Induction de ferroptose dans le gliome par calcéolarioside A via modulation de la voie PI3K/Akt/Nrf2

Résumé

Cette étude explore le potentiel thérapeutique du calcéolarioside A dans le gliome, démontrant sa capacité à inhiber la signalisation PI3K/Akt et à favoriser la dégradation de Nrf2, induisant ainsi la ferroptose et supprimant la progression tumorale tant in vitro quin in vivo.

Résumé

Ce protocole démontre le flux de travail expérimental utilisé pour étudier les effets du calcéolarioside A (CaA) sur l’induction et la modulation de la ferroptose de la voie phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/kinase protéique B (Akt)/facteur nucléaire 2-facteur érythroïde 2 (Nrf2) dans les modèles de gliome. Les procédures comprennent une série d’analyses cellulaires sur des lignées de gliome humain U251 et U87 pour évaluer la viabilité, la prolifération et la chimiosensibilité cellulaire après un traitement par CaA. Les changements associés à la ferroptose sont évalués en mesurant les espèces réactives de l’oxygène (ROS), le glutathion (GSH), le malondiadéhyde (MDA) et les niveaux de fer labile, ainsi que l’expression de protéines liées à la ferroptose telles que la peroxydase glutathion 4 (GPX4), la sous-unité antiporteur cystéine/glutamate (xCT) et la ferritine via Western blot. Pour évaluer l’implication des voies, le protocole détaille les tests basés sur qRT-PCR, western blot et immunoprécipitation pour l’expression et l’ubiquitination de Nrf2. Des expériences de surexpression de Nrf2 sont incluses pour confirmer son rôle dans la régulation de la ferroptose. Le protocole démontre également l’utilisation d’un modèle de xénogreffe murine, où les cellules U87 sont implantées sous la cutâne, suivies d’une administration intrapéritonéale de CaA pour évaluer la croissance et la toxicité tumorales in vivo. Une analyse histologique des principaux organes est réalisée pour évaluer la sécurité systémique. De plus, le docking moléculaire est utilisé pour prédire la liaison directe entre CaA et la sous-unité PI3K p110α (PIK3CA). Ensemble, ces procédures fournissent un cadre reproductible pour examiner les mécanismes de la ferroptose et l’efficacité thérapeutique des composés naturels dans la recherche sur le gliome.

Introduction

Les gliomes, en particulier les glioblastomes de haut grade, représentent l’une des formes les plus mortelles de tumeurs cérébrales, caractérisées par une prolifération rapide, une résistance au traitement et un pronostic^{médiocre 1}. Ces dernières années, divers agents anti-gliomes ont été explorés, notamment des chimiothérapeutiques traditionnels comme le témozolomide et une gamme de composés naturels tels que la^{curcumine 2}, le resvératrol³ et l’épigallocatéchine^{gallate 4}. Ces agents exercent leurs effets par de multiples mécanismes, notamment l’induction de l’apoptose, l’inhibition de l’angiogenèse et la modulation des voies de stress oxydatif. Cependant, beaucoup de ces composés rencontrent des limites telles que une biodisponibilité faible ou une caractérisation mécaniste incomplète. Cela souligne le besoin crucial de méthodologies complètes qui non seulement confirment l’activité antitumorale, mais dissèquent aussi systématiquement les mécanismes pharmacologiques sous-jacents. Établir de tels flux de travail mécanistes est particulièrement important pour accélérer le développement de nouveaux composés anti-gliomes, de la découverte à la validation préclinique.

Pour soutenir cet objectif, un nombre croissant d’études intègrent désormais des outils computationnels et expérimentaux avancés pour améliorer la résolution^{mécanistique 5,6}. La conception de médicaments basée sur la structure et les modèles d’intelligence artificielle (IA) — tels qu’AlphaFold3 et le docking moléculaire — facilitent l’identification d’interactions prometteuses médicament-cible avec une rapidité et une précision sans précédent ^7,8. Ces outils complètent les méthodes expérimentales en prédisant les affinités de liaison et en identifiant des cibles moléculaires potentielles avant validation en laboratoire. Parallèlement, l’émergence des tests fonctionnels basés sur des voies, de l’imagerie cellulaire vivante et des techniques protéomiques à haute résolution permet aux chercheurs d’évaluer l’impact cellulaire de nouveaux composés sur de multiples axes régulateurs, notamment les réponses au stress oxydatif, les cascades de transduction du signal et les modalités de mort cellulaire telles que la ferroptose ^9,10,11.

Parmi les voies de signalisation impliquées dans la biologie du gliome, les voies phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protéine kinase B (Akt) et le facteur 2 lycée du facteur érythroïde nucléaire 2 (Nrf2) sont particulièrement intéressantes en raison de leur rôle dans la croissance tumorale, l’homéostasie redox et la résistance aux^{traitements 12,13}. La signalisation PI3K/Akt favorise la survie, la prolifération et l’adaptation métabolique dans les cellules gliomatiques, tandis que Nrf2 agit comme un régulateur maître de la réponse antioxydante, supprimant la mort cellulaire^{ferroptotique 14}. L’activation persistante de ces voies contribue à l’évasion du traitement, en faisant des cibles attractives pour l’intervention^{pharmacologique 15}. Les méthodes conventionnelles d’examen des voies incluent le western blotting pour les protéines totales et phosphorylées, ainsi que la qRT-PCR pour l’analyse de l’expression génique. Cependant, une analyse approfondie de la signalisation Nrf2 nécessite des tests supplémentaires évaluant la stabilité des protéines, la translocation nucléaire et les modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination. Ces stratégies de détection multifacette sont essentielles pour comprendre comment certains composés perturbent ou renforcent la régulation redox et le contrôle ferroptotique.

La calcéolarioside A (CaA), un dérivé de l’acide hydroxycinnamique, offre un double mécanisme en inhibant simultanément la signalisation PI3K/Akt et en favorisant la dégradation protéosomale de Nrf2, augmentant ainsi la sensibilité ferroptotique. Cette stratégie à double ciblage pourrait améliorer la reproductibilité et la profondeur mécanistique par rapport aux agents existants comme l’érastine ou le RSL3, qui agissent en aval des défenses antioxydantes. Ce protocole présente une approche expérimentale intégrée pour étudier le mécanisme pharmacologique de CaA, incluant un amarrage moléculaire pour identifier les sites de liaison de PI3K, l’immunoblotting et l’immunoprécipitation pour détecter l’expression et l’ubiquitination de Nrf2, ainsi que des marqueurs de ferroptose tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS), le glutathion (GSH) et le malondiadéhyde (MDA). De plus, un modèle de souris xénogreffe est utilisé pour évaluer l’efficacité thérapeutique et la sécurité systémique du CaA. Ce flux de travail complet offre une plateforme reproductible et informative pour étudier le mécanisme d’action des agents anticancéreux, en mettant l’accent sur l’intégration de la modulation des voies du signal et de la régulation de la mort cellulaire.

Protocole

Culture cellulaire et traitement
Des cellules neuronales murines HT22 ainsi que des lignées cellulaires humaines de gliome U87 et U251 ont été cultivées dans le milieu Modified Eagle de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin et 4 mM de L-glutamine, dans des conditions humidifiées à 37 °C avec 5 % de CO₂. Pour rationaliser la cohérence expérimentale, tous les traitements cellulaires ont été standardisés et décrits ici. Cette section décrit les conditions spécifiques utilisées dans chaque groupe de traitement ainsi que les tests en aval correspondants.

Traitement CaA :
Les cellules HT22 ont été traitées avec des concentrations croissantes de CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 et 500 μM) pendant 72 heures. Les cellules de gliome U87 et U251 ont été traitées avec CaA à des concentrations de 5, 20 ou 50 μM pendant 24 heures pour la plupart des expériences, ou à 50 μM pendant 0, 6, 12 ou 18 heures pour les études temporelles. Ces traitements ont été utilisés dans les analyses suivantes : western blotting pour la sous-unité antiporteur de cystéine/glutamate (xCT), peroxydase de glutathion 4 (GPX4), ferritine (FTH1), glutaminase, et PI3K/Akt/cible mammifère de la rapamycine (mTOR)/ facteur d’initiation eucaryote 4B (EIF4B) (niveaux totaux et phosphorylés) ; réaction en chaîne quantitative en temps réel (RT-qPCR) pour Nrf2 et la protéine associée ECH de type Kelch 1 (Keap1) ; Mesure ROS utilisant le diyacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA) ; la quantification GSH et MDA ; détection Fe²⁺ à base de FerroOrange ; test de prolifération de 5-ethynyl-2′-désoxyuridine (EdU) ; Analyse de formation de colonie ; Essai de viabilité cellulaire du bromure de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT).

Co-traitement avec la liprostatine-1 (Lip1) :
Les cellules ont été prétraitées avec 50 nM Lip1 pendant 2 heures avant l’ajout de 50 μM CaA. Ces conditions ont été utilisées lors du test MTT (0, 24, 48, 72 h) ; test de formation de colonie ; Analyse EdU ; Essai d’apoptose Annexin V/PI (avec/sans cisplatine de 20 nM).

Cotraitement MG132 :
Les cellules ont été traitées avec 10 μM MG132 seule ou combinées avec 50 μM CaA pendant 24 heures. Cela a été appliqué au western blotting pour la stabilisation des protéines Nrf2 (totale et nucléaire) ; Tests d’immunoprécipitation (IP) pour le Nrf2 et le Keap1 ubiquitinés.

Co-traitement au cisplatine :
Les cellules ont été traitées avec 20 nM de cisplatine seule ou en combinaison avec 20 μM CaA pendant 24 heures. Ces traitements ont été utilisés dans le test d’apoptose par l’annexe V/iodure de propidium (PI).

Surexpression de Nrf2 :
Les cellules ont été transfectées avec un plasmide de surexpression de Nrf2 de 2,5 μg ou un vecteur vide à l’aide d’agent transfecteur pendant 18 heures, puis traitées avec 50 μM CaA pendant 24 heures. Cette condition était utilisée dans le blot occidental pour xCT, GPX4, FTH1 et glutaminase ; Analyses ROS, MDA, GSH ; Coloration FerroOrange pour le fer intracellulaire.

Un diagramme de flux de travail (Figure supplémentaire S1) résume les conditions expérimentales ci-dessus ainsi que les analyses correspondantes. Cette figure relie visuellement chaque protocole de traitement à ses tests spécifiques en aval pour une meilleure clarté et reproductibilité.

Évaluation de la viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide de la méthode colorimétrique conventionnelle MTT comme décrit^{précédemment 16}. Les cellules HT22, U251 et U87 ont été placées en plaques de culture à 96 puits et incubées toute la nuit pour permettre l’adhérence. Après la fin de la période de traitement, 15 μL de solution MTT ont été introduits dans chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 4 heures à 37 °C. Le milieu a ensuite été jeté, et 150 μL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) ont été ajoutés pour solubiliser les cristaux de formazan formés. L’absorption a ensuite été enregistrée à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Des valeurs d’absorbance plus élevées indiquent une plus grande viabilité cellulaire, tandis qu’une réduction de l’absorbance suggère des effets cytotoxiques.

Essai d’incorporation EdU
Pour évaluer la synthèse de l’ADN et la prolifération cellulaire, des tests d’incorporation EdU ont été réalisés à l’aide d’un kit d’imagerie EdU comme décrit^{précédemment 17}. En résumé, les cellules de gliome U251 et U87 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits. Après traitement, les cellules ont été incubées avec de l’EdU (concentration finale de 10 μM) et cultivées pendant 24 heures supplémentaires. Après l’étape d’incubation, les cellules ont été fixées à l’aide de paraformodéhyde à 4 %, puis perméabilisées avec 0,5 % de Triton X-100, et colorées selon les instructions du kit. Le pourcentage de cellules EdU-positives (cellules proliférantes) a été quantifié par microscopie à fluorescence et normalisé au total des noyaux colorés en 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).

Essai de formation de la colonie
Pour l’analyse de formation de colonie, les cellules de gliome U251 et U87 ont été placées dans des plaques de 3,5 cm à faible densité (500 cellules par antenne). Après le traitement, le milieu de culture a été remplacé par un milieu frais sans médicament, et les cellules ont été maintenues pendant 14 jours supplémentaires pour permettre la formation de colonies, avec des changements de milieu effectués tous les trois jours. Les colonies résultantes ont ensuite été fixées à l’aide de paraformoldéhyde à 4 %, colorées à 0,1 % de violet cristallin, puis comptées manuellement au microscope. Les grappes dépassant 75 μm de diamètre ont été marquées comme colonies. Chaque expérience a été réalisée en triple exemplaire et répétée trois fois. Ce test suivait les protocoles communément acceptés pour évaluer la capacité proliférative^{à long terme 18}. Les colonies doivent apparaître sous forme de grappes denses et circulaires ; Moins de colonies et plus petites suggèrent une capacité proliférative réduite.

Évaluation de l’apoptose cellulaire
La mort cellulaire apoptotique a été évaluée à l’aide du kit de détection d’apoptose FITC-Annexin V comme décrit^{précédemment 16}. Les cellules de gliome U87 et U251 ont été traitées avec 20 nM de cisplatine en présence ou en absence de 20 μM CaA pendant 24 heures avant la coloration. Pour les expériences impliquant l’inhibition de la ferroptose, les cellules ont été prétraitées avec 50 nM Lip1 pendant 2 heures, suivies d’un co-traitement avec 20 μM CaA et 20 nM de cisplatine pendant 24 heures supplémentaires. Après les traitements indiqués, les cellules ont été prélevées (300 × g, 5 minutes) et colorées avec Annexin V-FITC et PI selon les instructions du fabricant. Après l’étiquetage, les échantillons étaient examinés sur un cytomètre en flux. L’acquisition de données a été effectuée en utilisant les canaux FL1 (FITC) et FL2 (PI), avec des réglages de compensation appliqués pour minimiser le chevauchement spectral. La proportion de cellules V-positives à l’annexe a ensuite été calculée pour déterminer le degré d’apoptose.

Analyse du western blot
Le western blot a été réalisé selon des procédures^{établies 19,20}. En bref, après les traitements indiqués, les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, et les niveaux de protéines ont été déterminés à l’aide du test de Bradford. Pour les expériences évaluant la distribution sous-cellulaire de Nrf2, des protéines nucléaires et cytoplasmiques ont été extraites à l’aide d’un kit d’extraction nucléaire commercial selon les instructions du fabricant.

Un total de 40 μg de protéines provenant de chaque échantillon a été résolu sur un gel SDS-PAGE à 10 %, puis transféré sur les membranes PVDF. Les membranes ont été obstruées avec 5 % de lait écrémé préparé en PBST (PBS avec 0,1 % Tween-20) pendant 1 heure à température ambiante, suivie d’une incubation nocturne avec des anticorps primaires à 4 °C. Après lavage, des anticorps secondaires conjugués à HRP (1:5 000) ont été appliqués pendant 1 heure à 37 °C, et les signaux ont été détectés à l’aide d’un système de chimiluminescence améliorée (ECL).

Les niveaux d’expression de xCT, glutaminase, GPX4 et FTH1 ont été mesurés, en utilisant la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme contrôle de charge. Les protéines phosphorylées (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR et p-EIF4B) ont été quantifiées par rapport à leurs niveaux totaux de protéines respectifs, tandis que les protéines totales ont été normalisées par rapport au GAPDH. Le Nrf2 nucléaire a été normalisé en Lamin B. Les résultats attendus incluent une réduction dépendante de la dose et du temps de Nrf2 et de p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, ainsi qu’une régulation à la baisse des marqueurs liés à la ferroptose dans les cellules traitées à CaA.

Pour les tests d’ubiquitination, les cellules ont été traitées avec MG132 (10 μM) avec ou sans CaA (50 μM) pendant 24 heures. Après la lyse, les complexes protéiques ont été immunoprécipités à l’aide d’anticorps anti-Nrf2 ou anti-Keap1 ; IgG lapin normal a été utilisé comme témoin négatif. Les immunoprécipités ont ensuite été sondés avec des anticorps anti-ubiquitine pour détecter des formes ubiquitinées, tandis que les lysats totaux ont également été sondés pour les niveaux de Nrf2 et de protéines associées ECH-like Kelch 1 (Keap1) afin de confirmer leur entrée.

Extraction d’ARN et PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)
L’extraction d’ARN et la qRT-PCR ont été réalisées selon les protocoles^{standards 21}. En résumé, les cellules gliomes U87 et U251 ont été traitées avec ou sans CaA à 50 μM pour différentes durées (6 et 18 h). L’ARN total a été isolé et converti en ADNc par transcription inverse. La PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) a été réalisée à l’aide d’un Master Mix SYBR Green qPCR sur une plateforme PCR en temps réel. L’expression relative des gènes a été déterminée à l’aide du calcul 2-ΔΔCt. Les séquences d’amorce utilisées pour Nrf2, Keap1 et le gène de maintien de l’eau GAPDH étaient les suivantes :

Nrf2 avant, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′ ;
Nrf2 inverse, 5′-GGAATGTCTGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 avant, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′ ;
Keap1 marche arrière, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH avant, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′ ;
GAPDH inverse, 5′-AGCCTTCTACATGGTGTGTGAAGAC-3′

Transduction Nrf2
Les cellules de gliome U251 et U87 ont été transfectées de manière transitoire soit avec un plasmide de surexpression de Nrf2, soit avec un vecteur témoin vide correspondant à l’aide du réactif de transfection à base de lipides ; La procédure était basée sur des méthodes conventionnelles de transfection^{transitoire 22}. En résumé, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits à une densité de 3 × 10⁵ cellules par puits et cultivées toute la nuit pour atteindre environ 70 à 80 % de confluence au moment de la transfection. Pour chaque puits, 2,5 μg d’ADN plasmidique ont été dilués dans 125 μL de milieu sérique réduit et mélangés à 5 μL du réactif de transfection. Par ailleurs, 3,75 μL du réactif de transfection ont été dilués dans 125 μL supplémentaires du milieu sérique réduit. Les mélanges d’ADN dilué et de réactifs de transfection ont ensuite été combinés, légèrement mélangés et incubés pendant 10 à 15 minutes à température ambiante pour permettre une formation complexe. Les complexes de transfection résultants (volume total 250 μL) ont été ajoutés goutte à goutte à chaque puits contenant des cellules dans un milieu complet frais.

Après 18 heures d’incubation à 37 °C dans un incubateur CO₂, le milieu de transfection a été remplacé par un milieu de culture frais. Les cellules ont ensuite été analysées par la suite, incluant le western blotting, l’analyse ROS, la quantification MDA/GSH et les études d’accumulation de fer. Ce protocole suit des procédures largement acceptées d’expression génique transitoire et permet une expression robuste de Nrf2 dans les 24 à 48 heures suivant la transfection.

Mesure du fer intracellulaire
Les niveaux intracellulaires de Fe²⁺ ont été mesurés à l’aide de l’indicateur fluorescent FerroOrange. Des cellules de gliome U251 et U87 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et traitées avec des concentrations variables de CaA (5, 20 et 50 μM). Pour évaluer l’effet de la surexpression de Nrf2 sur la ferroptose, les cellules U87 et U251 ont été transfectées avec un plasmide d’expression de Nrf2 ou un vecteur vide. Après 18 heures, le milieu a été remplacé et les cellules ont été traitées avec 50 μM de CaA pendant 24 heures. Par la suite, les cellules ont été exposées à 1 μM de FerroOrange dans un milieu sans sérum et incubées à 37 °C pendant 30 minutes avant analyse. Après l’incubation, les cellules ont été rincées et observées au microscope à fluorescence, à l’aide d’un ensemble de filtres TRITC (excitation ~543 nm, émission 560-600 nm), où une intensité accrue de fluorescence orange indique des niveaux plus élevés de Fe²⁺ labile, généralement localisé dans le cytoplasme. Cette méthode a été adaptée à partir d’essais de fer à base de sonde fluorescente^{établis 23}.

Mesure du GSH et du MDA
Les niveaux intracellulaires de GSH et de MDA ont été déterminés selon des protocoles d’évaluation standardisés pour évaluer le stress^{oxydatif 24}. Des cellules de gliome U251 et U87 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et traitées avec des concentrations variables de CaA (5, 20 et 50 μM). Pour évaluer l’effet de la surexpression de Nrf2 sur la ferroptose, les cellules U87 et U251 ont été transfectées avec un plasmide d’expression de Nrf2 ou un vecteur vide. Après 18 heures, le milieu était remplacé et les cellules traitées avec 50 μM CaA pendant 24 heures. Par la suite, les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA, et les concentrations totales de protéines ont été mesurées à l’aide d’un kit de quantification des protéines BCA. Les teneurs en GSH et MDA ont ensuite été analysées à l’aide de kits de détection commerciaux conformément aux protocoles des fabricants.

Essai ROS
La génération intracellulaire de ROS a été évaluée à l’aide de la sonde fluorescente DCFH-DA conformément aux protocoles^{établis 25}. Des cellules de gliome U251 et U87 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits et traitées avec des concentrations variables de CaA (5, 20 et 50 μM). Pour évaluer l’effet de la surexpression de Nrf2 sur la ferroptose, les cellules U87 et U251 ont été transfectées avec un plasmide d’expression de Nrf2 ou un vecteur vide. Après 18 heures, le milieu était remplacé et les cellules traitées avec 50 μM CaA pendant 24 heures. Par la suite, les cellules ont été traitées avec 5 μM DCFH-DA à 37 °C pendant 1 heure, suivies de lavages PBS pour éliminer l’excès de colorant. Les signaux de fluorescence étaient visualisés à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée, équipé d’un filtre FITC (excitation 488 nm, émission 525 nm), et des images étaient capturées pour analyse. L’augmentation de l’intensité de la fluorescence verte correspond à des niveaux élevés de ROS intracellulaire.

Expériences animales
Toutes les expériences animales ont été réalisées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux institutionnels de l’hôpital populaire de Weifang sous le numéro d’approbation [2025SDL579]. Pour générer le modèle de xénogreffe de gliome, 2 × 10 cellules⁶ U87 ont été resuspendues dans 0,2 mL de PBS et inoculées sous-cutanées dans le flanc gauche de souris NUES BALB/c mâles de 4 semaines. Après avoir laissé les tumeurs se développer pendant 7 jours, les souris ont été réparties au hasard en trois groupes (n = 8 par groupe) : témoin non traité, traité par CaA (2,5 mg/kg) et CaA (2,5 mg/kg) combiné à Lip1 (10 mg/kg). Les traitements ont été administrés par injection intrapéritonéale quotidienne pendant 14 jours consécutifs. Les dimensions tumorales étaient mesurées tous les 3 jours à l’aide d’un étrier à coulisseur, et les volumes calculés selon la formule : volume = (longueur × largeur²) / 2. Au 21e jour, toutes les souris ont été euthanasiées, et les tumeurs ont été excisées et photographiées pour une analyse complémentaire.

Séquençage de l’ARN et analyse des voies KEGG
Un séquençage d’ARN a été réalisé pour faire le profil des changements transcriptionnels après exposition au CaA. L’intégrité de l’ARN a été confirmée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-VIS en microvolume et d’un système d’électrophorèse capillaire avant le séquençage sur la plateforme Illumina. Des lectures claires ont été mappées au génome de référence humain (GRCh38) avec HISAT2, et l’expression génique a été quantifiée en FPKM. Des gènes exprimés différemment ont été identifiés à l’aide de DESeq2 (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), et l’enrichissement fonctionnel a été évalué par analyse des voies KEGG (ajusté P < 0,05).

Analyse du carambolage moléculaire
Le docking moléculaire a été utilisé pour prédire l’interaction entre CaA et la voie PI3K/Akt. La structure cristalline de la sous-unité catalytique humaine PI3K p110α (PIK3CA) a été obtenue à partir de la Protein Data Bank (PDB ID : 8BFU). La structure de CaA a été extraite de PubChem et réduite à l’énergie grâce à un logiciel de modélisation moléculaire. À l’aide d’un logiciel de préparation à l’amarrage moléculaire, toutes les molécules d’eau et ligands non essentiels ont été retirés de la structure PIK3CA, et des atomes d’hydrogène ont été ajoutés. Une grille d’amarrage a été définie autour du site actif de PIK3CA (basée sur les coordonnées connues du site de liaison), et un algorithme d’amarrage a été utilisé pour effectuer l’amarrage. Les poses de liaison les plus notables de CaA ont été sélectionnées selon l’affinité de liaison (kcal/mol) et examinées pour les interactions clés. Les interactions protéine-ligand, telles que les liaisons hydrogène et les contacts hydrophobes, ont été visualisées à l’aide d’un logiciel de visualisation moléculaire et d’un outil de cartographie des interactions 2D.

Sécurité et élimination des déchets
Toutes les expériences impliquant des réactifs chimiques tels que le DMSO, les colorants fluorescents (DCFH-DA, FerroOrange) et les fixateurs ont été menées dans une hotte à fumée avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, incluant des gants et des lunettes de sécurité. Le DMSO et les sondes fluorescentes ont été manipulés avec prudence en raison de leur capacité à pénétrer la peau et de leur potentielle cytotoxicité. Les matériaux contaminés, y compris les pointes de pipette, les plaques de culture et les gants, ont été jetés dans des conteneurs désignés pour déchets dangereux. Les tissus et carcasses animaux étaient traités comme déchets bio-dangereux et étaient incinérés ou autoclavés conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité et aux directives environnementales locales.

Analyse statistique
Tous les résultats sont présentés sous forme de la moyenne ± de l’écart-type (DE). Les différences entre deux groupes ont été évaluées à l’aide d’un test t d’Étudiant à deux queues. Pour les analyses impliquant plusieurs groupes, une ANOVA unidirectionnelle suivie de comparaisons post-hoc appropriées (comme le test de Tukey) a été appliquée. Une valeur p inférieure à 0,05 était considérée comme indicative de la signification statistique.

Résultats

Suppression de la prolifération et chimiosensibilité accrue des cellules U251 et U87 in vitro par CaA
La figure 1A illustre la structure de CaA. Nous avons d’abord évalué les effets cytotoxiques du CaA à l’aide d’un test MTT sur des cellules neuronales HT22 murines normales et sur les cellules de gliome humain U251 et U87. Comparé aux cellules non traitées (0 μM de CaA), le CaA a eu un impact minimal sur la viabilité des cellule...

Discussion

CaA présente un effet antitumoral puissant dans le glioblastome en modulant de manière unique deux axes critiques de survie : la voie PI3K/Akt/mTOR et le mécanisme de défense Nrf2-ferroptose. La voie PI3K/Akt est fréquemment hyperactivée dans le glioblastome multiforme (GBM, modifié dans ~88-90 % des cas) en raison de la perte de PTEN ou de l’activation du RTK, ce qui entraîne la prolifération et la résistance au^{traitement 26}. Pourtant, cibler uniquement cette voi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agilent 2100 Bioanalyzer			système d'électrophorèse capillaire
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			logiciel de préparation de l'amarrage moléculaire (algorithme d'amarrage)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			logiciel de modélisation moléculaire
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	Instrument pour analyser les cellules colorées à l'Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	Instrument pour observer la fluorescence de FerroOrange et DCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	réactif de transfection à base de polymère
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			outil de cartographie d'interaction 2D
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		réactif de transfection à base de lipides
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	Instrument pour mesurer l'absorbance dans l'essai MTT (à 490 nm)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			spectrophotomètre UV-Vis pour microvolume
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			logiciel de visualisation moléculaire
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513