Procédures pour l’identification des inhibiteurs d’entrée du SARS-CoV-2 en tant qu’antiviraux potentiels à l’aide de pseudovirus à base de MLV

Résumé

Cet article décrit la méthodologie pour générer des particules pseudotypées de SARS-CoV-2 à l’aide d’un système de rapporteurs luciférase et son utilisation pour identifier les inhibiteurs d’entrée. Ces protocoles sont démontrés à l’aide de deux inhibiteurs d’entrée différents, une protéine de fusion humaine ACE2-Fc recombinante et le composé à petite molécule arbidol.

Résumé

Le virus SARS-CoV-2 est un agent pathogène zoonotique émergent qui a causé un énorme fardeau de maladies et de mortalité dans le monde entier depuis son apparition en 2019. Des plateformes sûres et accessibles pour évaluer l’entrée virale et les composés antiviraux potentiels restent essentielles pour la découverte continue de médicaments contre les variants émergents. Cet article décrit un protocole hautement optimisé pour générer des particules pseudotypées basées sur le virus de la leucémie murine (MLV) exprimant la protéine spike SARS-CoV-2 et portant un gène rapporteur luciférase, permettant l’étude de l’entrée virale dans des conditions de biosécurité de niveau 2. Les méthodes décrites détaillent l’utilisation de lignées cellulaires optimisées, une grande efficacité de transfection à l’aide de réactifs rentables, la production de pseudovirus très efficaces et la titration de l’infectiosité pour déterminer l’apport viral minimum pour les tests de dépistage. Les résultats représentatifs démontrent une activité luciférase robuste dans les cellules infectées comparée aux témoins non infectés, tandis que les pseudovirus sans pic et VSV-G confirment la spécificité du test. De plus, le système soutient le criblage des composés en quantifiant les effets inhibiteurs sur l’entrée virale et en évaluant la cytotoxicité à l’aide d’un test de viabilité MTT. Dans l’ensemble, ce protocole reproductible et évolutif offre une plateforme fiable pour le dépistage à débit moyen à élevé de nouveaux inhibiteurs d’entrée virale, contribuant à l’identification des candidats antiviraux et à l’avancement de la recherche sur les mécanismes d’entrée du SARS-CoV-2.

Introduction

L’apparition du Coronavirus 2 du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère (SARS-CoV-2) fin 2019 a conduit à une pandémie mondiale qui a causé des millions de décès dans le monde et continue de représenter une menace grâce à de nouveaux variants avec une transmissibilité accrue et un potentiel d’évasion^{immunitaire 1}. En tant que virus à ARN enveloppé de la famille des Coronaviridae, le SARS-CoV-2 utilise sa glycoprotéine trimérique spike (S) pour médier l’entrée des cellules hôtes en se liant au récepteur de l’enzyme convertissante angiotensine 2 (ACE2) et en subissant une activation protéolytique par TMPRSS2 et d’autres protéases^{hôtes 2,3}. Bien que plusieurs options de traitement aient été développées pour gérer les symptômes du COVID-19, l’évolution continue et le développement rapide des variants viraux soulignent l’urgence de disposer de systèmes sûrs et évolutifs pour étudier l’entrée virale et évaluer de nouveaux composés antiviraux ciblant cette première étape de l’infection⁴.

Le virus SARS-CoV-2 reste classé comme agent^{de biosécurité de niveau 3} 5 dans certains territoires en raison de son potentiel de transmission élevé. Par conséquent, toute tâche de laboratoire réplicatif nécessite une installation BSL-3 à haute contenance, ce qui entrave la capacité de la plupart des laboratoires de terrain à mener des recherches scientifiques avec ce virus. Les systèmes à base de virus pseudotypés, également appelés pseudovirus (PV), offrent une alternative pratique permettant des études d’entrée virale dans des laboratoires de biosécurité niveau 2 (BSL-2), élargissant ainsi l’accessibilité des efforts de recherche^{mondiaux 6}. Les particules pseudotypées portant la protéine spike SARS-CoV-2 ne sont pas réplicatives, ce qui en fait un substitut sûr pour évaluer l’entrée du virus et dépister les inhibiteurs de petites^{molécules 7}. Ces particules peuvent être modifiées pour transporter un gène de luciférase ou de fluorescence, permettant une détection rapide et quantitative de l’infection en mesurant le signal rapporteur dans les cellules infectées. Les systèmes basés sur le virus de la leucémie murine (MLV) ou les colonnes vertébrales lentivirales ont été largement utilisés pour étudier l’entrée du SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, virus Ebola, entre autres 8,9,10,11.

Dans ces protocoles, nous décrivons la génération de PV basés sur MLV à l’aide d’un système à trois plasmides, sur la base des travaux rapportés par Millet et Whittaker⁸. Les plasmides utilisés incluent un plasmide d’emballage codant pour les gènes du cœur MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), un vecteur de transfert codant pour le gène rapporteur luciférase (pTG-Luc), et un plasmide exprimant la glycoprotéine de pointe SARS-CoV-2 correspondant au variant original de Wuhan-Hu-1. De plus, des pseudovirus sont également générés à partir de la G-glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G), qui sera ensuite utilisée comme contre-criblage des impacts potentiels. Les pseudovirus sont produits dans des cellules dérivées de HEK293 et utilisés pour infecter des cellules très sensibles exprimant de manière stable hACE2 et TMPRSS2. L’efficacité de la transfection est d’abord évaluée à l’aide d’un plasmide exprimant une protéine fluorescente verte (GFP). Ensuite, en utilisant des conditions de transfection optimisées, les PV sont générés par la co-transfection de ces trois plasmides, suivis de la titration des virus résultants. En utilisant la quantité appropriée de PV, un test est réalisé dans des plaques de 96 puits pour dépister les composés capables d’inhiber l’entrée des virus. Ce protocole utilise la polyéthyléniine ramifiée (PEI) comme réactif de transfection rentable, permettant une mise en œuvre plus facile des procédures.

Protocole

1. Transfection à haute efficacité des cellules dérivées de HEK293T utilisant la polyéthylène ramifiée (PEI)

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes dans une armoire de biosécurité en utilisant la technique aseptique standard et les procédures BSL-2. Utiliser des cellules dérivées de HEK293T pour la transfection et la génération de virus pseudotypés. Dans cette méthode, les cellules sont transfectées dans des plaques de 6 puits traitées en culture cellulaire. La solution de stock PEI est préparée comme décrit précédemment par Yang et ses collègues (2017)¹². Avant de procéder à la triple transfection pour générer le pseudovirus, il est conseillé d’optimiser la meilleure proportion d’ADN par plasmide du PEI afin d’assurer une efficacité de transfection élevée (plus de 70-80 %). Cette optimisation doit être réalisée par la transfection d’un plasmide exprimant une protéine fluorescente verte (GFP), puis par la vérification de la proportion de cellules fluorescentes à l’aide d’un microscope à fluorescence. Pour cette optimisation, maintenir l’ADN plasmidique constant à 2,5 μg par puits et tester plusieurs quantités de PEI, dans la plage de 1 à 20 μL. Voici les meilleures conditions pour ces lots de cellules et PEI, composés de 5 μL de solution de type PEI (1 mg/mL) et 2,5 μg de plasmide exprimant GFP par puits dans une plaque à 6 puits.

1. Semez 7,5 x¹⁰ cellules dérivées de HEK293 par puits dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits, dans un volume total de 2 mL par puits de milieu complet (DMEM-C : Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium complété avec 10 % de sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur (FBS), 20 mM d’acide 4-(2-hydroxyétyl)-1-piperazine-éthanessulfonique (HEPES), 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) 24 heures avant la transfection.
   REMARQUE : Lors de l’ensemencement des cellules, évitez de déplacer la plaque de culture tissulaire en mouvements circulaires, car cela peut entraîner une agrégation cellulaire au centre des puits, entraînant une distribution cellulaire irrégulière et une efficacité de transfection inférieure. Une plaque à 6 puits suffit pour une expérience, incluant un puits comme contrôle cellulaire (non transfecté), et le reste de la plaque pour tester plusieurs proportions d’ADN plasmidique PEI.
2. Incubez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant la nuit. Le lendemain, assurez-vous que les cellules sont à environ 50-60 % de confluent.
3. Le jour de la transfection, préparez les complexes d’ADN plasmidique PEI dans des tubes microcentrifuges stériles de 1,5 mL.
   1. Pour chaque puits, préparez un tube de solution PEI contenant 5 μL de stock PEI (1 mg/mL) dans 50 μL de milieu sérique réduit, et un tube de solution d’ADN contenant 2,5 μg du plasmide exprimant la GFP, dans 50 μL du même milieu.
   2. Si plusieurs puits doivent être transfectés, les solutions peuvent être agrandies en conséquence. Mélangez brièvement chaque tube avec un vortex et tournez vers le bas pendant 5 secondes. Incubez les tubes à température ambiante (RT) pendant 10 minutes.
4. Pendant cette incubation, retirez soigneusement le milieu de chaque puits de la plaque à 6 puits, évitant ainsi la perturbation de la monocouche cellulaire. Remplacez soigneusement par 1 mL/puits de milieu de transfection complet (DMEM-T, comme le DMEM-C, mais sans antibiotiques).
5. Préparez le complexe de transfection. Après les 10 minutes d’incubation, ajoutez les 50 μl du tube de solution d’ADN au tube de solution PEI. Mélangez rapidement en pipettant six fois et incubez à RT pendant exactement 3 minutes. On ajoute immédiatement un complexe goutte à goutte aux cellules de chaque puits correspondant.
6. Scellez les bordures de la plaque avec du parafilm et une centrifugeuse à 1 000 x g pendant 30 minutes en RT, sans frein, à l’aide d’un disque à bascule et d’un godet à plaque.
7. Après centrifugation, retirez doucement le parafilm et faites couver la plaque à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 3 heures.
8. Après l’incubation, retirez doucement le milieu de transfection de chaque puits et remplacez-le lentement par 2 mL de DMEM-C préchauffé par puits.
9. Incuber les cellules transfectées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures.
10. Évaluer l’efficacité de la transfection par expression GFP à l’aide de la microscopie à fluorescence. La fréquence des cellules fluorescentes doit être supérieure à 70-80 % (Figure 1). Cela est crucial pour l’efficacité de la méthode suivante de la section 2.

2. Génération de particules pseudovirales pseudotypées par spik- et VSV-G par le SARS-CoV-2

REMARQUE : Cette méthode utilise la même procédure que la section 1, sauf qu’au lieu d’utiliser le plasmide GFP, les cellules seront co-transfectées avec les trois plasmides nécessaires à la génération de virus pseudotypés, en utilisant les conditions optimales de transfection pour assurer une efficacité de transfection élevée. Le protocole utilise également des cellules dérivées de HEK293T dans des plaques à 6 puits, suffisantes pour les trois conditions requises suivantes : a) cellules non transfectées (un puits), b) cellules transfectées uniquement avec le plasmide d’emballage MLV et le vecteur de transfert rapporteur luciférase (un puits ; pseudovirus sans pointe) et c) cellules transfectées avec ces deux plasmides et le plasmide exprimant des pics pour générer des virus pseudotypés SARS-CoV-2 (quatre puits). Le plasmide exprimant le pic utilisé ici code pour le pic de la souche de Wuhan du SARS-CoV-2, et contient des modifications de séquence permettant une présentation efficace de la protéine dans les PV. Le pseudovirus sans pic sera nécessaire en contrôle plus tard lors des infections, afin de valider l’entrée dépendante du pic dans les cellules permissives. De même, les VSV-G-PV sont générés selon le même plan expérimental pour être utilisés ultérieurement comme contre-criblage de composés inhibiteurs potentiels. Si un volume plus important de pseudovirus est requis, le protocole peut être réduit à deux plaques de 6 puits, ce qui peut également être pratique pour l’étape de centrifugation des plaques.

1. La veille de la transfection, semez les cellules dérivées de HEK293T en deux plaques à 6 puits, comme décrit à la section 1. Utilisez une plaque pour la génération de SPV-PV et l’autre pour les VSV-G-PV.
2. Le jour de la transfection, préparez les mélanges de transfection comme indiqué dans le tableau 1, en suivant l’étape 1.3.
   REMARQUE : La solution PEI est préparée comme indiqué^{précédemment 12}. Les plasmides pCMV-MLVgagpol et pTG-Luc ont été obtenus de Millet et Whittaker⁸. Le plasmide pVSV-G a été obtenu auprès de Gee et al. 2020¹³. Tous les plasmides doivent être préparés à l’avance sous forme de préparations de haute qualité, exemptes d’endotoxines. Il est recommandé d’utiliser des kits maxiprep disponibles dans le commerce, avec une dernière étape de filtration stérile via un filtre à seringue à faible liaison de 0,2 μm.
3. Mélangez chaque tube comme décrit dans la section 1 et éclovez à la RT pendant 10 minutes.
4. Pendant cette incubation, retirez soigneusement le milieu de chaque puits des plaques à 6 puits, évitant ainsi la perturbation de la monocouche cellulaire. Remplacez lentement par 1 mL de milieu DMEM-T préchauffé dans chaque puits, en veillant à ce que le milieu descende le long de la paroi du puits et non directement sur les cellules.
5. Préparez les complexes de transfection comme décrit à la section 1 et transfectez les cellules en suivant le protocole précédemment décrit.
6. Après l’incubation de 48 heures post-transfection, on collecte les surnatants, on les transfère dans des tubes centrifugeuses coniques stériles de 50 mL, puis on centrifuge à 290 x g pendant 7 minutes à 4 °C. Collectez le surnageant sans cellules et filtrez-le à l’aide d’une unité de filtration stérile en bouteille à fluorure de polyvinylidène (PVDF), à 0,45 μm. Préparez des aliquotes de 1 mL et conservez-les à -80 °C.
   REMARQUE : Les particules pseudotypées restent stables à -80 °C pendant plusieurs mois. Évitez les cycles répétés de gel-dégel pour préserver l’infectieux.

	Pour les pics-PV du SARS-CoV-2 (par puits)	Pour les VSV-G-PV (par puits)	Pour les PV sans pics (par puits)
Solution pour l’Î.-É.-É. :
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
Milieu sérique réduit	45 μL	45 μL	45 μL
Solution d’ADN plasmidique :2
pCMV-MLVgagpol	0,79 μg	0,79 μg	0,79 μg
pTG-luc	0,92 μg	0,92 μg	0,92 μg
Pointe pUNO1	0,79 μg	-	-
pVSV-G	-	0,79 μg	-
Milieu sérique réduit	à 50 μL	à 50 μL	Jusqu’à 50 μL

Tableau 1 : Préparation des mélanges de transfection pour la génération de PV.

3. Titrage des particules pseudotypées SARS-CoV-2 et VSV-G

REMARQUE : Cette étape est essentielle pour confirmer que les particules pseudotypées produites sont infectieuses et pour déterminer le volume effectif minimum requis pour des applications en aval telles que le criblage des composés. La titration doit être effectuée pour chaque nouveau lot de pseudovirus. À cette fin, les cellules très sensibles à l’infection par le SARS-CoV-2 (cellules HSI) sont infectées par des quantités décroissantes des virus pseudotypés. L’entrée des pseudovirus, médiée par l’interaction spike-humain ACE2, ou par le VSV-G avec d’autres récepteurs cellulaires, est surveillée 72 heures plus tard par la détection de l’activité luciférase dans un test de luminescence.

1. La veille de la transduction, semez 2,5 x 10 4^{cellules HSI} par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits, dans 50 μL de milieu complet (DMEM-C). Préparez trois puits pour chaque quantité de pseudovirus à tester, et incluez des puits pour l’infection, également pour les pseudovirus sans pointe, et pour les cellules non infectées. Incubez la plaque à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant la nuit.
2. Le jour de la transduction, décongelez une aliquote de chaque lot de pseudovirus pour tester sur glace et mélanger doucement par inversion. Incluez également une aliquote du contrôle sans pointe. Ajouter directement à chaque puits plusieurs quantités de préparation du pseudovirus (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 et 0,8 μL). Ajustez les volumes de tous les puits à 150 μL avec du DMEM-C.
3. Scellez la plaque avec un parafilm et une centrifugeuse à 2 500 × g pendant 45 minutes en RT, sans frein.
4. Retirez le parafilm et faites éclore la plaque pendant 72 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
5. Après l’incubation, préparez-vous pour le test de luciférase en suivant les instructions du fabricant. Dégel le substrat de luciférase (stocké à -80 °C) et 5x tampon de lyse pour l’essai luciférase (stocké à -20 °C) et s’équilibrer à RT (10-15 min).
6. Diluez le tampon de lyse du test de luciférase à 1x avec de l’eau stérile. Préparez au moins 3 mL.
7. Aspirez lentement et prudemment le surnageant de chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal.
8. Ajoutez 30 μL de tampon de lyse 1x à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal. Placez la plaque dans un vibrateur de plaques pendant 10 minutes à 150 tr/min, en RT. Vérifiez la lyse complète sous un microscope inversé (toutes les cellules doivent être lysées et non distinguables à l’examen visuel).
   REMARQUE : Préparez à l’avance le lecteur de microplaques pour effectuer la détection de luminescence immédiatement après l’ajout du substrat afin d’assurer la cohérence et d’éviter la dégradation du signal.
9. Transférez les lysats sur une plaque blanche opaque, à 96 puits.
10. Ajoutez 50 μL de substrat de luciférase à chaque puits et mélangez brièvement en déplaçant la plaque en mouvement circulaire. Placez la plaque dans le luminomètre et mesurez la luminescence.
11. Analysez les données obtenues.
    1. Vérifiez que les contrôles donnent les valeurs de luminescence attendues. Assurez-vous que les cellules non infectées offrent des valeurs de luminescence de fond très faibles.
       REMARQUE : Les cellules infectées par le pseudovirus sans pointe doivent donner des valeurs au niveau des cellules non infectées, et celles infectées par des quantités décroissantes de pseudovirus présentant des pics doivent présenter des valeurs élevées de luminescence dépendantes de la dose (Figure 2). Les valeurs de luminescence générées par les VSV-G-PV sont généralement bien supérieures à celles des spike-PV, soit environ un ou deux ordres de grandeur.
    2. Pour les dépistages ultérieurs, sélectionnez la quantité de pseudovirus qui génère un signal au moins cent à mille fois supérieur à celui des cellules non infectées.

4. Dépistage des composés pour l’inhibition de l’entrée pseudovirale à l’aide de spike-PVs

1. Semez 2,5 x 10⁴ cellules HSI par puits dans 50 μL de milieu complet (DMEM-C) dans une plaque à 96 puits, comme décrit à la section 3. Incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂.
   1. Considérons un design de plaques incluant les colonnes 1 à 11 pour les composés plus le pseudovirus, et la colonne 12 pour les témoins. Dans la colonne 12, allouez quatre puits pour le contrôle viral (pseudovirus uniquement) et quatre puits pour les cellules non infectées et non traitées.
2. Le lendemain, préparez des dilutions en série (1:3) de composés à tester, à partir de 50 μM (concentrations finales lors des infections : 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 et 0,06 μM), dans du DMEM-C contenant 0,5 % de DMSO.
   1. Pour plus de commodité, préparez les dilutions dans une « plaque de dilution » séparée de 96 puits, où les dilutions en série sont d’abord effectuées puis transférées (50 μL) sur la plaque contenant les cellules.
   2. Si le nombre de composés est très élevé, de l’ordre de centaines ou plus, réduisez cette première série de dilution à environ 4 points, en utilisant un seul puits par point de dilution, et envisagez un pré-filtrage. Ensuite, on reteste les impacts potentiels en utilisant des dilutions sérielles à 7 points, 1:3, avec trois réplications, en partant de la même concentration de 50 μM.
3. Une fois les dilutions des composés prêtes, aspirez doucement le milieu des cellules à l’aide d’une pipette multicanal et ajoutez 50 μL de dilutions composées aux puits correspondants. Incuber pendant 1 heure à 37 °C, 5 % de CO₂. Pour les contrôles de la colonne 12, ajoutez uniquement DMEM-C.
4. Sans retirer les composés, ajoutez à chaque puits la quantité prédéterminée de pseudovirus SARS-CoV-2 pseudotypé, dans un volume de 50 μL de milieu complet, contenant les composés aux mêmes concentrations. Scellez les plaques avec du parafilm.
5. Centrifugez la plaque à 2 500 × g pendant 45 minutes en retrait sans frein, puis retirez le parafilm et incubez à 37 °C, 5 % de_CO2 pendant 72 heures.
6. Procéder à la quantification de l’infectiosité basée sur la luciférase comme décrit à la section 3.
7. Effectuer une analyse de données.
   1. Exportez les valeurs de luminescence dans un tableau Excel pour formater les données afin de les importer ultérieurement dans un logiciel d’analyse et de graphique.
   2. Préparez des graphiques à barres représentant la moyenne de chaque point de concentration, y compris l’erreur standard des barres moyennes. On retrouve également les valeurs obtenues à partir de contrôles positifs (PV seuls) et négatifs (cellules non infectées).
      REMARQUE : Les résultats du test sont considérés comme valides si 1) les cellules non infectées montrent des valeurs très faibles, 2) les PVs contrôles montrent des valeurs élevées, 3) le contrôle positif de l’inhibition (c’est-à-dire arbidol ou hACE2-Fc) montre une inhibition de l’infection, de manière dépendant de la dose (Figure 3A, B).
   3. Ensuite, observez les valeurs produites par des composés inconnus pour évaluer s’il existe une inhibition et un effet dépendant de la dose. Si tel est le cas, soumettez ces composés à des analyses confirmatoires supplémentaires.
      REMARQUE : Pour une confirmation supplémentaire des impacts potentiels, suivez les étapes suivantes. Commencez par retester les composés potentiels comme suggéré à l’étape 4.2. Si l’effet de réponse à la dose est confirmé, effectuez alors un contre-criblage utilisant la même série de dilution mais en infectant avec les VSV-G-PV. Ce test est important pour vérifier si l’inhibition de l’entrée est spécifique à l’interaction spike-ACE2, et non due à une interférence à une autre étape ultérieure de la production de la luciférase dans les cellules infectées (Figure 3A, B). Ici, le composé positif ne doit pas présenter d’activité inhibitrice contre les VSV-G-PV. Si tel est le cas, alors la même série de concentrations devrait être testée pour la cytotoxicité à l’aide d’un test de viabilité cellulaire (test MTT, illustré à la section 5). En résumé, un composé potentiel de choc devrait montrer une inhibition des pics-PV du SARS-CoV-2, aucune ou moindre inhibition des VSV-G-PV, et aucune, ou du moins une inhibition beaucoup plus faible de la viabilité des cellules. L’ajustement d’une courbe dose-réponse à partir des données de luminescence permettra d’estimer la concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀) pour l’inhibition des PV, et une concentration cytotoxique demi-maximale (CC₅₀) à partir du test de viabilité. Le rapport CC₅₀ / IC₅₀ est utilisé pour calculer l’indice de sélectivité (SI), qui est un indicateur important de l’utilité potentielle du composé positif. Pour l’analyse des courbes dose-réponse et l’estimation de l’IC₅₀ et du CC₅₀ , des procédures très détaillées ont été^{décrites 14}.

5. Essai de viabilité cellulaire basé sur MTT

1. Semez 2,5 x 10⁴ cellules HSI par puits dans 50 μL de DMEM-C dans une plaque à 96 puits. Incubez la plaque toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂. Assurez-vous que les cellules soient à environ 50 % de confluence le lendemain. Préparer suffisamment de puits, en tenant compte de toutes les différentes concentrations du composé à évaluer, des cellules non traitées et des puits vierges contenant uniquement un milieu, en triple exemplaire. Tester les composés potentiels de choque aux mêmes concentrations évaluées dans l’analyse d’inhibition d’entrée PV.
2. Après l’incubation, retirez soigneusement le milieu et remplacez-le par 100 μL de milieu complet contenant différentes concentrations du composé à évaluer, à 0,5 % de DMSO.
3. Centrifugez la plaque à 2 500 × g pendant 45 minutes en temps de réflexion sans frein et incubez pendant 72 heures à 37 °C, 5 % de CO₂. Cette étape est incluse pour traiter les cellules exactement comme dans la section précédente, sauf pour l’ajout des PV.
4. Préparez une solution de 0,5 mg/mL de MTT avec du DMEM. Stérilisez en filtrant à 0,2 μm et gardez dans l’obscurité.
   REMARQUE : Le bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) est sensible à la lumière. Il doit être conservé gelé, dans le noir.
5. Retirez soigneusement le milieu de chaque puits et remplacez-le par 100 μL de solution MTT. Incubez pendant 2 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
6. Pendant cette incubation, préparez une solution de solubilisation contenant 40 mM de HCl en alcool isopropylique.
7. Retirez soigneusement la solution MTT à l’aide d’une pipette multicanal, sans perturber les cristaux de formazan au fond de chaque puits.
8. Ajoutez 100 μL de solution de solubilisation à chaque puits. Enveloppez l’assiette dans du papier aluminium et placez-la sur un shaker à assiettes à 150 tr/min pendant 15 minutes.
9. Enregistrez l’absorption à 570 nm et 630 nm.
10. Effectuer une analyse de données.
    1. En utilisant les valeurs brutes de densité optique, soustrayez les valeurs obtenues à 630 nm de celles obtenues à 570 nm pour chaque puits. Ensuite, faites la moyenne des valeurs corrigées des puits de cellules non traitées. Considérez ces cellules non traitées comme 100 % viables.
    2. Normalisez ensuite les valeurs des cellules traitées par rapport aux puits des cellules non traitées, en utilisant la formule suivante :
       Viabilité ( %) =
11. Tracez les pourcentages de viabilité sous forme de barres représentant la moyenne des réplications ±±erreur standard de la moyenne. Effectuer une analyse statistique supplémentaire pour comparer les groupes en utilisant des procédures mises en œuvre dans un logiciel d’analyse de données et de graphisme, comparant les viabilités à différentes concentrations avec celles des cellules non traitées.
12. Comparez les moyennes de chaque point de concentration avec celles des cellules traitées uniquement par DMSO utilisant le test post-test non paramétrique de Kruskal-Wallis avec Dunn (les différences sont considérées comme significatives à des valeurs p < 0,05). Pour tracer une courbe dose-réponse et estimer le CC₅₀ à partir des valeurs OD, vérifiez la procédure rapportée ailleurs¹⁴.

Résultats

Plusieurs méthodes de transfection ont été rapportées comme générant des PV, notamment le phosphate de^{calcium 15}, les méthodes à base de^{lipides 16} et l’IEP, à la fois linéaires et ramifiées. Cet article montre que la transfection de cellules dérivées de HEK293T avec une IPE ramifiée permet une transfection à haute efficacité (Figure 1), généralement comparable aux méthodes de transfection utilisant des agents d...

Discussion

Cette polyvalence du système MLV pour générer des pseudotypes pour d’autres virus a été rapportée par d’autres virus importants, tels que le virus^{Ebola 18}, le MERS-CoV⁸, le SARS-CoV¹⁹, le virus La^{Crosse 20}, le Hantavirus²⁰, le virus^{Visna 21}, l’Arenavirus²², le virus de la^{grippe 23}, et d’autres. Ces ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,2 & micro ; m Filtres à seringues à faible liaison aux protéines   ;	Thermo Scientific	720-1320	Filtres à seringue (0,2 & mu ; m,13 mm, PES, stérile)
Solution 1X à 0,25 % de trypsine-EDTA	Gibco	25200-056	Trypsine-EDTA (0,25 %), phénol rouge
0,45 & micro ; m Unités de filtration à bouchon de bouteille PVDF   ;	Avantor	514-1045	Systèmes de filtration sous vide à surface de bouteille (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 & micro ; m)
Tubes microcentrifuges stériles de 1,5 mL	Eppendorf	30123611	Safe-Lock & nbsp ; Tubes
Solution 100 X de pénicilline Streptomycine	Corning	30-002-CI	Solution de pénicilline-streptomycine, 100x
5 X tampon de lyse de l’analyse luciférase   ;	Promega	E2650	Partie du système d’analyse luciférase Promega Bright-Glo
Tubes coniques stériles de 50 mL	Corning  ;	352070	Tube centrifugeuse PP haute clarté de 50 mL, fond conique, stérile
Plaques de culture tissulaire à 6 puits	Thermo Scientific	140675	Multiplats traités en culture cellulaire
Plaques de culture tissulaire à 96 puits	Thermo Scientific	168055	Nunc&trade ; Microwell & commerce ; 96-Puits, microplaque à fond plat traitée par Nunclon Delta
Chlorhydrate d’arbidol	Sigma-Aldrich	SML0860
Polyéthylénine ramifiée, 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
Microscope laser confocal   ; (FV 3000)	Olympus Co.	SKU : FV3000
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM (Eagle Medium modifié de Dulbecco) avec : glucose élevé, L-glutamine, rouge de phénol, pyruvate de sodium)	Gibco	11995-065
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	26140-079	Inactivé par la chaleur (56 degrés ; C, 30 min)
Cellules dérivées de HEK293T (Lignée cellulaire Lenti-X 293T)	Biographie de Takara	632180	Sous-clone hautement transfectable de la lignée cellulaire HEK293 et soutient des niveaux élevés d’expression protéique virale
Tampon HEPES	Gibco	15630-080
Cellules très susceptibles à l’infection (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Ligne cellulaire)	Ressources BEI	NR-55293	HEK293T lignée cellulaire modifiée pour exprimer de manière stable ACE2 et TMPRSS2
Acide chlorhydrique  ;	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
Microscope à contraste de phase inversé   ;	Olympus Co.  ;	SKU : 2404040005
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
Substrat de luciférase	Promega	E2650	partie du système d’analyse luciférase à glo clair
Lecteur de microplaques avec détection de luminescence	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [bromure 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltézolium]	Sigma-Aldrich	M2128
Plaques blanches opaques à 96 puits	Corning	3917	Microplaques en polystyrène plat à fond plat solide à 96 puits traitées TC
Parafilm	Bemis	PM999
plasmide pcDNA3-EGFP	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP était un cadeau de Doug Golenbock (plasmide Addgene #13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID : Addgene_13031)
plasmide pCMV-MLVgagpol	-	-	Généreusement offert par le Dr Gary Whittaker & nbsp ;
Solution saline tamponnée phosphate sans Ca2+ ni Mg2+ (PBS)	Corning	21-040-CV	Solution physiologique tamponnée phosphate, 1X sans calcium ni magnésium
Système de plasmides Promega PureYield Maxiprep	Promega	A2393
Plasmide pTG-Luc	-	-	Généreusement offert par le Dr Gary Whittaker & nbsp ;
Plasmide pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan)	Invivogen	P1-Pointe
Plasmide pVSV-G	Addgene	138479	pVSV-G était un cadeau d’Akitsu Hotta (plasmide d’Addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID : Addgene_138479)
Protéine de fusion ACE2-Fc humaine recombinante	Invivogen	FC-HaCE2
Milieu sérique réduit (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Médium sérique réduit Opti-MEM