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Article de recherche
L’exposition à PM2,5 induit un retard de lésion testiculaire chez les modèles de rats par des réponses inflammatoires soutenues, une augmentation de l’apoptose des cellules germinales, une régulation à la baisse de Connexin-43/Occludin, et une signalisation compatible avec l’activation de la voie JNK, soulignant sa menace à long terme pour la santé reproductive masculine.
Les particules fines (PM2,5) sont de plus en plus impliquées dans l’altération reproductive masculine. Cependant, comme la plupart des recherches restent axées sur les lésions aiguës, retardées, persistantes ou progressives post-exposition, les lésions testiculaires — critiques pour l’évaluation des risques à long terme — restent peu comprises. Nous avons mis en place un modèle de rat résolu dans le temps pour déterminer si les blessures persistent ou s’aggravent après exposition. Soixante-douze rats mâles de Sprague-Dawley ont été répartis au hasard en neuf groupes (témoin ; véhicule à 24h, 1, 2 et 4 mois ; PM2,5 aux mêmes moments) et a reçu des PM2,5 intranasaux à 5 mg/kg/jour pendant 7 jours. Nous avons quantifié la qualité des spermatozoïdes et les indices des organes reproducteurs, examiné l’histologie testiculaire et l’ultrastructure, mesuré la testostérone sérique, la FSH, la LH et l’E2, profilé les ARNm des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, évalué l’apoptose des cellules germinales par TUNEL, et évalué les protéines jonctionnelles et liées au stress (Connexin-43, Occludin, JNK). L’exposition à PM2,5 a entraîné des baisses soutenues de la concentration et de la motilité des spermatozoïdes, ainsi qu’une augmentation des malformations et une atrophie testiculaire et épididymale qui ne s’est pas rétablie sur la période post-exposition de 4 mois. L’histologie a montré un amincissement progressif de l’épithélium séminifère et une dégénérescence ultrastructurelle. Des perturbations endocriniennes étaient également visibles, avec une baisse de testostérone et des gonadotrophines modifiées. Sur le plan mécanistique, l’exposition à PM2,5 a maintenu une expression élevée d’IL-1β et IL-6, favorisé l’apoptose des cellules germinales et a régulé à la baisse la Connexine-43 et l’Occludine tout en présentant des schémas compatibles avec l’activation de la voie JNK. Ensemble, ces résultats démontrent une toxicité testiculaire retardée et progressive après la fin de l’exposition à la PM2,5 et suggèrent que préserver l’intégrité jonctionnelle et cibler le JNK pourrait atténuer les dommages reproductifs à long terme.
Le PM2.5, un mélange complexe de particules fines avec un diamètre aérodynamique de ≤2,5 μm, provient des émissions industrielles, des gaz d’échappement des véhicules et de la combustion de biomasse, et est devenu un polluant environnementalmajeur à l’échelle mondiale. Des études épidémiologiques lient l’exposition aux PM2.5 aux maladies respiratoires etcardiovasculaires 2, ainsi qu’aux troubles du systèmereproducteur 3. L’impact sur la fertilité masculine est particulièrement préoccupant en raison des preuves que la pollution de l’air peut réduire la qualité desspermatozoïdes 4. Les facteurs masculins contribuent à plus de la moitié des cas d’infertilité dans le monde, et plusieurs études rapportent des déclins significatifs des paramètres du sperme au cours des dernièresdécennies 5. Des analyses mondiales récentes confirment également des baisses généralisées de la qualité des spermatozoïdes dans plusieursrégions 6. Bien que des facteurs tels que le tabagisme, la consommation d’alcool, les radiations et l’exposition à des produits chimiques soient des risquesétablis 7, le PM2.5 est apparu comme un toxique reproductif supplémentaire ciblant lestesticules 8.
Les testicules sont très sensibles aux substances toxiques environnementales en raison de leur structure physiologique unique et de leur activité spermatogénique continue. Des recherches antérieures ont indiqué que l’exposition à PM2,5 peut induire des lésions testiculaires par plusieurs voies, telles que le stress oxydatif, les réponses inflammatoires et la perturbation de la barrièresanguin-testiculaire 9. Ces effets aigus se caractérisent par une baisse de la qualité des spermatozoïdes, une histologie testiculaire anormale et des déséquilibreshormonaux 10. Cependant, la plupart des études se concentrent sur les blessures immédiates, laissant les effets à long terme ou différés mal caractérisés.
Les modèles actuels d’exposition à PM2.5 présentent des limites inhérentes : l’inhalation par tout le corps imite l’exposition naturelle mais nécessite un équipement spécialisé et manque de précision de dose11, tandis que l’instillation intratrachéale assure le contrôle de la dose mais est invasive et ne réplique pas le dépôt physiologiquede particules 12. Notre modèle intranasal à résolution temporelle évite ces inconvénients : son administration non invasive s’aligne avec les schémas de dépôt des voies respiratoires supérieures, permet un contrôle précis de la dose et soutient un échantillonnage multi-temps à long terme pour détecter une blessure retardée, qui dépasse la capacité des modèles traditionnels axés surl’aiguë 13.
Notre dose de 5 mg/kg/jour de PM2,5 correspond aux paradigmes d’exposition aux subaiguës des rongeurs prouvés pour susciter des réponses reproductives, et par conversion de surface corporelle, elle approche une dose équivalente humaine ~6 fois supérieure aux niveaux ambiants — standard pour accélérer les manifestations de toxicitéà long terme 14. Les considérations d’espèces s’appliquent : bien que les rats partagent une physiologie testiculaire conservée avec l’humain, leur cycle spermatogénique plus court peut accélérer la progression des lésions observée dans nos15 points temporels, et la délivrance intranasale diffère du dépôt des voies respiratoires inférieures humaines, bien que la dissémination systémique de la toxine aux testicules soit confirmée.
Les effets retardés de l’exposition aux substances toxiques environnementales sont essentiels pour évaluer les risques reproductifs à long terme, car ils peuvent révéler des dommages irréversibles qui ne sont pas apparents dans les observations à courtterme 16. Par exemple, certains toxiques peuvent provoquer des lésions latentes aux testicules, qui se manifestent ou s’aggravent progressivement avec le temps, même après l’arrêt de l’exposition, conduisant potentiellement à un dysfonctionnement reproductifchronique 17. Étant donné l’ubiquité et la persistance du PM2,5, déterminer si sa toxicité reproductive persiste ou s’aggrave après exposition est crucial18.
L’inflammation soutenue, le stress oxydatif et des mécanismes de réparation altérés sont des facteurs plausibles d’effets retardés. La régulation à la hausse induite par PM2,5 de l’IL-1β, de l’IL-6 et du TNF-α peut maintenir une inflammation chronique, perturber la spermatogenèse et favoriser l’apoptose des cellulesgerminales 19. Des dommages aux protéines clés de jonction, telles que la Connexine-43 et l’Occludine, compromettent la barrière sanguin-testicule et peuvent empêcher la récupérationfonctionnelle 20. L’activation de la voie de la kinase C-Jun N-terminale (JNK), médiateur du stress et de la signalisation apoptotique, a également étéimpliquée 21.
Malgré la reconnaissance croissante de la toxicité reproductive du PM2.5, il existe un écart important dans les connaissances concernant la dynamique temporelle des lésions testiculaires après l’arrêt de l’exposition. Plus précisément, il reste incertain combien de temps les lésions testiculaires persistent, si elles s’aggravent avec le temps, et quelles voies moléculaires alimentent ces effetsretardés 22. Répondre à ces questions est crucial pour développer des stratégies préventives et thérapeutiques ciblées afin d’atténuer les dommages reproductifs masculins induits par la PM2,5.
Des lacunes importantes subsistent quant à la durée, la progression et les mécanismes de la lésion testiculaire induite par PM2,5 après l’arrêt de l’exposition. Cette étude comble ces lacunes en évaluant les critères de reproduction ; histopathologie; profils hormonaux — en particulier l’hormone folliculo-stimulante (FSH), l’hormone lutéinisante (LH) et l’estradiol (E2) ; inflammation; apoptose; et l’expression des protéines barrières à plusieurs moments après l’exposition. Les résultats apportent un éclairage sur les risques reproductifs à long terme du PM2.5 et éclairent les stratégies de santé publique pour protéger la fertilité masculine.
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Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux réglementations institutionnelles et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Fujian Health College (Projet n° d’approbation : DW2024-01).
Sécurité et déchets dangereux
Des réactifs toxiques tels que le formol, le tétroxyde d’osmium et le chloroforme ont été manipulés dans une hotte certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié. Les déchets organiques halogénés et les solutions contenant de l’osmium ont été collectés dans des contenants désignés et éliminés selon les exigences institutionnelles. Le pentobarbital sodique a été enregistré comme substance contrôlée, et les objets tranchants ont été manipulés en toute sécurité tout au long de l’étude.
Matériaux et manutention PM2.5
Un matériau de référence standard PM2.5 a été utilisé pour le dosage. Suivant les procédures établies de préparation des particules, la poudre sèche était suspendue dans un PBS stérile à la concentration requise et sonique dans un bain-marie pendant 10 à 15 minutes juste avant utilisation, sans tensioactif. Les suspensions de travail étaient préparées chaque jour. Les niveaux d’endotoxines ont été évalués par un test de lysat d’amoebocytes par limulus et se sont révélés indétectables. Lorsque cela était nécessaire, des contrôles polymyxin-B ont été inclus pour exclure les effets pilotés par le LPS.
Construction de modèles animaux in vivo
Soixante-douze rats mâles de Sprague-Dawley SPF (âgés de 2 mois, 190 ± 10 g) ont été hébergés dans des conditions standard et répartis en neuf groupes (n = 8 par groupe), comprenant un groupe témoin, des groupes de véhicules échantillonnés à 24 heures, 1, 2 et 4 mois, ainsi que des groupes exposés à PM2,5 aux mêmes moments. Le PM2,5 a été administré par voie intranasale à 5 mg∙kg-1∙jour-1 dans 10-20 μL par naris sous anesthésie légère à l’isoflurane une fois par jour pendant 7 jours. Après l’administration, les rats étaient placés en position couchée pendant 1 à 2 minutes pour faciliter l’inhalation. Les animaux étaient maintenus jusqu’à l’euthanasie aux points temporels post-exposition désignés, et la masse corporelle était enregistrée pour le calcul des coefficients d’organes. Les critères de finalisation comprenaient les coefficients d’organes, la qualité des spermatozoïdes, l’histologie et l’ultrastructure, les hormones reproductrices sériques et les tests moléculaires.
Morphologie des organes reproducteurs et évaluation de la qualité du sperme
Les testicules et les épididymides ont été disséqués sous anesthésie pentobarbitale profonde, lavés et pesés pour calculer les coefficients d’organes. Les spermatozoïdes ont été prélevés à partir de la caude épididyme en hachés dans un tampon pré-chauffé à 37 °C. La concentration a été déterminée à l’aide d’un hémocytomètre. La motilité a été évaluée en examinant au moins 200 spermatozoïdes répartis sur cinq champs ou plus non superposés sur des lames préchauffées. La morphologie a été évaluée après fixation, étalage et coloration avec l’éosine-nigrosine ou le Diff-Quik, avec au moins 200 spermatozoïdes par rat. Toutes les évaluations ont été à l’aveugle, et les réplications techniques ont été moyennées pour obtenir une valeur par animal.
Analyse histologique et ultrastructurale du tissu testiculaire
Les testicules étaient fixés dans du formol tampon neutre à 10 %, traités par éthanol et xylène gradués, intégrés dans la paraffine, puis sectionnés à 5 μm pour la coloration en HE. Les coupes colorées ont été évaluées à l’aide d’un échantillonnage aléatoire systématique, avec des exclusions appliquées pour les coupures obliques, les artefacts ou une mauvaise fixation. Les diamètres des tubules étaient calculés à partir d’axes orthogonaux, et l’épaisseur épithéliale était mesurée en points bien espacés. Les analyses ont été à l’aveugle, et un minimum de 10 tubules par rat a été évalué.
Pour le TEM, de petits blocs tissulaires étaient fixés dans le glutaraldéhyde, postfixés dans du tétroxyde d’osmium, déshydratés, infiltrés par la résine et polymérisés. Les sections ultrafines ont été colorées à l’acétate d’uranyle et au citrate de plomb et imagées à 60-120 kV dans des réglages constants. La QC comprenait l’évaluation de l’intégrité membranaire et mitochondriale ainsi que l’évitement des artefacts d’extraction.
Dosage immunosorbant lié aux enzymes (ELISA)
Du sang a été prélevé sur l’aorte abdominale sous anesthésie dans une fenêtre matinale fixe afin de contrôler la variation circadienne. Après coagulation et centrifugation, le sérum était aliquoté et stocké à −80 °C. La testostérone, la FSH, la LH et l’E2 ont été quantifiées à l’aide d’une plateforme d’immunotest validée. Les échantillons étaient effectués en double avec des commandes appropriées, et la précision de l’essai respectait les spécifications de la plateforme. Les échantillons hémolysés ou lipémiques ont été exclus.
Réaction en chaîne quantitative en temps réel (RT-qPCR)
L’ARN total a été extrait du tissu testiculaire à l’aide du phénol-chloroforme et purifié par précipitation d’isopropanol et lavage à l’éthanol. La qualité de l’ARN a été vérifiée par spectrophotométrie. L’ADNc a été synthétisé, et la RT-qPCR a été réalisée avec une chimie à base de colorants dans des conditions de cycle standard, suivie d’une analyse de la courbe de fusion. Les niveaux d’expression ont été normalisés en GAPDH à l’aide de la méthode 2−ΔΔCq .
Analyse du western blot
Les lysats protéiques ont été préparés dans un tampon RIPA avec inhibiteurs de protéase, quantifiés par test BCA, puis dénaturés dans un tampon de chargement. Le transfert SDS-PAGE et PVDF a été effectué dans des conditions contrôlées. Les membranes ont été bloquées, incubées avec des anticorps primaires pour Connexin-43, Occludin, JNK et GAPDH, suivies d’anticorps secondaires conjugués à HRP. Les bandes étaient détectées par chimiluminescence, et la densitométrie impliquait la soustraction de fond, la normalisation en GAPDH, et l’échification vers le groupe témoin.
Analyse statistique
Les données ont été rapportées comme moyenne ± SD. Une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey ou le test t de Student a été utilisée lorsque cela était approprié, les données non paramétriques étant analysées par le test U de Mann-Whitney. Une valeur p < 0,05 était considérée comme significative.
Achèvement et nettoyage
Tous les déchets chimiques dangereux ont été enregistrés et éliminés de manière appropriée. Les données brutes, y compris les sorties d’instruments et les fichiers d’analyse, étaient archivées avec des notes correspondantes afin d’assurer la traçabilité.
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Détérioration persistante de la fonction reproductive masculine chez les rats, caractérisée par une qualité réduite des spermatozoïdes et un développement des organes reproducteurs altérés en raison de l’exposition aux PM2,5
L’étude de l’impact du PM2.5 sur la fonction reproductive masculine, la qualité des spermatozoïdes, les coefficients des organes reproducteurs et les indicateurs associés a été examiné dans neuf groupes de rats mâles. Des analyses ont été réalisées par rap...
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L’exposition à courte durée à PM2,5 a été suivie d’une détérioration progressive post-exposition de la fonction reproductive masculine sur 1 à 4 mois. Ces résultats confirment une toxicité reproductive dépendante du temps qui persiste après l’arrêt du dosage et prolongent les observations antérieures de l’altération reproductive associée à laPM2,5 23.
Pour améliorer la reproductibilité, nous avons standardisé quatre éléments. Premièreme...
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Ce travail a été soutenu par la Natural Science Foundation de la province du Fujian, en Chine (Grant No :2023J01170).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 % de tétroxyde d’osmium | TCI, Chine | O0308 | Pour la post-fixation dans l’analyse TEM du tissu testiculaire |
| Formol tamponné neutre à 10 % | Solarbio, Chine | PC0020 | Pour fixer des échantillons de tissu testiculaire dans la coloration HE |
| 2,5 % de glutaraldéhyde | Solarbio, Chine | G1102 | Pour la fixation d’échantillons de tissu testiculaire dans l’analyse TEM |
| 75 % d’éthanol | Acros Organics, USA | 61509-0040 | Pour purifier l’ARN précipité en RT - qPCR |
| Imageur chimiluminescence automatique | Bio-Rad, USA | ChemiDoc | Utilisé pour l’imagerie automatique des signaux chimiluminescents dans le Western blotting. |
| Kit de test protéique BCA | Solarbio, Chine | PC0020 | Pour déterminer la concentration totale de protéines dans l’analyse Western blot |
| Tampon de blocage | Non spécifié | T7131A | Utilisé dans l’analyse Western blot pour éliminer les liaisons non spécifiques |
| Chloroforme | Acros Organics, USA | 327270010 | Utilisé dans la séparation d’ARN pendant la RT - qPCR |
| Connexin - 43 | Abcam, États-Unis | ab11370 | Détecte l’expression et la distribution d’une protéine clé de barrière sanguin-testicule pour aider à évaluer l’intégrité de la barrière |
| Maillot ECL | Biosharp, Chine | BL520B | Pour visualiser les bandes protéiques dans l’analyse Western blot |
| Kits ELISA (pour testostérone, FSH, LH, E2) | Abcam, Royaume-Uni | ab108666 ; ab108702 ; ab108651 ; ab108667 | Pour détecter les hormones reproductives sériques |
| Éosine | Solarbio, Chine | G1002 | Utilisé dans la coloration HE du tissu testiculaire |
| Résine époxy | Solarbio, Chine | GP2001 | Pour l’inclusion d’échantillons de tissu testiculaire dans l’analyse TEM |
| GAPDH | Abcam, États-Unis | ab128915 | Évalue l’apoptose des cellules testiculaires induite par PM2.5 et fournit une base morphologique pour étudier son impact sur l’apoptose cellulaire testiculaire |
| Hématoxyline | Solarbio, Chine | G1077 | Utilisé dans la coloration HE du tissu testiculaire |
| Système d’imagerie | Nikon, Japon | Nikon DS-U3 | Utilisé pour l’imagerie d’échantillons au microscope. |
| Isopropanol | Acros Organics, USA | AC447080025 | Utilisé lors de la précipitation d’ARN pendant la RT - qPCR |
| JNK ; | Abcam, États-Unis | ab124956 | Explore le mécanisme moléculaire de la lésion testiculaire causée par le PM2.5 et identifie les types cellulaires dans lesquels il est activé |
| ; Lecteur de microplaques | DISPOSITIFS MOLÉCULAIRES, ÉTATS-UNIS | SpectraMax iD3 | Utilisé pour détecter les signaux dans les microplaques (par exemple, absorbance, fluorescence). |
| Occludine | Abcam, États-Unis | ab31721 | Comprend le degré de dommage de la barrière sanguine-testiculaire et explore les interactions entre les protéines concernées |
| Microscope optique | Chongqing Opto - Instrument électronique, Chine | BDS200 | Utilisé pour l’observation microscopique optique générale. |
| ; Microtome pathologique | Shanghai Kaiyu Instrument, Chine | RM2016 | Utilisé pour couper des coupes de tissus pathologiques. |
| Pentobarbital sodium | Solarbio, Chine | G1102 | Utilisé pour l’injection intrapéritonéale chez les rats avant la prise de sang |
| Matériel de référence standard PM2.5 | Institut national de métrologie, Chine | GBW13643 | Pour l’exposition à PM2.5 dans le groupe expérimental |
| Membrane de polyvinylidène difluorure (PVDF) | Thermo Fisher, États-Unis | 88585 | Utilisé dans l’analyse Western blot pour le transfert de protéines |
| Kit de réactifs RT PrimeScript | TAKARA, Japon | RR037Q | Pour la synthèse de l’ADNc en RT - qPCR |
| Système PCR en temps réel | Roche, Suisse | LightCycler 480 | Utilisé pour la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel pour l’analyse de l’expression génique. |
| Tampon de lyse RIPA | TAKARA, Japon | ; RR9161 | Pour l’extraction de protéines dans l’analyse Western blot |
| Shaker | Thermo, USA | MAXQ-4000 | Utilisé pour secouer des échantillons lors d’expériences. |
| SPSS | IBM, USA | 28 | Pour l’analyse des données |
| Solution saline stérile | Solarbio, Chine | S8160 | Utilisation dans le traitement de groupes de véhicules |
| Kit TB Green Premix Ex Taq II | TAKARA, Japon | RR820S | Utilisé en RT - qPCR |
| Microscope électronique à transmission (TEM) | Hitachi, Japon | HT7800/HT7700 | Utilisé pour l’observation ultrastructurale à l’échelle nanométrique. |
| Réactif Trizol | Ambion, Chine | 15596018 | Pour extraire l’ARN total en RT - qPCR |
| Ultramicrotome | Leica, Allemagne | Leica UC7 | Utilisé pour couper des sections ultra fines pour le TEM. |
| Système universel de transfert de protéines / Machine de transfert de protéines | Bio-Rad, USA | Trans-Blot Turbo | Utilisé pour le transfert de protéines dans le Western blotting. |
| Microscope optique vertical | Nikon, Japon | Nikon Eclipse E100 | Utilisé pour l’observation microscopique optique verticale. |
| Acétate d’uranyle | Merck, Allemagne | 201030 | Pour la coloration de coupes ultrafines dans l’analyse TEM des tissus testiculaires |
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