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Article de méthode

Étude de la glycolyse dans la microglie primaire à l’aide d’un test de flux extracellulaire

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DOI :

10.3791/69638

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10 avril 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rentable pour réaliser un test de résistance à la glycolyse afin de quantifier la reprogrammation métabolique dans la microglie primaire de la souris. Après isolement et stimulation inflammatoire, le taux d’acidification extracellulaire (RARE) est mesuré à l’aide de réactifs fraîchement préparés et ajustés en pH, suivi d’une normalisation des protéines afin de permettre une évaluation précise et reproductible des déplacements glycolytiques.

Résumé

La microglie, les macrophages résidentes du système nerveux central, modifie dynamiquement ses programmes métaboliques en réponse à des signaux physiologiques et pathologiques. Comprendre ces changements métaboliques est crucial pour clarifier leur rôle dans l’inflammation. Nous présentons ici un protocole détaillé pour évaluer le profil glycolytique de la microglie primaire isolée à partir des cortex cérébraux de souris néonatals à l’aide d’un test de résistance à la glycolyse sur un analyseur de flux extracellulaire. Ce test permet une mesure en temps réel de l’ECAR, un indicateur de l’activité glycolytique associée à un pH bas, comme le lactate. Notre approche consiste à traiter la microglie cultivée dans différentes conditions afin d’examiner comment les voies métaboliques sont modifiées en réponse à divers stimuli, y compris les stimuli pro-inflammatoires. De manière unique, notre laboratoire prépare des solutions de stock fraîches de différents réactifs, dont le glucose, l’oligomycine et le 2-désoxyglucose (2DG), pour cibler les différents aspects de la voie, avec un ajustement soigneux du pH pour chaque réactif afin d’assurer la précision et la reproductibilité expérimentales. Cette méthode offre une plateforme solide pour étudier la glycolyse dans la microglie primaire et offre un aperçu de leurs états fonctionnels dans des conditions inflammatoires ou liées à la maladie.

Introduction

Les cellules du système nerveux central modifient leur production d’énergie en réponse à des conditions normales etpathologiques 1,2. Parmi les principales voies métaboliques, la glycolyse et la phosphorylation oxydative (OXPHOS) sont des voies clés qui régulent les fonctions des cellules immunitaires – elles subissent soit une réaction robuste et immédiate aux conditions pro-inflammatoires que contre des anti-inflammatoires,respectivement 3,4. Ainsi, les cellules immunitaires peuvent alterner entre les voies métaboliques en réponse aux signaux inflammatoires et aux étatsfonctionnels 5. Les microglies, comme leurs homologues myéloïdes, sont métaboliquement liées à leurs fonctions et s’adaptent rapidement à différentes voies métaboliques en tant que carburant métabolique alternatif, démontrant une flexibilitémétabolique 6,7. La microglie subit une reprogrammation métabolique rapide lors de l’inflammation, la glycolyse accrue servant de signature métabolique clé des étatspro-inflammatoires. Ainsi, des tests permettant d’identifier la dépendance cellulaire à un phénotype métabolique nous permettent d’étudier leurs états fonctionnels dans diverses conditions. Dans le protocole actuel, nous visons à déterminer si la microglie primaire dépend d’une glycolyse accrue lors des conditions pro-inflammatoires. Pour cela, nous réalisons régulièrement des tests d’effort de glycolyse. Bien que l’analyseur Seahorse XFe24 (analyseur de flux extracellulaire) ait été largement utilisé pour mesurer l’ECAR dans des lignées cellulaires immortalisées et des cellules transformées, la microglie primaire pose des défis techniques uniques, notamment des rendements cellulaires limités, des propriétés d’adhésion variables et une forte sensibilité aux conditions de culture, ce qui peut perturber les mesures métaboliques. De plus, il fournit une mesure en temps réel de l’ECAR, permettant une évaluation précise de la glycolyse alimentée par le lactate à plusieurs moments précis, ce qui ne peut être capturé uniquement par les tests de lactate de point final. Le profilage métabolique extracellulaire basé sur le flux a été largement adopté dans la recherche sur le métabolisme pour caractériser la bioénergétique cellulaire, ce qui rend ce protocole particulièrement adapté aux études sur les changements métaboliques des cellules lors de l’activation, de la modélisation de maladies ou des tests de médicaments. Les lecteurs peuvent déterminer leur adéquation en fonction de leur besoin de mesures glycolytiques dynamiques et à haute résolution au sein des cellules primaires.

Le glucose est métabolisé en pyruvate via la glycolyse, puis converti en lactate dans le cytoplasme ou en CO₂ et eau dans les mitochondries. La conversion du glucose en lactate entraîne la libération de protons dans l’espace extracellulaire, entraînant l’acidification du milieu. L’analyseur de flux extracellulaire quantifie cette acidification sous le nomd’ECAR 9. Lors du test de résistance à la glycolyse, les cellules sont d’abord incubées dans un milieu sans glucose ni pyruvate, et leur ECAR de base est enregistrée. La première injection délivre une quantité saturante de glucose, que les cellules métabolisent via la glycolyse pour le pyruvate, produisant de l’ATP, du NADH, de l’eau et des protons. L’augmentation de la libération de protons élève la RCE, reflétant la « glycolyse ». Ensuite, l’oligomycine est ajoutée pour inhiber la synthèse mitochondriale d’ATP, obligeant les cellules à se fier uniquement à la glycolyse. Ce changement du gradient de protons augmente encore la RCE et est mesuré comme la capacité glycolytique maximale de la cellule. Enfin, le 2DG, un analogue du glucose, est introduit. Elle inhibe de manière compétitive l’hexokinase, bloquant la glycolyse et réduisant la RCE. Cette baisse confirme que l’ECAR antérieur dépendait de la glycolyse. La différence entre la capacité glycolytique maximale et le niveau de glycolyse définit la réserve glycolytique. L’ECAR initial avant l’addition de glucose représente une acidification non glycolytique due à d’autres processus cellulaires (Figure 1).

Nous avons réalisé un test de résistance à la glycolyse à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Les valeurs ECAR brutes étaient exportées vers Excel pour analyse. Pour chaque condition, nous avons identifié les points temporels correspondant à l’ECAR basale (avant l’ajout de glucose), à la glycolyse (après l’injection de glucose) et à la capacité glycolytique (après un traitement à l’oligomycine). Les valeurs d’ECAR provenant des points temporels pertinents de chaque phase et entre les quatre réplications techniques ont été moyennées, et la glycolyse a été calculée comme l’augmentation de la CEA après l’ajout de glucose. La capacité glycolytique a été calculée par une augmentation de la RCE après l’ajout d’oligomycine. La réserve glycolytique a été calculée comme une diminution de la RCE après injection de 2DG. Ces valeurs moyennes ont ensuite été utilisées pour comparer les réponses métaboliques entre les groupes.

En revanche, pour évaluer le taux de consommation d’oxygène (OCR) et évaluer les fonctions mitochondriales, le test de stress mitochondrial (Agilent) est l’approche standard, qui mesure des paramètres tels que la respiration basale, la respiration liée à l’ATP, la fuite de protons, la respiration maximale, la capacité respiratoire de réserve et la respiration non mitochondriale. Ces mesures sont obtenues en injectant séquentiellement des inhibiteurs mitochondriaux spécifiques, l’oligomycine (inhibiteur ATP synthase), le FCCP (cyanure de carbonyle-4 (trifluoromethoxy)) phénylhydrazone), un découpleur qui favorise la respiration maximale, et la roténone/antimycine A (inhibiteurs complexes I/III), permettant une évaluation quantitative de la santé mitochondriale et de la bioénergétique 10,11,12,13. Les tests ECAR et OCR sont donc réalisés dans des conditions différentes.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives du Conseil canadien de la protection des animaux et ont reçu l’approbation du Comité de soins aux animaux de l’Université Memorial de Terre-Neuve selon le protocole numéro 22-01-DK.

1. Préparatifs avant le début des expériences

  1. Préparez la solution de dissection en ajoutant 10 mM de HEPES à 1x HBSS sans Ca2+ ni Mg2+.
  2. Préparez la solution digestive (par 2–3 cerveaux) en combinant 1 mL de trypsine à 2,5 % (10 fois du bouillon, non diluée), 2 mL de solution de dissection et 200 μL de DNase I (1 mg/mL).
  3. Préparez un milieu gliale mixte en complétant le DMEM avec 10 % de FBS, 1 x Glutamax et 1x antibiotique/antimycotique.
  4. Préparez un milieu microglial en complétant le DMEM avec 10 % de FBS, 1 x Glutamax, 1 NEAA de MEM, 1 pyruvate de sodium et 1 x pénicilline/streptomycine.

2. Placage pour cultures gliales mixtes (Figure 2A)

  1. Jour 1 :
    1. Prélever les petits jour postnatal (P0)-P2 de souris C57BL/6C et extraire les cortices au microscope stéréoscopique, puis retirer les méninges. Ensuite, disséquez les cortex en petits morceaux dans une solution de dissection et transférez-les dans un tube conique de 15 mL. Laissez les tissus se déposer au fond du tube.
    2. Décantez la solution de dissection et remplacez-la par 3 mL de solution digestive par 2 à 3 cerveaux. Triturez doucement à l’aide d’une pipette sérologique de 2 mL pour dissocier le tissu.
    3. Placez les tubes sur un rotor dans un incubateur à 37 °C, et mélangez en triturant à l’aide d’une pipette sérologique de 2 mL toutes les 8 minutes, pour un total d’environ 24 minutes.
    4. Après la digestion des tissus, centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Ensuite, jetez le surnageant et résuspendez la pellete dans 5 mL de milieux gliales mixtes.
    5. À l’aide d’une aiguille de 18 G dans une seringue de 5 mL, triturez les cellules, puis passez-les dans une passoire de cellules en nylon de 70 μm. Centrifugez à nouveau les cellules collectées à 300 x g pendant 5 minutes en RT.
    6. Resuspendez la pellete dans 1 mL de milieux gliales mixtes au début, triturez plusieurs fois pour éliminer les agglomérations cellulaires, puis remettez à nouveau en un volume plus élevé, atteignant jusqu’à 12 mL dans chaque flasque T75 (2 à 3 cortex cérébraux par flasque sont conseillés)
      REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de revêtir la fiole de poly-D-Lysine ou d’un autre réactif.
  2. Le deuxième jour, changez tout le substrat et ajoutez du nouveau mélange glial.
  3. Le troisième jour, remplacer environ les deuxtiers du média par du mitrailleur clair mixte. Laissez les cellules croître pendant sept jours supplémentaires, soit un total de 10 jours.
    REMARQUE : À ce stade, une couche d’astrocytes peut être observée.
  4. Le 6e jour, remplacez les deux tiers du substrat par du médium gliale mixte frais. Confirmez la présence d’une couche d’astrocytes confluente.

3. Obtention pure de la microglie primaire (Figure 2A)

REMARQUE : Vers le jour 10, de petites cellules rondes flottant au-dessus de la couche astrocytaire sont visibles ; il s’agit principalement de microglies (Figure 2B).

  1. Secouez la flasque à 250 tr/min pendant 2 heures à 37 °C. Rassemblez tout le média contenant les cellules flottantes dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 300 x g pendant 10 minutes.
  2. Resuspendez la pellete dans un milieu microglial et placez environ 250 000 cellules par puits dans les microplaques de culture cellulaire de l’analyseur de flux extracellulaire.
    REMARQUE : Environ 3 à 4 millions de cellules par mL sont obtenues à partir de trois flasques T75 ; le revêtement des plaques de culture cellulaire avec de la poly-D-lysine ou d’autres réactifs n’est pas une nécessité.
  3. Incubez la microplaque à 5 % deCO2 pendant 30 à 45 minutes. Ensuite, changez à nouveau le milieu pour obtenir une culture de microglie pure et éliminer les oligodendrocytes qui pourraient encore flotter. Les cellules sont prêtes pour le traitement dès le lendemain (Figure 2C).
  4. Excluez les quatre puits désignés comme contrôles « en arrière-plan » de l’ensemencement des cellules : un dans chaque ligne (Figure 3C). Ces puits reçoivent des supports d’essai.
    REMARQUE : Remplir les puits inutilisés avec de l’eau stérile ou du PBS pour éviter l’évaporation du milieu, et placez les cellules selon un motif aléatoire plutôt que dans des rangées ou colonnes fixes pour minimiser la variabilité basée sur les plaques.

4. Traitement de la microglie primaire avec des stimuli pro-inflammatoires

  1. Au jour 11, traiter les cellules avec 100 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS) pendant 24 heures. Randomisez les puits contrôlés et traités par LPS pour écarter tout effet positionnel.
    REMARQUE : La durée des traitements peut varier selon les conditions expérimentales et nécessiter une optimisation préalable.

5. Préparation pour le test de flux extracellulaire un jour avant la réalisation de l’expérience

  1. Au jour 11, ajoutez 1 mL de tampon de calibrant à la plaque de calibration (format 24 puits ; kit de test de flux extracellulaire) dans tous les puits. Gardez la plaque toute la nuit à 37 °C sans CO2.
    REMARQUE : La plaque d’étalonnage se compose de 4 puits d’injection. Pour le test de résistance à la glycolyse, le glucose est ajouté au port A, l’oligomycine au port B, et la 2DG est injectée dans le port C (voir Figure 4A).
  2. Préparez des solutions de type Glucose et 2DG
    1. Glucose – Dissoudre 90 mg de glucose dans 2 mL de milieux de test de flux extracellulaire (Table of Materials). Au départ, dissouds environ 1,9 mL de sorte que, lorsque le pH est ajusté le lendemain avec 1N NaOH, le volume final ne dépasse pas 2 mL, ce qui est essentiel pour maintenir la molarité.
    2. 2DG – Dissolvez 328 mg dans 2 mL de média extracellulaire de test de flux.
      REMARQUE : Conservez à la fois le glucose et le 2DG à 4 °C pendant la nuit
  3. On ajoute 30 à 40 mL de média de test dans un tube conique de 50 mL et on les stocke à 4 °C pour effectuer les tests le lendemain.

6. Dosage de flux extracellulaire (jour 12)

  1. Le 12e jour, échauffez le glucose préconstitué, la 2DG et le média de test aliquoté à 37 °C. Ajustez le pH du glucose et du 2DG, ainsi que celui du milieu de test aliquoté, à 7,4 en ajoutant 1N NaOH par incréments (par exemple, 5 μL, puis 10 μL).
  2. Vortex brièvement pour un mélange uniforme jusqu’à ce que le pH dépasse 7.
    REMARQUE : Les bandes indicatrices de pH sont recommandées pour un suivi régulier du pH.
  3. Ajoutez 2 μL de solution d’oligomycine de 10 mM dans 2 mL de média d’essai ajusté au pH.
    1. Préparation en solution de réserve d’oligomycine de 10 mM : Reconstituer un flacon de 10 mg d’oligomycine dans 1 mL de DMSO stérile, en obtenant une concentration de 10 mg/mL, et conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
  4. Retirez les cellules de l’incubateur (de l’étape 4) et collectez le milieu dans des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL et centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes.
  5. Collectez le surnageant (jetez le pellet pour éliminer les cellules/débris) et conservez-le à -80 °C pour les mesures de lactate, mentionné à l’étape 8.
  6. Lavez les cellules avec 1 mL de média d’essai ajusté en pH très délicatement pour éviter de se détacher des cellules.
  7. Éliminez le milieu de test et ajoutez 500 μL de milieux ajustés au pH et incubez à 37 °C (sans CO2) pendant 45 minutes à 1 heure.
  8. En attendant, ajouter tous les inhibiteurs nécessaires à la plaque d’étalonnage de l’analyseur de flux extracellulaire dans leurs ports respectifs : 55 μL de glucose vers le port A en haut à gauche dans tous les puits, 60 μL d’oligomycine dans le port B vers les puits en haut à droite et 65 μL de 2DG dans le port C vers les puits en bas à gauche (y compris les puits de fond) (voir la Figure 4A).
    REMARQUE : L’augmentation de volume à chaque étape est nécessaire pour maintenir la molarité, car les volumes augmentent avec l’ajout préalable de glucose et d’oligomycine.
  9. Après avoir ajouté les inhibiteurs, réalisez un test de résistance à la glycolyse à l’aide du logiciel Agilent Seahorse Wave (voir Figure 3). Ensuite, faites passer la plaque de calibration dès que vous le demandez.
    REMARQUE : Retirez le couvercle supérieur de la plaque et le couvercle rose entre les plaques avant de placer la plaque de calibration dans la machine. Au cours de cette étape, les capteurs de pH etd’O2 seront testés et contrôlés par la qualité qualité.
  10. Une fois l’étalonnage terminé, la machine demandera de décharger la plaque d’étalonnage et de charger la plaque de culture.
    1. Étape I : Sélectionner le modèle d’essai (Figure 3A)
      1. Ouvrez le logiciel Wave , et dans la section Modèles , choisissez le modèle d’essai approprié pour l’expérience.
      2. Dans ce cas, sélectionnez « Test de stress de glycolyse XF » sur l’analyseur de flux extracellulaire.
    2. Étape II : Définir les groupes et les stratégies d’injection (Figure 3B)
      1. Allez dans l’onglet Définitions de groupe et créez des groupes expérimentaux (par exemple, Background, Control et LPS).
      2. Définissez la stratégie d’injection en sélectionnant les composés à injecter dans chaque port (par exemple, glucose, oligomycine, 2DG pour le test de résistance en glycolyse ; ces réglages sont prédéfinis par le logiciel par défaut, vérifiez en conséquence).
    3. Étape III : Assigner des groupes à la carte des plaques (Figure 3C)
      1. Ouvrez la vue Carte des plaques et attribuez les puits à chaque groupe en faisant glisser les noms des groupes (par exemple, Arrière-plan = noir, Contrôle = vert, LPS = rouge) sur la disposition des plaques.
      2. Assurez-vous que les puits vierges/arrière-plan sont désignés pour une normalisation précise.
    4. Étape IV : Mettre en place le protocole (Figure 3D)
      1. Dans l’onglet Protocole , programmez les cycles de mesure et les injections. La séquence typique pour le test de résistance à la glycolyse comprend l’acidification non glycolytique, l’injection de glucose (port A) → mesure la glycolyse, l’injection d’oligomycine (port B) → mesure la capacité glycolytique, l’injection de 2-DG (port C) → mesure la réserve glycolytique
      2. Définissez le nombre de cycles de mesure après chaque injection et ajustez le timing (par exemple, 3 cycles de mélange de 3 min, 2 minutes d’attente, mesure pendant 3 min).
        REMARQUE : Pour nos expériences, nous utilisons les paramètres par défaut du logiciel.
      3. Examinez le temps total de test avant de lancer le test.
    5. Étape V : Normalisation (Figure 3E)
      1. Normaliser les données avec les valeurs de concentration protéique obtenues à partir du test d’acide bicinchoninique (BCA) dans le logiciel Wave en utilisant l’option de normalisation intégrée (par exemple, par teneur en protéines, nombre de cellules ou autres méthodes disponibles). Les mesures de concentration en protéines sont présentées dans le tableau 1.
        REMARQUE : Le protocole d’isolement de la protéine pour le test BCA après la mesure de l’ECAR est décrit à l’étape 7 suivante.

7. Collecte de cellules pour la quantification et la normalisation des données

  1. Une fois le test de flux extracellulaire terminé, retirez la plaque de culture et procédez immédiatement à l’extraction des protéines ou stockez la plaque à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête pour l’extraction des protéines.
    REMARQUE : Les tests protéiques nous permettent de normaliser les valeurs selon les conditions de traitement (ils sont l’une des méthodes pour normaliser les données, pas la seule).
  2. Pour une isolation immédiate des protéines, retirez le milieu de test des puits et lavez une fois avec 500 μL de PBS RT (1x) (un lavage doux est conseillé pour minimiser la perturbation de la monocouche cellulaire).
  3. Pour collecter les cellules susceptibles de se détacher pendant ce processus, centrifugez la plaque une fois à 300 × g pendant 5 minutes, jetez le PBS, puis remettez la pelote résultante dans un tampon RIPA afin d’assurer des mesures totales précises des protéines.
  4. Ajoutez environ 75 à 100 μL de tampon RIPA à chacun des puits et placez la plaque sur un vibrateur (rotation basse-moyenne) pendant 30 minutes (RT). Ensuite, transférez le contenu dans un tube microcentrifuge neuf de 1,5 mL.
    REMARQUE : Triturez et mélangez bien dans les puits avant de transférer le tampon RIPA dans le tube microcentrifuge de 1,5 ml.
  5. Incubez le tube de microcentrifuge sur un rotateur pendant environ 30 minutes en RT pour une lyse correcte des cellules. Pendant ce temps, il faut pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C.
  6. Centrifugez le lysat cellulaire à 16 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C. Jetez la pellete car elle contiendra des débris cellulaires.
  7. Collectez le surnageant pour la quantification des protéines en utilisant le test BCA (ou toute autre méthode privilégiée). Procédez immédiatement ou stockez les lysats après avoir retiré tous les milieux de test à -20 °C (pour un stockage à court terme), ou à -80 °C (pour un stockage à long terme).
  8. Lors du redémarrage après avoir stocké les échantillons à -20 °C ou -80 °C, décongelez-les sur glace pendant environ 20 à 30 minutes, faites brièvement un vortex/rotation, puis continuez avec le protocole BCA standard.
  9. Sinon, comptez les cellules par puits à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un cytomètre en flux et intégrez-les aux stratégies de normalisation. Dans ce cas, ajoutez environ 100 à 200 μL de trypsine (pré-chauffée à 37 °C) immédiatement après la fin du test et le retrait du milieu de test, puis incubez à 37 °C pendant 5 minutes. Collectez les cellules en ajoutant 100 à 200 μL de 10 % de FBS pour neutraliser les effets de la trypsine.
    1. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes, retirez le surnageant, puis resuspendez la pellete dans environ 1 mL de 10 % de FBS avant de compter à l’aide d’un hémocytomètre. Alternativement, les cellules peuvent être fixées avec 4 % de PFA pendant 15 minutes avant de procéder au comptage cellulaire basé sur la cytométrie en flux.
      REMARQUE : Si on commence immédiatement à compter les cellules, la fixation basée sur le PFA n’est pas nécessaire.
  10. Normaliser les valeurs d’ECAR avec la concentration de protéines à partir de l’étape 7.8 ou les comptages cellulaires à partir de l’étape 7.9.1 dans chaque puits en utilisant le logiciel Wave comme à l’étape 6.10.5.1. Les valeurs obtenues sont les valeurs normalisées pour le test de résistance à la glycolyse.
  11. Générez les résultats et le graphique en utilisant l’option « Export » suivie de l’option « Graph Pad Prism » et « Excel sheet » pour chaque valeur de point de données à quantifier.
    REMARQUE : Dans la plaque de culture cellulaire, le choix de quatre puits vierges désignés est flexible et peut être réglé par l’expérimentateur. L’arrangement par défaut des blanks est montré à la Figure 3C.

8. Mesures de lactate à partir de surnadants en culture

  1. On dégèle progressivement les aliquotes surnageantes sur la glace qui ont été collectées au jour 12 et stockées à −80 °C à partir de l’étape 6.5.
  2. Déterminez les concentrations de L-lactate à l’aide du kit d’analyse de L-lactate en mode fluorométrique, suivant le protocole du fabricant.
    Note : Le mode fluorométrique est beaucoup plus sensible que le test colorimétrique.
  3. Préparez des étalons par dilution sérielle de l’étalon de lactate fourni afin de générer une courbe d’étalonnage allant de 0 à 0,1 nmol/puits.
  4. Ajoutez des échantillons et des standards à une microplaque transparente de 96 puits en double, puis ajoutez le mélange de réaction contenant le mélange d’enzymes lactate et la sonde fluorescente dans chaque puits.
  5. Incuber en temps récréatif pendant 30 minutes protégé de la lumière. Mesurez l’intensité de fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence avec des longueurs d’onde d’excitation/émission réglées à 535/587 nm.
  6. Calculez les concentrations de lactate dans les échantillons à partir de la courbe standard et exprimez-les en pM. Les niveaux de lactate provenant des surnadants de microglie primaire non traitée (témoin) et traitée par LPS sont présentés dans le tableau 2.

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Résultats

Le test de résistance extracellulaire basé sur le flux de glycolyse mesure avec succès le profil glycolytique des microglies primaires. Le test mesure la glycolyse basale, c’est-à-dire la glycolyse après injection de glucose, la capacité glycolytique après injection d’oligomycine, et l’inhibition de la glycolyse lors de l’injection de 2DG. Pour notre expérience, nous avons comparé la microglie primaire témoin (non traitée) et la microglie primaire traitée par LPS. Nous avons observé de l...

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Discussion

La réponse microgliale lors de la neuroinflammation s’accompagne d’un profond recâblage métabolique qui permet à ces cellules de répondre aux exigences énergétiques et biosynthétiques de leur état fonctionnel. Le test d’effort de glycolyse extracellulaire basé sur le flux offre une méthode sensible et en temps réel pour mesurer le flux glycolytique, nous permettant de disséquer comment la microglie primaire adapte son métabolisme dans des conditions pro-inflammatoires. Dans cette étude, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Le travail est financé par une subvention de projet des IRSC accordée au DKK. Le RTI au Dr Craig Moore pour l’analyseur XFe24 du test hippocampe est très reconnaissable.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution HEPES 1MSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco & nbsp ;  ; 14175-079
2,5 % de trypsineGibco & nbsp ;  ; 15090-046
2DGMillipore sigma & nbsp ;D6134
Antibiotique/Antimycotique & nbsp ;Gibco15240-062
D & ndash ; (+)Glucose, anhydre & nbsp ;Thermoscientifique & nbsp ;   ;A16828.36
DMEMGibco  ; 11965-092
DNase IMillipore sigma & nbsp ;11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco & nbsp ;  ; 35050-061
L-Lactate KitAbcamAB65330
LPS  ;Sigma Aldrich  ; L4391
MEM, NEAA&NBSP ;Gibco & nbsp ;  ; 11140-050
Oligomycine AMillipore sigma & nbsp ;495455
Pénicilline/StreptomycineGibco & nbsp ;  ; 15240-062
Bandes indicatrices de pHFisherbrand13-640-516
Hippocampe XFe24Agilent TechnologiesN/ANom générique : Analyseur de flux extracellulaire
Microplaques de culture cellulaire Seahorse 24 V7 PSHippocampe Agilent100777-004Nom générique : Microplaques de culture cellulaire à flux extracellulaire
Essai sur hippocampe XF Tampon calibrant (pH 7,4)Hippocampe Agilent & nbsp ;  ; 100840-000Nom générique : Tampon calibrant de flux extracellulaire
Média DMEM XF du test hippocampe (pH 7,4)Hippocampe Agilent & nbsp ;   ;  ; 103575-100Nom générique : Média extracellulaire de test de flux
Kit de test de flux extracellulaire hippocampeHippocampe Agilent & nbsp ;102342-100Nom générique : Plaque de calibration de flux extracellulaire   ;
Pyruvate de sodium   ;Gibco & nbsp ;  ; 11360-070

Références

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