. Resuspendre 500 à 2 000 cellules viables dans un volume final de 50 μL de milieu de culture organoïde (composition décrite dans la liste des matériaux) dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. La viabilité cellulaire a été évaluée par exclusion par bleu de trypan avant l’ensemencement.
  2. Ajoutez 50 μL d’une matrice membranaire basale (par exemple, Matrigel) à la suspension cellulaire. Mélangez doucement sur de la glace pour éviter la formation de bulles, puis injectez le mélange de 100 μL à l’intérieur d’un insert de culture cellulaire placé dans une plaque à 24 puits. Toutes les procédures impliquant la manipulation de la matrice membranaire du socle ont été réalisées sur glace ou à 4 °C afin d’éviter une gélification prématurée, sauf indication contraire.
  3. Incubez la plaque pendant 20 à 30 minutes à 37 °C jusqu’à ce que le mélange membranaire membrane-cellule se solidifique.
  4. Une fois le mélange solidifié, ajoutez 400 μL de milieu de culture organoïde au puits sous l’insert.
  5. Cultivez les organoïdes pendant 1 à 2 semaines jusqu’à atteindre un diamètre moyen de 150 à 250 μm (le diamètre maximal est d’environ 500 μm).
    REMARQUE : Lorsque les organoïdes atteignent une taille appropriée et présentent le motif lamellaire concentrique des microstructures ressemblant à une peau d’oignon, envisagez de passer si nécessaire.

3. Dissociation et réensemencement des organoïdes

  1. Ajoutez 1 mL de solution de dispase (2,4 U/mL) sur l’insert de culture cellulaire et dissociez doucement la matrice membranaire basale à l’aide d’une pipette.
  2. Transférer le mélange de matrice membranaire de dispase basale dans un tube de 15 mL et incuber pendant 1 heure à 37 °C.
  3. Ajoutez 10 mL de tampon bloqueant fraîchement préparé (PBS avec 2 % de sérum de veau bovin (BCS)) à la suspension cellulaire pour stopper la réaction enzymatique.
  4. Centrifugez le tube à 450 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  5. Retirez le surnageant et resuspendez la pellete dans 200 μL de TrypLE Express.
  6. Incubez pendant 5 minutes à 37 °C.
  7. Ajoutez 1 mL de tampon bloqueant le froid glacial (PBS avec 2 % de sérum de veau bovin (BCS)) et pipettez doucement pour neutraliser l’enzyme.
  8. Filtrez la suspension à travers un tamis de cellules de 40 μm pour obtenir des cellules simples.
  9. Centrifugez le tube à 450 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
  10. Resuspendez la granule cellulaire dans 200-500 μL de milieu de culture organoïde.
  11. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’hémocytomètre avec une solution de bleu de trypan. Le rendement cellulaire attendu se situe entre 50 000 et 500 000 cellules par puits d’insertion de culture cellulaire à 24 puits.
  12. Ensuite, resuspendez 500 à 2 000 cellules dans 50 μL de milieu de culture organoïde (composition décrite dans la liste des matériaux). Ajoutez 50 μL de matrice membranaire basale à la suspension cellulaire. Mélangez doucement, évitez la formation de bulles, et dispensez le mélange de 100 μL à l’intérieur d’un insert de culture cellulaire placé dans une plaque à 24 puits.
  13. Incubez la plaque pendant 20 à 30 minutes à 37 °C jusqu’à ce que le mélange membranaire membrane-cellule se solidifique.
  14. Une fois le mélange complètement solidifié (généralement après 20-30 minutes à 37 °C), ajoutez 400 μL de milieu de culture organoïde dans le puits sous l’insert.
  15. Cultivez les organoïdes pendant 1 à 2 semaines dans un milieu de culture organoïde (composition décrite dans la liste des matériaux) à l’aide d’une méthode 3D d’intégration extracellulaire en matrice. Maintenir des cultures à 37 °C, 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié. Remplacer le milieu tous les 2-3 jours et surveiller la croissance jusqu’à ce que les organoïdes atteignent un diamètre moyen de 150-250 μm.
  16. Passez les organoïdes pour la prochaine étape lorsqu’ils atteignent une taille appropriée et présentez le motif lamellaire concentrique des microstructures ressemblant à des peaux d’oignon, si nécessaire.

4. Manipulation génétique des organoïdes cervicales humains par électroporation

REMARQUE : Ce protocole est basé sur l’utilisation d’un nucléofecteur Lonza Amaxa 4D et du kit 4D-nucléofecteur X de cellule primaire P4 (#V4XP-4032).

  1. Après l’isolement à partir de la suspension de cellules cervicales humaines, transférez 100 000 à 200 000 cellules dans chaque tube de 1,5 mL.
  2. Centrifugez les tubes à 450 × g pendant 3 minutes à 4 °C. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
  3. Resuspendez la granule cellulaire dans 20 μL du mélange de solution/supplément Nucleofector provenant du kit P4 Primary Cell 4D-Nucléofector X. Le mélange est préparé en combinant 16,4 μL de solution nucléofectrice et 3,6 μL de supplément par tube.
  4. Ajouter 300 nM d’oligo siRNA témoin ou cible à chaque tube contenant les cellules en suspension en suspension. Mélangez doucement en pipotette.
    REMARQUE : Le volume de l’oligo de siRNA ne doit pas dépasser 2 μL par tube.
  5. Transférez soigneusement le mélange de nucléofection (20 μL de cellules resuspendues dans un mélange de solution/supplément de nucléofecteur + jusqu’à 2 μL de siRNA ; total 20-22 μL) dans les vaisseaux cuvettes d’électroporation issus du kit de cellule primaire P4 4D-Nucléofector X.
  6. Tapotez doucement les vaisseaux Nucleocuvette pour s’assurer que l’échantillon couvre le fond de la cuvette.
  7. Fermez le couvercle des vaisseaux Nucleocuvette et placez-le dans le dispositif d’une unité 4D-Nucléofectrice alimentée.
    REMARQUE : Assurez-vous de l’orientation correcte des vaisseaux Nucleocuvette dans le dispositif de contention.
  8. Initiez le processus de nucléofection. Définissez le code d’impulsion EA-125 pour chaque cuvette avec le processus de cellule primaire P4.
  9. Après terminé, retirez soigneusement les vaisseaux Nucleocuvette du rétentieur.
  10. Incubez les vaisseaux Nucleocuvette à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre aux cellules de se stabiliser.
  11. Ouvrez le couvercle des vaisseaux Nucleocuvutte, ajoutez 180 μL de milieu de culture organoïde préchauffé à 37 °C à chaque cuvette, puis transférez doucement la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 1,5 mL pour la resuspension.
  12. Prenez un volume de suspension cellulaire contenant 500 à 2 000 cellules et resuspendez-le dans un milieu de culture organoïde jusqu’à un volume final de 50 μL.
    REMARQUE : Ne défaussez pas les cellules restantes de l’étape 4.12. Ils seront utilisés à l’étape 4.14.
  13. Cultivez les organoïdes en suivant le protocole de la Méthode 2 : Ensemencement et culture des organoïdes de l’Ectocervix. Comparez les effets du siRNA en évaluant divers facteurs, notamment le nombre, la taille et la structure des organoïdes résultants.
  14. Distribuez les cellules restantes de l’étape 4.12 dans une plaque d’attache ultra-faible à 96 puits et incubez pendant 48 heures à 37 °C.
  15. Après 48 heures, transférez les cellules dans un tube de 1,5 mL et centrifugez à 450 × g pendant 3 minutes. Jetez le surnageant.
  16. Utilisez la granule cellulaire pour des expériences PCR en temps réel afin de confirmer la dégradation des gènes cibles et d’évaluer toute modification de l’expression génique.
    REMARQUE : Tous les tissus cervicales humains et suspensions cellulaires doivent être manipulés comme des matériaux potentiellement infectieux. Effectuer toutes les procédures impliquant des sémicimens humains primaires dans un cabinet de biosécurité certifié selon les pratiques BSL-2 et conformément aux réglementations éthiques et de biosécurité institutionnelles. Portez un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire) et désinfectez les surfaces et équipements de travail après utilisation avec un désinfectant approuvé par l’établissement. Les réactifs enzymatiques (par exemple, les enzymes dispases et de dissociation comme TrypLE Express) peuvent provoquer des irritations cutanées et oculaires et peuvent générer des aérosols lors du pipetage ; Évitez la génération d’aérosols, gardez les tubes bouchés autant que possible et rincez immédiatement à l’eau en cas de contact tout en suivant les procédures d’exposition institutionnelles et les recommandations FDS du fabricant. Éliminer tous les déchets biologiques (y compris les matériaux contenant des matrices et les plastiques contaminés) conformément aux directives institutionnelles. Pour l’électroporation des siRNA, respectez les instructions de sécurité électrique du fabricant : assurez-vous que les cuvettes sont bien bien placées et que le couvercle est complètement fermé avant d’initier les impulsions, évitez d’utiliser l’appareil avec des gants mouillés ou près de déversements, inspectez l’appareil et ses accessoires pour détecter des dommages, et évitez le contact direct avec les électrodes de la cuvette immédiatement après l’impulsion.

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Résultats

Culture organoïde cervicale humaine 3D

Les tissus ectocervicolicaux humains fraîchement isolés ont été dissociés en cellules individuelles dans l’ordre mentionné ci-dessus, qui ont ensuite été placés sur des inserts de culture cellulaire à 24 puits et cultivés pour former des organoïdes cervicales comme décrit dans ce protocole (Figure 1). Les organoïdes cervicales humains atteignent jusqu’à 500 μm de diamètre à p...

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons le protocole pour établir et passer les organoïdes cervicales humains. Nous proposons également un protocole pour les manipuler génétiquement, ce qui fait progresser significativement l’étude de la biologie et de la pathologie cervicales. Bien que nous ayons optimisé le protocole spécifiquement pour les organoïdes utéraux humains, notre protocole peut être appliqué à d’autres systèmes organoïdes avec de légères modifications.

...

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Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention du ministère de la Santé et du Bien-être (RS-2024-00439434 pour Y. Jeong).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de cellule primaire P4 4D-nucléofecteur XLonzaV4XP-4032
Plaque d’attache ultra-basse à 96 puitsSPL39796
Filtre cellulaire 40 & micro ; mSPL93040
Tube conique 500 mL 500/boîteSLPSPL50050
Tube conique de 15 mlSarstedt62.554.502
Tube CryoPure 1,8 mL - blancSarstedt72,379P
37 & deg ; C, 5 % CO2 & nbsp ; IncubateurEppendorf9734IQ905476
Insertion en culture cellulaireSPL37024
Amaxa 4D-NucléofecteurLonzaAAF-1003X
Tampon de blocage (2 % BCS dans DPBS)Gibco / WelgeneBCS : 26010074 ; DPBS : LB001-02
Poudre de dispase IIGibco17105041
DNAse IEnzynomiqueM059L
MatrigelCorning356231
Tampon de lyse des globules rougesBiosesangR2015
TrypLE ExpressGibco12605
Tampon de lavage (HBSS)JBIBL003-1
DMEM avancé/F12Gibco12634028
Supplément GlutaMAXGibco35050-061
Pénicilline & ndash ; StreptycineBiowestL0022-100
HEPESGibco15630-080
Supplément B27Gibco17504044
NogginPeproTech118214
N-acétyl-l-cystéineSigmaA9165
Y-27632STEMCELL Technologies72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01SelleckchemS7692  ;
ForskolinSigmaF6886
Neureguline 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
R-spondineSinobiologique11083-HNAS
HGFPeprotech100-39H-250ug
FGF10Peprotech100-26
Pétridish 35 mm  ;SPL10035
forts
Nom< forte>Compagnie Numéro de catalogue fort
DMEM avancé/F12Gibco12634028
Supplément GlutaMAXGibco35050-0611x
Pénicilline & ndash ; StreptycineBiowestL0022-1001x
HEPESGibco15630-08010 mM
Supplément B27Gibco175040441x
sans vitamine A
NogginPeproTech118214100 ng/ml
N-acétyl-l-cystéineSigmaA91651 mM
Y-27632STEMCELL Technologies7230710 uM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10Peprotech100-26100 ng/ml
A83-01SelleckchemS7692  ;500 nM
ForskolinSigmaF688610 & mu ; M
Neureguline 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
R-spondineSinobiologique11083-HNAS100 ng/ml
HGFPeprotech100-39H-250ug25 ng/ml

Références

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