Cartographie génomique des modifications des histones et des sites de liaison des facteurs de transcription dans les lignées cellulaires neuroendocrines de petits cancers du poumon grâce à CUT&RUN

Résumé

Un protocole optimisé de clivage sous cibles et de libération utilisant la nucléase suivi du séquençage de nouvelle génération (CUT&RUN-seq) est décrit pour les lignées cellulaires neuroendocrines de petits cancers du poumon. Il permet une cartographie génomique de diverses modifications des histones et des sites de liaison du facteur de transcription (par exemple E2F7) afin d’étudier la dérégulation épigénétique et transcriptionnelle en pathobiologie des SCLC.

Résumé

Les protéines de remodelage de la chromatine et les facteurs de transcription (TF) jouent un rôle crucial dans la biologie tumorale du cancer du poumon à petites cellules (SCLC). La caractérisation à l’échelle du génome des modifications post-traductionnelles des histones (PTM) et des sites de liaison des TF est essentielle pour identifier les éléments régulateurs de l’ADN et les voies géniques qui conduiront à une compréhension mécaniste plus approfondie de la SCLC et nommeront des cibles pour une intervention thérapeutique. Le clivage sous cibles et la libération utilisant la nucléase suivie du séquençage de nouvelle génération (CUT&RUN-SEQ) est une méthode puissante pour cartographier des modifications spécifiques des histones et déterminer les profils de liaison à l’ADN d’un large éventail de protéines in situ dans le génome cellulaire. Dans CUT&RUN, la micronucléase cocoque (MNase) fusionnée à la protéine A/G est recrutée via des anticorps vers les emplacements génomiques des protéines associées à la chromatine, où les fragments d’ADN sous-jacents sont libérés de la chromatine en vrac lors de l’activation et du clivage de la MNase. Cette digestion localisée génère de petits fragments d’ADN spécifiques au locus, adaptés au séquençage.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour profiler les modifications histoniques H3K4me3 (associées aux promoteurs actifs ou ouverts) et H3K4me1 (associées aux amplificateurs actifs), ainsi que le facteur de transcription E2F7, dans le SCLC. Ce protocole a été optimisé pour les modèles de lignées cellulaires SCLC neuroendocrines (NE), généralement caractérisés par de gros noyaux, un cytoplasme rare et une croissance sous forme d’agrégats non adhérents en suspension.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles des histones (PTM) et les facteurs de transcription (TF) sont des régulateurs centraux de l’expression génique. Les PTM des histones, telles que l’acétylation, la méthylation, la phosphorylation et l’ubiquitination, principalement sur leurs queues N-terminales, influencent la structure^{de la chromatine 1,2}. Dans le cancer, les PTM des histones sont souvent déréglées, entraînant une activation aberrante des oncogènes ou un silence des gènes suppresseurs^{tumoraux 3}. Les TF lient des séquences d’ADN spécifiques aux promoteurs ou aux amplificateurs pour activer ou réprimer les gènes cibles, recrutant souvent des enzymes modificatrices des histones qui coordonnent le remodelage^{de la chromatine 4}. Les enzymes qui écrivent, effacent ou lisent les marques d’histones, telles que les acétyltransférases d’histones (HAT), les déacacetylases d’histones (HDAC) et les méthyltransférases (HMT), sont fréquemment mutées ou dérégulées dans le cancer, ce qui en fait des cibles thérapeutiques^{attractives 5}.

Dans le SCLC, les changements épigénétiques et les facteurs de transcription définissant la lignée (LDTF) sont des moteurs clés de la biologie^{tumorale 6}. Contrairement aux mutations génétiques, les altérations épigénétiques, y compris la méthylation de l’ADN et les modifications des histones, régulent l’expression génique sans modifier la séquence d’ADN sous-jacente. Ces modifications peuvent faire taire les gènes suppresseurs tumoraux ou activer les oncogènes, alimentant ainsi le comportement agressif du SCLC. Par exemple, la méthyltransférase d’histone KMT2D est fréquemment mutée avec une fréquence d’altération de 12,9 % dans une grande cohorte réelle de patients^{SCLC 7} et est responsable de la monométhylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me1), une marque associée aux régions d’amélioration active du génome. La LCC est une maladie moléculairement hétérogène. Les SCLC sont classés en sous-types moléculaires basés sur l’expression différentielle de quatre LDTF : homologue de l’achaète-scute 1 (ASCL1), facteur de différenciation neurogène 1 (NEUROD1), protéine associée oui 1 (YAP1) et homéobox de classe 2 POU (POU2F3). Les sous-types neuroendocriniens (NE), y compris ASCL1 et NEUROD1, représentent environ 70 à 80 % des cas de^{SCLC 8}. Par conséquent, l’étude de la distribution et des profils des différents PTM histoniques et des sites de liaison TF dans les différents sous-types de SCLC peut élucider les programmes génétiques spécifiques à chaque sous-type vulnérables à une intervention thérapeutique.

La méthode traditionnelle pour identifier les PTM des histones et les sites de liaison des protéines régulatrices spécifiques à la séquence au niveau génomique est le séquençage par immunoprécipitation par chromatine (ChIP-seq⁾⁹. Cependant, le ChIP-seq nécessite un grand nombre de cellules d’entrée et produit souvent un fond élevé à travers le génome. En conséquence, ChIP-seq nécessite un niveau élevé d’enrichissement de la protéine cible pour distinguer le signal réel du bruit et nécessite un séquençage approfondi pour une analyse efficace des données. De plus, le cross-linking au formaldéhyde utilisé dans ChIP-seq peut masquer les épitopes et générer des sites de liaison^{faussement positifs 10}. Clivage sous cibles et libération à l’aide de nucléase suivie du séquençage de nouvelle génération (CUT&RUN-seq) est une alternative haute résolution pour cartographier les PTM des histones et les sites de liaison TF in situ au sein des cellules intactes. Dans cette méthode, les cellules perméabilisées sont incubées avec un anticorps ciblant la protéine associée à la chromatine d’intérêt, suivies de la liaison d’une protéine de fusion de la protéine A(G)-micrococque nucléase (MNase). Une digestion ciblée de l’ADN flanquant la protéine d’intérêt est ensuite induite dans des conditions riches en calcium et en sel, libérant des fragments spécifiques d’ADN pour purification. Les fragments d’ADN purifiés sont utilisés pour construire des bibliothèques de séquençage codées à barres, qui peuvent être regroupées pour le séquençage à haut débit^{11, 12, 13, 14}. Comparé à ChIP-seq, CUT&RUN nécessite beaucoup moins de cellules en entrée, produit moins de bruit de fond, évite les artefacts de réticulation et nécessite moins de lectures de séquençage – ce qui le rend particulièrement adapté à l’étude des états dynamiques de chromatine chez le cancer de manière rentable.

La technologie CUT&RUN a été développée pour étudier les emplacements génomiques des protéines interagissant avec la chromatine, y compris les modifications des histones, les sites de liaison TF et les complexes associés à la chromatine, révélant ainsi des paysages régulateurs^{épigénétiques 11,12}. Cette technique a permis des analyses détaillées de l’architecture améliorateur-promoteur, de la régulation des réseaux transcriptionnels et de la dynamique de l’état de la chromatine au cours du développement et de la progression de la^{maladie 15}. En recherche sur le cancer, CUT&RUN permet une cartographie précise des marques^{d’histone 16,17} et de l’occupation des facteurs de transcription oncogéniques, aidant à identifier les programmes régulateurs spécifiques à la lignée et les cibles thérapeutiques^{potentielles 15,16}. De plus, le CUT&RUN peut être réalisé in situ dans des cellules, y compris la cellule T^{CD8+ 17}, ainsi que sur des échantillons de^{tissu 18,19}.

Pour détecter la localisation génomique des PTM et des sites de liaison du facteur de transcription E2F7 dans les sous-types SCLC, nous avons appliqué CUT&RUN-seq à quatre modèles de lignées cellulaires SCLC NE : H146 et DMS79 (sous-type ASCL1), ainsi que H446 et H82 (sous-type NEUROD1), avec ou sans mutations KMT2D. Nous avons profilé la marque d’histone H3K4me1, une modification associée à un amplificateur principalement catalysée par KMT2D, et E2F7, qui s’est avéré être un cofacteur d’ASCL1²⁰. La marque d’histone H3K4me3, associée aux promoteurs actifs, servait de contrôle positif, tandis que IgG servait de contrôle négatif.

Ici, nous présentons un protocole détaillé CUT&RUN-seq pour les lignées cellulaires SCLC NE, basé sur les éléments suivants : un kit CUT&RUN commercialement disponible (voir Tableau des matériaux), les travaux originaux de Skene et Henikoff^{11, 12, 13}, ainsi que nos propres optimisations en laboratoire.

Protocole

REMARQUE : Ce protocole (Figure 1) fournit des instructions étape par étape pour effectuer CUT&RUN-seq dans les lignées cellulaires SCLC NE, qui se développent généralement sous forme d’agrégats non adhérents ou de grappes flottantes.

1. Culture cellulaire

1. Maintenir les lignées cellulaires DMS79 (sous-type ASCL1), H146 (sous-type ASCL1), H82 (sous-type NEUROD1) et H446 (sous-type NEUROD1) dans 13 mL de milieux RPMI-1640 complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine ( voir Tableau des matériaux) dans des flasques de 75 mL. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Toutes les cellules utilisées dans cette étude ont été achetées auprès de l’ATCC et ont été authentifiées avec un profilage en tandem court.

2. Perméabilisation cellulaire

REMARQUE : Une perméabilisation cellulaire appropriée est essentielle pour permettre aux anticorps, à la pAG-MNase et aux fragments protéine-ADN digérés de diffuser librement à l’intérieur et à l’extérieur des cellules. Avant de commencer le protocole CUT&RUN sur une nouvelle lignée cellulaire, des optimisations doivent être réalisées afin de déterminer la concentration idéale de digitonine pour une perméabilisation efficace. La concentration la plus basse atteignant plus de 95 % de perméabilisation (95 % des cellules « mortes ») doit être utilisée pour le protocole CUT&RUN.

1. Placez le stock de digétonine à 5 %, l’inhibiteur de protéase et la spermidine sur de la glace et laissez-les complètement décongeler.
2. Préparez le tampon de lavage selon le tableau 1 et maintenez le tampon sur glace.
3. Préparez une solution de travail à 0,05 % de digitonine en mélangeant 10 μL du stock à 5 % avec 990 μL de tampon de lavage. Mélangez soigneusement en vortex et gardez sur glace.
4. Générez une série de dilution de la digitonine (0,05 %, 0,01 %, 0,001 % et 0,0001 %) en diluant séquentiellement la solution précédente à un volume final de 1 mL de chaque tube. Vortex chaque dilution avant de passer à la suivante. En même temps, préparez un contrôle à 0,05 % de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) dans un tampon de lavage (100 μL au total ; voir Tableau 2).
   REMARQUE : La Digonin et le DMSO sont des produits chimiques dangereux. Manipulez avec prudence et jetez tous les déchets dans un contenant correctement étiqueté avec des couvercles sécurisés.
5. Gardez toutes les solutions de dilution de la Digitonine et le contrôle DMSO sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
6. Déterminez le nombre de cellules nécessaires en multipliant le nombre de conditions de perméabilisation par le nombre de cellules requises par test. Inclure 20 % supplémentaires pour compenser la variation de la pipetage (par exemple, pour cinq conditions à 5×10⁵ cellules chacune, préparer environ 1,2 x 5 x 5 x 10⁵ cellules).
7. Collectez le nombre requis de cellules cultivées par centrifugation à 600 × g pendant 3 minutes à température ambiante (RT). Résuspendez le pellet à 600 μL de 1× PBS (100 μL par condition plus 20 % supplémentaire).
8. Aliquote 100 μL des cellules PBS resuspendues en cinq tubes microcentrifuges de 1,5 mL : un tube pour chaque concentration de digitonine et un pour le contrôle DMSO.
9. Centrifugez les tubes à 600 × g pendant 3 minutes en RT.
10. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez chaque pellet à 50 μL du tampon de contrôle correspondant de la digitonine ou du DMSO.
11. Incubez les échantillons à la RT pendant 10 minutes.
12. Mélangez 10 μL des cellules traitées avec 10 μL de bleu de trypan et chargez 10 μL du mélange sur une lame de comptage cellulaire.
13. Utilisez un compteur cellulaire pour quantifier les cellules viables (non colorées) et les cellules positives perméabilisées non viables (colorées en bleu).
14. Identifier la concentration de digitonine la plus faible qui produit la plus forte proportion de cellules positives au bleu trypan. Utilisez cette concentration pour l’expérience CUT&RUN en aval. Confirmez que le DMSO contrôle maintient la viabilité typique d’une culture cellulaire saine normale.

3. SEQ COUPE ET RUN

REMARQUE : Les réactifs de ce protocole sont adaptés à 5 réactions, avec des suppléments ajoutés pour compenser la perte par pipetage. Pour une liste des matériaux et équipements, voir le tableau des matériaux. Au moins deux réplications biologiques indépendantes sont recommandées pour chaque expérience CUT&RUN.

1. Jour 1
   1. PRÉPARATION DU TAMPON DE COUPE ET DE COURSE
      1. Préparez le tampon de lavage en combinant le tampon pré-lavage, 25x inhibiteur de protéase et 1 M de spermidine comme indiqué dans le tableau 3.
      2. Préparez le tampon de perméabilisation cellulaire en ajoutant 5 % de Digitonine au tampon de lavage selon le tableau 3.
      3. Préparez le tampon d’anticorps en ajoutant 0,4 μL d’EDTA à 100 μL de tampon de perméabilisation cellulaire avec la concentration appropriée de digitonine, comme décrit dans le tableau 3. Placez le tampon préparé sur de la glace.
      4. Stockez le tampon de perméabilisation cellulaire restant à 4 °C pour une utilisation au jour 2.
   2. Activation des billes de concanavaline A (ConA)
      1. Resuspendez doucement la suspension des billes ConA pour assurer une distribution uniforme.
      2. Transférez 55 μL de la suspension des billes (11 μL par échantillon) dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      3. Placez le tube sur un support magnétique de 1,5 mL jusqu’à ce que les billes soient complètement séparées, puis faites une pipette pour retirer le surnageant.
      4. Lavez immédiatement les billes deux fois avec 500 μL de tampon d’activation des billes glacé (100 μL par échantillon). Resuspendez les billes en pipotant doucement à chaque lavage et utilisez le support magnétique pour éliminer le surnageant entre les lavages.
      5. Après le lavage final, retirez le surnageant et resuspendez doucement les billes activées dans 55 μL (11 μL par échantillon) de tampon d’activation des billes glacées.
      6. Une suspension de 10 μL des billes dans chaque tube d’un ensemble de tubes à 8 bandes et maintient les tubes sur la glace.
   3. Récolter les cellules et lier les cellules aux billes activées
      REMARQUE : La viabilité cellulaire est importante pour le rapport signal/fond. Cependant, la viabilité des lignées cellulaires NE de SCLC peut varier (70 %-90 %) en raison d’un taux intrinsèquement élevé de renouvellement cellulaire et de sa préférence pour la croissance en agrégats moyens-gros en suspension.
      1. Retirez les cellules de l’incubateur à 37 °C et examinez-les au microscope pour en assurer la qualité.
      2. Transférez la suspension de la cellule dans un tube conique de 50 mL et centrifugez à 1 000-1 200 × g pendant 5 minutes à la phase de repos.
      3. Aspirez le milieu depuis le tube conique et rincez la pellete cellulaire avec 20 mL de 1× PBS.
      4. Centrifugez à nouveau, aspirez le PBS, puis digérez le pellet avec de l’Accutase pendant 3 à 5 minutes à 37°C, selon la taille du pellet.
      5. Arrêtez la digestion en ajoutant 5 mL de PBS + 10 % de FBS. Obtenez la suspension unicellulaire en pipettant doucement de haut en bas avec une pipette sérologique.
      6. Centrifugez les cellules à 1 000-1 200 × g pendant 5 minutes, jetez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans 5 mL de PBS.
      7. Comptez les cellules de départ, confirmez leur viabilité et intégrité cellulaires.
      8. Calculez le nombre total de cellules nécessaires en multipliant le nombre de réactions par le nombre de cellules par réaction (5×10⁵). Ajoutez 20 % de surplus pour compenser les erreurs de pipetage (par exemple, 1,2 × 6 × 5 × 10⁵ pour 6 réactions). Transférez les suspensions à cellules calculées sur des tubes de 1,5 mL. Centrifugeuse à 600 x g, 3 min en RT.
         REMARQUE : Préparez au moins une réaction supplémentaire en secours.
      9. Resuspendez les cellules dans le tampon RT Wash à une densité de 5×10⁵ cellules par réaction (six réactions au total), en utilisant 100 μL par réaction, en pipettant doucement mais minutieusement pour assurer une suspension uniforme. Centrifugez à 600 x g pendant 3 minutes en RT. Pipette pour enlever le surnageant.
      10. Répétez l’étape de lavage (Étape 9) une fois de plus.
      11. Aliquote 100 μL de cellules lavées à chaque tube du jeu de 8 bandes contenant 10 μL de billes de CoA activées. Pipettez doucement pour mélanger et faites tourner rapidement dans une mini-centrifugeuse pour collecter la bouillie (les perles ne doivent pas se déposer).
      12. Incubez la boue de cellules de billes pendant 10 minutes à la RT pour permettre aux cellules de se lier aux billes.
      13. Placez les tubes sur un support à aimants de 0,2 mL, laissez la boue s’éclaircir, et pipettez pour retirer le surnageant. Économisez 10 μL de surnageant pour confirmer que les cellules sont liées aux billes. Jetez le surnageant restant et passez rapidement à l’étape suivante.
      14. Retirez les tubes de l’aimant. Ajoutez immédiatement 50 μL de tampon anticorps glacé à chaque réaction et pipetez doucement pour resuspendre les billes.
      15. Mélangez 10 μL du surnageant et 10 μL de la suspension cellule/bille (resuspendue dans un tampon anticorps) avec 10 μL de bleu de trypan, puis chargez le mélange sur la lame de contre-cellule.
      16. Analysez avec un compteur cellulaire. Confirmez que le surnageant ne contient presque aucune bille ni cellule, et que le mélange perlage/cellule contient des cellules perméabilisées entourées de billes.
          REMARQUE : Il est important de vérifier la compatibilité de la liaison des billes de CoA de Cells.
   4. Perméabilisation et liaison des anticorps
      REMARQUE : Le succès de CUT&RUN dépend de manière critique de l’affinité de l’anticorps pour sa cible et de sa spécificité dans des conditions expérimentales spécifiques. Nous recommandons ce qui suit : 1. Utiliser des anticorps commerciaux validés pour CUT&RUN lorsque disponibles. 2. Pour les cibles sans anticorps validés par CUT&RUN, considérons celles validées pour l’immunofluorescence (FI), car les anticorps IF reconnaissent les épitopes dans leur contexte cellulaire naturel, similaire à la liaison in situ de l’anticorps à la cible dans les cellules perméabilisées dans CUT&RUN. 3. Tester 3 à 5 anticorps en parallèle pour identifier le plus efficace pour votre application spécifique.
      1. Faites tourner rapidement le panneau K-MetStat et pipetez pour le resuspendre. Ajoutez 2 μL de K-MetStat Panel aux réactions désignées pour les anticorps témoins H3K4me3 positifs et IgG négatifs. Pipette pour mélanger et tubes à rotation rapide (optionnel).
      2. Ajouter 0,5 μg chacun d’anticorps H3K4me3, H3K4me1 et IgG, et 0,6 μg d’anticorps polyclonaux E2F7 provenant de différentes sources à chaque réaction (Tableau 4). Étiquetez les tubes à 8 bandes.
      3. Pipettez doucement pour bien mélanger chaque tube de réaction. Incubez toute la nuit à 4 °C sur un nutator avec les bouchons des tubes surélevés. Ne pas faire tourner et inverser les ^tubes.
2. Jour 2
   1. Fixation de la pAG-MNase à l’anticorps
      REMARQUE : Les perles qui se déposent pendant la nuit est normal et n’affecte pas les résultats. Si les billes deviennent grumeleuses ou collantes après une incubation nocturne, resuspendez-les en les pipotant doucement. Pour améliorer la cohérence et le débit, le pipetage multicanal est recommandé. Lorsque vous utilisez des tubes à 8 bandes, retirez et remplacez les tampons une bande à la fois pour éviter que les billes de ConA ne sèchent.
      1. Mettez le support magnétique sur la glace.
      2. Retirez les tubes à 8 bandes de l’incubation à 4 °C et faites un tour rapide pour collecter le liquide.
      3. Placez les tubes sur le support à aimants jusqu’à ce que la boue se dissipe. Pipette doucement et retire le surnageant.
      4. Gardez les tubes sur le support magnétique. Laver les tubes deux fois avec 200 μL de tampon de perméabilisation cellulaire froide. Pipette pour enlever le surnageant.
      5. Retirez les tubes du support magnétique et ajoutez immédiatement 50 μL de tampon de perméabilisation cellulaire froide à chaque réaction. Pipotage délicat pour resuspendre les cellules/billes.
      6. Ajoutez 2,5 μL de pAG-MNase à chaque réaction et mélangez bien en pipettant doucement.
      7. Incubez les réactions pendant 10 minutes en temps de réanimation.
      8. Faites tourner rapidement les tubes, reposez-les sur le support à aimants, jusqu’à ce que la suspension se dissipe. Pipette pour enlever le surnageant.
      9. En gardant les tubes sur un support magnétique, laver les tubes deux fois avec 200 μL de tampon de perméabilisation cellulaire froide. Pipette pour enlever le surnageant.
      10. Retirez les tubes du support magnétique, resuspendez-les doucement dans 50 μL de tampon de perméabilisation cellulaire froide. Posez les tubes sur la glace.
   2. Digestion ciblée et libération de la chromatine
      REMARQUE : Effectuer une digestion dépendante de Ca²⁺ à 0 °C afin de minimiser la clivage non intentionnelle de la MNase de l’ADN¹² accessible. Inclure l’ADN spike-in, tel qu’Escherichia coli (E. coli), de sorte qu’il représente environ 0,5 à 5 % (idéalement ~1 %) du séquençage total¹³. L’ADN spike-in est utilisé pour normaliser la profondeur de séquençage et est particulièrement important lors de la comparaison d’échantillons sur une série, par exemple lors de l’évaluation des changements globaux de modification des histones après inhibition ou délétion génétique des enzymes modificatrices des histones.
      1. Ajouter 1 μL de 100 mM de chlorure de calcium à chaque réaction dans la bande de 8 tubes (de l’étape 3.2.1.10) pendant la glace. Pipetez doucement pour resuspendre complètement les billes et assurer une digestion efficace.
      2. Incubez les tubes sur un nutator à 4 °C pendant 2 heures, avec les extrémités bouchonnées surélevées.
      3. Dans un nouveau tube de 1,5 mL, préparez le mélange Stop Buffer. Pour chaque réaction, combinez 33 μL de tampon d’arrêt avec 1 μL d’ADN spike-in d’E. coli (0,5 ng). En douceur pour mélanger en vortex.
      4. Ajoutez 33 μL de tampon d’arrêt à chaque réaction à la fin de l’incubation de 2 heures. Mélangez en pipettant doucement.
      5. Incubez les réactions dans un thermocycleur à 37 °C pendant 10 minutes.
      6. Faites tourner rapidement des tubes pour recueillir le contenu au fond, puis placez-les sur un support à aimants jusqu’à ce que la solution devienne claire.
      7. Transférez soigneusement environ 84 μL de surnageant contenant l’ADN libéré par CUT&RUN dans des tubes frais de 1,5 mL.
   3. Purification de l’ADN à l’aide du kit de purification de l’ADN (voir Tableau des matériaux)
      REMARQUE : Avant la première utilisation, ajoutez 6,9 mL d’isopropanol au tampon de liaison à l’ADN et ajoutez 20 mL ≥ 95 % d’éthanol au tampon de lavage ADN.
      1. Ajoutez 420 μL de tampon de liaison à l’ADN à chaque surnageant collecté. Vortex brièvement pour mélanger en profondeur.
      2. Placez une colonne de nettoyage de l’ADN dans ses tubes de collecte.
      3. Chargez chaque échantillon sur la colonne correspondante.
      4. Centrifugeuse à 16 000 × g pendant 30 s à RT. Écartez le flux et ramenez la colonne dans le tube de collecte.
      5. Ajoutez 200 μL de tampon de lavage d’ADN à chaque colonne et centrifugez à 16 000 x g pendant 30 s à RT. Éliminez le flux et replacez la colonne dans le tube de collecte.
      6. Répétez l’étape de lavage une fois.
      7. Centrifugez à nouveau à 16 000 x g pendant 30 secondes en RT pour éliminer complètement le tampon résiduel de lavage.
      8. Transférez les colonnes vers des tubes étiquetés de 1,5 mL.
      9. Appliquez 12 μL de tampon d’élution directement sur la membrane au centre de la colonne.
      10. Incubez pendant 5 minutes en RT puis centrifugez à 16 000 × g pendant 1 minute en RT pour éluer l’ADN.
          REMARQUE : C’est un point d’arrêt sûr. Stockez l’ADN élué à -20 °C pour un traitement futur.
   4. Quantification ADN CUT&RUN et analyse de la taille des fragments
      REMARQUE : Quantifiez l’ADN à l’aide d’un fluoromètre avec le kit dsDNA High Sensitivity Assay Kit, qui fournit des mesures plus précises de l’ADN double brin que les méthodes basées sur l’absorbance.
      1. Utilisez 1 μL de chaque échantillon pour déterminer la concentration d’ADN CUT & RUN à l’aide du kit dsDNA High Sensitivity Assay (voir Tableau des matériaux).
      2. Utilisez 1 μL supplémentaire d’ADN pour évaluer la présence et la répartition de la taille des fragments découpés. Effectuer l’analyse des fragments à l’aide du kit d’ADN à haute sensibilité (voir Tableau des matériaux) en suivant les directives du fabricant (optionnel).
         REMARQUE : Des protéines de liaison très abondantes, telles que les modifications post-traductionnelles des histones (PTM), peuvent être facilement détectées à cette étape. Cependant, les facteurs de transcription à faible abondance peuvent être plus difficiles à détecter.
   5. Construction de bibliothèque, analyse des fragments et séquençage
      REMARQUE : ≤5 ng d’ADN total CUT&RUN, déterminé par la quantification du kit dsDNA High Sensitivity Assay Kit, a été utilisé pour la construction des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération (NGS) CUT&RUN. Pour minimiser les dimers adaptateurs, réduisez l’adaptateur d’Illumina à 1 μL pour la ligation de l’adaptateur. Le nombre de cycles PCR lors de la construction de la bibliothèque peut être ajusté en fonction de la quantité d’entrée, du rendement de la bibliothèque et du taux de duplication. Différentes stratégies de sélection de taille des billes magnétiques (voir Tableau des matériaux) peuvent être utilisées selon les PTM ou facteurs de transcription de la cible des histones.
      1. La construction de la bibliothèque a été réalisée en utilisant le kit de préparation de la bibliothèque CUT&RUN (voir Tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant du kit, avec de petites modifications. En résumé, 5 ng d’ADN CUT&RUN étaient utilisés comme entrée recommandée pour la préparation de la bibliothèque. Pour l’ADN inférieur à 5 ng, utilisez-en autant que possible pour la préparation à la bibliothèque. Des amorces doubles d’index i5 et i7 étaient utilisées pour chaque échantillon afin d’assurer un séquençage multiplexé réussi.
         REMARQUE : C’est un point d’arrêt sûr. L’ADN peut être stocké à -20°C pour un traitement ultérieur.
      2. Mesurez la concentration de la bibliothèque CUT&RUN avec un fluoromètre et le kit de test de haute sensibilité dsDNA. La répartition de taille des bibliothèques CUT&RUN NGS a été déterminée à l’aide du kit d’ADN à haute sensibilité (voir Tableau des matériaux) basé sur le Guide du kit d’ADN à haute sensibilité ou à un instrument d’électrophorèse capillaire comparable, TapeStation (voir Tableau des matériaux).
         REMARQUE : Diluez la bibliothèque CUT&RUN afin de rentrer la concentration dans la plage de détection du kit dsDNA à haute sensibilité et du kit à haute sensibilité ADN.
      3. Pools de bibliothèques (40-46) basées sur des index moléculaires et uniques égaux. Après la purification de l’ADN, la sélection de la taille des billes magnétiques, le séquençage à extrémités jumelées (longueur de lecture de 100 pb) pour les bibliothèques poolées a été effectué sur un système Illumina NovaSeq 6000 pour un demi-S-Prime (SP) à une profondeur de lecture estimée à 10 millions de lectures par bibliothèque.
   6. Analyse des données CUT&RUN
      1. Analysez les données CUT&RUN à l’aide d’un pipeline personnalisé (Figure 5A). Évaluez la qualité de lecture avec FastQC. Retirez les séquences d’adaptateurs dès le début des lectures avec Cutadapt. Alignez les lectures à extrémité paire avec le génome humain (hg38) et le génome de référence E. coli avec Bowtie2. Utilisez Samtools pour supprimer les lectures non cartographiées. Supprimez les lectures en double avec Picard et générez des fichiers bedGraph avec Bedtools. Créez des fichiers bigWig (en noir et blanc) avec DeepTools. Visualisez les données à l’aide d’IGV et DeepTools. Normaliser le nombre total de lectures en nombre de lectures d’E. coli en spik-in. Effectuer l’appel de pointe en utilisant SEACR (Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN⁾¹⁹.

Résultats

Les lignées cellulaires NE typiques ou « classiques » du SCLC se caractérisent par de gros noyaux, un cytoplasme mince et une croissance sous forme d’agrégats non adhérents ou de sphéroïdes compacts en suspension. Les lignées cellulaires à haute teneur en ASCL1, telles que NCI-H146 et DMS79, et les lignées à haute altitude NEUROD1, telles que NCI-H82 et H446, présentent ce phénotype classique des SCLC : des cellules de petite à moyenne taille avec peu de cytoplasme, une chromatine fineme...

Discussion

La dysrégulation épigénétique et les LDTF sont des facteurs clés de la biologie tumorale^{des SCLC 6}. La détermination de la distribution génomique de modifications spécifiques des histones et des protéines de liaison à l’ADN dans les SCLC peut révéler des mécanismes potentiels de résistance thérapeutique acquise et de plasticité phénotypique. CUT&RUN-seq est une méthode puissante pour cartographier les interactions protéine-ADN entre les histones et les non-histone...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif
RPMI-1640 média  ;	Gibco ThermoFisher Scientific	11875093	Milieu de culture cellulaire
Sérum fœtal bovin (FBS)	Névromiques	FBS002-HI	Composant du milieu de culture cellulaire
1 % de pénicilline-sstreptomycine   ;	Gibco ThermoFisher Scientific	15140122	Antibiotiques, pour prévenir la contamination bactérienne des cultures cellulaires
Solution Trypan Blue, 0,4 %	Gibco ThermoFisher Scientific	15250061	La coloration bleue de Trypan a été utilisée pour évaluer la perméabilité avec un compteur cellulaire automatisé.
Roche cOmplete, cocktail inhibiteur de Proease sans EDTA	Roche	11873580001	Inhibiteur de protéase. Composants du tampon de lavage
5 % Digitonin  ;	EpiCypher	21-1004	Composants tampons   ; et la recette tampon se trouve dans la feuille tampon
Tampon d’activation des billes	EpiCypher	21-1001	Composants tampons   ; et la recette tampon se trouve dans la feuille tampon
Perles de concanavaline A (ConA)	EpiCypher	21-1401	Les microspheres paramagnétiques conjuguées à ConA sont des billes magnétiques recouvertes de lectines qui permettent la liaison des membranes lipidiques
CUT & RUN Kit  ;	CUTANA ChIC EpiCypher	14-1048	Réactifs pour CUT & Génération d’ADN RUN
Kit de purification de l’ADN	CUTANA  ; EpiCypher	14-0050	Extraire l’ADN des fragments d’ADN ciblés libérés dans le supernantant de la réaction
CUT & Kit de préparation à la bibliothèque RUN	CUTANA EpiCypher	14-001	Générez le CUT & EXÉCUTEZ les bibliothèques de séquençage de nouvelle génération (NGS)
; Purification de l’ADN Billes magnétiques	Agencourt AMPure XP Beckman Coulter	A63880	Nettoyage PCR du produit et sélection de la taille (c’est-à-dire retirage du dimer et amorce de l’adaptateur)
ADN spike-in d’E. coli	EpiCypher	18-1401	Utilisé comme un spike-in exogène pour calibrer les lectures de séquençage sur une série d’échantillons &mdash ; par exemple, conditions traitées versus non traitées
pAG-MNase	EpiCypher	; 15-1016	En se liant à l’anticorps primaire, l’enzyme coupe le fragment d’ADN ciblé de chaque côté de la protéine liée lorsqu’elle est activée par le calcium
PBS PH7.4 1x	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010-049	Cellules de lavage
Tampon pré-lavage	EpiCypher	21-1002	Composants tampons   ; et la recette tampon se trouve dans la feuille tampon
dsDNA Haute Sensibilité   ; Kit d’analyse	QubitTM Thermo Fisher Scientific	Q32854	CUT & Quantification de l’ADN RUN
Tampon d’arrêt	EpiCypher	21-1003	Composants tampons   ; et la recette tampon se trouve dans la feuille tampon
Kit d’ADN à haute sensibilité   ;	Technolies Agilent	5067-4626	CUT & Analyse de la quantification des bibliothèques ADN et NGS de RUN et de la distribution de la taille des fragments
< fort>Matériel
Tubes PCR 8 bandes de 0,2 mL	EpiCypher	10-0009k	Tubes pour CUT & Réactions RUN, compatibles avec les tubes de 0,2 ml Magnetic Separation Rack
Lames LUNA à 8 canaux	Logos BioSystems INC	L72001	Diapositives pour le comptage des cellules,   ; Vérification de la viabilité et de l’intégrité des cellules
Réservoir de réactif multicanal	Fisher Scientific	14-387-072	Récipient tampon de lavage
DynaMagTM-2 (Rack de séparation magnétique), tubes de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	12321D	Les billes de ConA étaient isolées de leur tampon de stockage par une crémaillère de séparation magnétique, puis activées par resuspension dans un tampon d’activation dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
Rack de séparation magnétique, tubes de 0,2 mL	EpiCypher	10-0008	Tenez-vous à séparer  ; billes de cellules liantes, anticorps, pAG/MNase issues des tampons de réaction et de lavage
Eppendor Research plus la pipette à 8 canaux, 0,5-10 uL  ;	Eppendorf	3125000010	Échantillons des tubes à 8 bandes à aspiration   ; Pour accélérer le flux de travail, un pipettor multi-canal comparable
Pipette Eppendorf Refrence 2 à 8 canaux, 30-300 uL	Eppendorf	4926000050	Étapes d’aspiration et de lavage pour accélérer le flux de travail, pipettor multicanal comparable
Équipement
Mélangeur Vortex-Genie 2 de Scientific Industries, vitesse variable, 120V	Fisher Scientific	50-728-002	Min-centrifuge et spin
Compteur automatique de cellules LUNA FX7	Logos BioSystems INC	L70001	Compteur de cellules
Mélangeur de nutation	VWR	82007-202	Étapes d’incubation des billes (incubation nocturne des anticorps, réaction de digestion de la pAG-MNase).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal Cycler	Eppendorf	6331	CUT & Construction de bibliothèque de nouvelle génération RUN
Fluoromètre Qubit 4	Thermo Fisher Scientific	Q33226	Quantification de l’ADN.
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent Technologies	G2939A	Taille du fragment, analyse de concentration pour CUT & FAIRE TOURNER DE L’ADN ET CUT& RUNEZ LES BIBLIOTHÈQUES, &NBSP ; instrument d’électrophorèse capillaire comparable (par exemple Agilent TapeStation)
Agilent TapeStation	Agilent Technologies	G2992AA	Taille du fragment, analyse de concentration pour CUT & FAIRE TOURNER DE L’ADN ET CUT& Bibliothèques RUN
Système Illumina NovaSeq 6000	; Illumina, San Diego, CA, États-Unis		Séquençage du CUT & Pool RUN, BIBLIOTHÈQUES & NBSP ;