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Article de recherche

Régulation de la voie AKT/Wnt/β-caténine et induction de la cuproptose par la curcumine dans le glioblastome

653 vues

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DOI :

10.3791/69663

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27 janvier 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

Dans cet article

Résumé

La curcumine (CUM) inhibe la progression du glioblastome (GBM) en induisant la cuproptose par suppression de l’axe AKT/Wnt/β-caténine. Ce protocole étudie le mécanisme moléculaire par lequel le CUM empêche la progression maligne dans le GBM et décrit des méthodes pour évaluer comment le CUM induit la cuproptose en modulant cette voie.

Résumé

La curcumine (CUM) peut réguler le comportement malin du glioblastome (GBM). Cette étude examine si le CUM supprime la progression du GBM en induisant la cuproptose via la voie de signalisation AKT/Wnt/β-caténine. Les concentrations optimales de curcumine ont été déterminées à l’aide du test MTT. Les cellules A172 et U251 ont été traitées avec CUM, inhibiteur AKT MK-2206, inhibiteur Wnt LGK974 et Elsm-Cu (Elesclomol +CuCl 2). La prolifération cellulaire, la migration, l’invasion et l’apoptose ont été évaluées à l’aide de coloration par les esters d’amino succinimidyle carboxyfluorescéine, de tests scratch, de Transwell et de cytométrie en flux, respectivement. La fluorescence MitoSOX, l’analyse métabolique de l’hippocampe, l’immunofluorescence, la détection de Cu2+ et le Western blotting ont été utilisés pour évaluer le stress oxydatif mitochondrial et la cuproptose. L’axe AKT/Wnt/β-caténine a été analysé à l’aide d’un kit de reporter TCF/LEF1 et d’un western blot. Un modèle de xénogreffe GBM a été établi, et le CUM a été administré par gavage pendant cinq semaines. Les effets du CUM sur la croissance tumorale, la cuproptose et l’expression des protéines des voies AKT/Wnt/β-caténine ont été évalués. Les cellules ont été traitées avec 10 μM et 20 μM de CUM in vitro. Le traitement CUM a réduit la prolifération, la migration et l’invasion, tout en favorisant le stress oxydatif et la cuproptose. Le CUM a également supprimé l’activité de signalisation Wnt/β-caténine. L’inhibition des voies a augmenté les niveaux d’espèces réactives d’oxygène (3,7 fois) et de Cu2+ (3,1 fois), et a diminué l’expression de l’acétyltransférase de dihydrolipoamide, ce qui a limité le comportement malin. Chez les souris nues, le CUM a significativement réduit la croissance tumorale, favorisé la cuproptose et inhibé l’activation de l’axe AKT/Wnt/β-caténine. Nos résultats indiquent que le CUM supprime la signalisation AKT/Wnt/β-caténine, favorise la cuproptose et interfère avec la progression du GBM.

Introduction

Le gliome est la tumeur maligne intracrânienne primaire la plus répandue dans le système nerveux central (SNC)1. Le gliome de grade 4 désigne généralement un glioblastome (GBM), avec un pronostic2 mauvais. La GBM est une tumeur cérébrale hautement invasive, représentant près de 50 % des cancers du SNC, avec une survie médiane inférieure à 1an 3. Elle est connue pour sa forte malignité et son taux élevéde récidive 4,5. Actuellement, les stratégies de traitement de la GBM reposent principalement sur la chirurgie, complétée par la radiothérapie, la chimiothérapie et d’autres méthodes de traitementglobales 6. Bien que les stratégies thérapeutiques émergentes telles que l’immunothérapie, la biothérapie et la nanomédecine aient obtenu des résultats remarquables dans les étudesprécliniques 7,8, le taux global de survie sur 5 ans reste seulement de 4,3 %. Le schéma de chimiothérapie le plus couramment utilisé est le célèbre régime Stupp ; cependant, chez les patients atteints de GBM avec MGM non méthylée, le taux de survie global n’est pas significativementprolongé 10. Par conséquent, l’exploration de nouvelles stratégies de traitement est essentielle pour prolonger la période de survie des patients. Cette recherche émet l’hypothèse que le mécanisme anticancéreux de la curcumine (CUM) sur GBM implique la cuproptose.

Un métabolisme anormal du cuivre ou des lésions cellulaires induites par le cuivre peuvent entraîner une série de maladies11. Dans des conditions redox conventionnelles, le Cu+ réduit peut être oxydé en Cu2+. Tsvetkov et al. ont découvert un mécanisme jusque-là inconnu de mort cellulaire induite par le cuivre, appelé cuproptose. Les ions Cu2+ se lient aux composés acylés, puis l’expression des protéines de grappe Fe-S est alors régulée à la baisse, provoquant la mort cellulaire12,13. Des recherches approfondies ont confirmé que la cuproptose est étroitement liée au processus physiopathologique destumeurs 14,15. Les ARNnc et gènes liés à la cuproptose représentent des biomarqueurs potentiels pour le pronostic et le traitement de laGBM 16. La BCMD peut libérer du Cu2+, induire la cuproptose et déclencher la mort immunogène des cellules pour traiter leGBM 17. C’est pourquoi nous pensons que la cuproptose peut être utilisée comme une nouvelle cible pour la thérapie du GBM. Cependant, la plupart des schémas existants reposent sur des porteurs synthétiques tels que l’Elesclomol-Cu ou l’induction directe d’ions cuivre à haute concentration. Bien que cette intervention exogène et drastique puisse prouver le concept de cuproptose, ses perspectives de transformation clinique sont limitées en raison de son absence de corrélation physiologique et de ciblage. Ainsi, la recherche de composés naturels ou de petites molécules capables de réguler de manière endogène et précise la cuproptose de la GBM et d’élucider son mécanisme de signalisation en amont est devenue un pont clé entre ce mécanisme novateur et le traitement clinique.

La médecine chinoise est largement considérée comme une ressource précieuse pour la recherche sur les médicaments antitumoraux. Le CUM est une substance polyphénolique extraite du curcuma de la médecine traditionnelle chinoise. La pharmacologie moderne a confirmé qu’il possède des fonctions antioxydantes, anti-inflammatoires et antitumorales. Le CUM a de nombreuses activités antitumorales. Elle peut réduire l’activité des cellules GBM en favorisant l’apoptose, la perturbation des voies multimoléculaires et d’autresmécanismes 18. Des expériences in vitro ont montré que la faible dose de CUM combinée à l’irradiation peut améliorer synergiquement la prolifération de l’antiGBM19. De plus, CUM peut réguler les voies principales liées à la GBM, y compris MAPK20. Comparée à la chimiothérapie traditionnelle à la témozolomide (TMZ), la CUM présente des avantages thérapeutiques uniques. L’efficacité du témozolomide est souvent limitée par les puissants mécanismes de réparation de l’ADN dans la GBM, entraînant une résistance aux médicaments ; le mécanisme par lequel le CUM induit la cuproptose en ciblant le métabolisme mitochondrial21,22 est indépendant de la TMZ. La CUM peut non seulement réguler les processus métaboliques liés à la cuproptose, mais aussi interférer simultanément avec plusieurs voies clés de signalisation liées à la progression de la GBM, offrant ainsi des moyens potentiels de surmonter les limites des thérapies individuelles et de développer des stratégies de traitement combinées. La plage de concentration de CUM utilisée dans cette étude (10-20 μM) est cohérente avec les concentrations effectives rapportées dans les études de traitementpréclinique 23. Bien que la faible biodisponibilité orale inhérente du CUM et son efficacité de délivrance à travers la barrière hémato-encéphalique soient des défis majeurs dans les applications pratiques, les systèmes émergents de nano-délivrance et les stratégies de modification ciblée ont apporté des solutions prometteuses pour surmonter ce goulotd’étranglement 24.

Bien que les effets proapoptotiques, antiprolifératifs et inhibiteurs de migration du CUM dans le GBM aient été rapportés par de nombreusesétudes25,26, la plupart des recherches existantes se sont concentrées sur ses effets sur les voies traditionnelles de l’apoptose ou de l’autophagie. Cette étude vise à clarifier si le CUM inhibe la progression maligne du GBM en régulant la cuproptose. Nous avons étudié si le CUM pouvait induire la cuproptose en partie en supprimant l’axe AKT/Wnt/β-caténine, ce qui supprime ainsi la GBM. Sur cette base, cette étude fournit des bases expérimentales pour la CUM afin d’améliorer le traitement de la GBM et de développer de nouvelles cibles dans la thérapie GBM.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux normes institutionnelles établies pour les soins et l’utilisation humaines des animaux de laboratoire et ont été officiellement approuvées par le comité d’éthique animale institutionnel. Des mesures ont été prises pour réduire l’inconfort et la détresse des animaux autant que possible.

Les travaux impliquant des composés chimiques, des colorants et des échantillons biologiques suivaient des pratiques de biosécurité établies afin de réduire les risques potentiels. Les substances potentiellement dangereuses — y compris le paraformoldéhyde, les réactifs à base de cuivre et le DHE — ont été manipulées avec des équipements de protection individuels appropriés, notamment des gants, des masques faciaux et des lunettes de sécurité. Tous les déchets, tels que les réactifs usés et les objets jetables contaminés, ont été séparés dans des contenants biohazard désignés puis traités par des services de gestion des déchets dangereux autorisés, conformément aux réglementations institutionnelles et environnementales de sécurité. Le plan expérimental global est présenté à la Figure 1.

Figure 1
Figure 1 : Le flux de travail de cette étude. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Culture cellulaire et regroupement
Les astrocytes cérébraux humains (NHA) normaux et les lignées cellulaires de glioblastome A172, U251, LN229 et SHG-44 (voir Tableau des matériaux) ont été cultivés dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et maintenus dans une incubatrice à 3 °C avec 5 % de CO₂. Le milieu était changé tous les deux jours, et les cellules étaient transmises lorsqu’elles atteignaient environ 80 % de confluence. La dose appropriée et le temps d’exposition pour le CUM ont été déterminés à l’aide du test MTT. Les cellules NHA, A172, U251, LN229 et SHG-44 ont été traitées avec des concentrations différentes (0, 2,5, 5, 10, 20 et 4 μM) de CUM pendant 24, 48 et 7 heures, respectivement23. Ensuite, 2 μL de solution MTT ont été ajoutés. Après h, 15 μL de diméthylsulfoxyde ont été ajoutés à chaque puits et délicatement mélangés. La densité optique (OD) à 45 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les cellules non traitées (groupe témoin) ont été utilisées comme témoins négatives dans toutes les expériences.

Les cellules A172 et U251 ont été semées et divisées en groupes : témoin, CUM faible dose (1 μM), CUM à haute dose (2 μM), inhibiteur AKT (MK-2206), inhibiteur AKT + inhibiteur Wnt (MK-2206 + LGK974) et Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), selon les conditions de traitement. Les cellules des groupes CUM ont été traitées avec 10 ou 2 μM de CUM pendant 4 heures. Les cellules du groupe MK-2206 recevaient 1 μM de MK-2206 pendant 2 heures. Les cellules du groupe MK-2206 + LGK974 ont été traitées avec μM LGK974 pour l’h après exposition au MK-2206. Les cellules du groupe Elsm-Cu ont été traitées avec 100 nM d’Elesclomol et μM CuCl₂ pendant 4h 14.

Cytométrie en flux
Les cellules A172 et U251 cultivées dans chaque groupe ont été incubées avec des PBS contenant une solution de coloration PI de 1 μg/mL pendant 1 minute. Les cellules ont ensuite été traitées à 0,25 % de trypsine et collectées par centrifugation (20 × g, min, température ambiante). Les cellules PI-positives ont été détectées à l’aide d’un cytomètre en flux avec un canal PE (excitation à 488 nm), et le taux de mortalité cellulaire a étécalculé à 27.

Essai sur l’ester aminé succinimidyle (CFSE) sur la carboxyfluorescéine
Les cellules A172 et U251 ont été incubées avec le colorant CFSE μmol/L CellTrace à 3 °C pendant 1 minute dans l’obscurité. Le milieu était ensuite neutralisé, et les cellules centrifugées à 20 × g pour un minimum à température ambiante. Après la collecte, les cellules ont été cultivées et traitées selon leurs groupes. L’intensité de fluorescence CFSE a été analysée à l’aide de cytométrie en flux (excitation à 488 nm)27.

Essai de formation de clones cellulaires
Les cellules A172 et U251 cultivées ont été digérées, remises en suspension et comptabilisées. Deux millilitres de suspension à cellules préparées ont été ajoutés. Après un mélange doux, les cellules ont été incubées pendant environ 14 jours. Les cellules ont ensuite été fixées avec 4 % de paraformdéhyde pendant 3 minutes, puis le fixatif a été éliminé. Après coloration au violet cristallin à 0,1 %. Des images de colonie ont été capturées, et le taux de formation des clones a été calculéà 14.

Test de rayure cellulaire
Les cellules A172 et U251 (1 × 10cellules 6 par puits) ont été cultivées jusqu’à atteindre une confluence de 90 %. La monocouche cellulaire a été grattée une fois à l’aide d’une pointe stérile de 2 μL pour créer une plaie, puis traitée avec différentes concentrations de CUM pour l’h et 48 h. Les images ont été capturées au microscope. Le taux de guérison des rayures a été évalué à l’aide du logiciel ImageJ. Les images ont été converties au format 8 bits, un seuil unifié a été fixé pour distinguer la zone de rayage de celle de la cellule, et les zones de rayage à 0 h et 48 h ont été calculées à l’aide de la fonction Analyser les particules . Taux de guérison par rayures ( %) = (distance 0 h − distance 48 h) / distance 0 h × 100 %23.

Expérience Transwell
Les cellules A172 et U251 ont été exposées aux traitements spécifiés, puis décollées enzymatiquement et centrifugées à 200 × g pendant 5 minutes à température ambiante. Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu sans sérum. Matrigel a été dilué à un ratio 1:8 dans un milieu sans sérum, soigneusement mélangé, et 5 μL a été appliqué dans la chambre supérieure d’un insert Transwell, suivi d’une incubation de 4 heures. Un total de 5 × 10cellules de 4 cellules par puits ont été ajoutées à la chambre supérieure, tandis que 60 μL de milieu complétés par 20 % de FBS ont été placés dans la chambre inférieure. Après 48 heures d’incubation, les cellules ont été fixées à l’aide de paraformaldéhyde et colorées au violet cristallin. Cinq champs visuels ont été sélectionnés au centre et à la périphérie de chaque puits. Les cellules ont été observées et imagées au microscope. Les cellules invasives ont été calculées à l’aide d’ImageJ. Les images ont été converties au format 8 bits, des seuils ont été appliqués pour distinguer les cellules colorées de l’arrière-plan, et la fonction Analyze Particles comptait les cellules ayant migré à travers la membrane23.

Détection du potentiel de membrane mitochondriale (MMP)
Les cellules A172 et U251 cultivées dans chaque groupe ont été incubées avec des mL de solution de travail JC-1 pendant 30 minutes dans l’obscurité. Les cellules ont été délicatement lavées avec un tampon JC-1 prérefroidi, observées et photographiées au microscope à fluorescence. Grâce à l’excitation de 488 nm, les signaux polymères et monomères JC-1 ont été collectés à l’aide de filtres d’émission de 590 nm et 530 nm, respectivement. Le rapport de fluorescence rouge/vert (agrégats JC-1 aux monomères) a été analysé à l’aide du logiciel ImageJ pour évaluer les variationsMMP 28. Les images des canaux rouge et vert ont été extraites séparément, et l’intensité moyenne de fluorescence dans la même région a été quantifiée.

Détection du taux de consommation d’oxygène (OCR)
Des cellules A172 et U251 cultivées ont été ensemencées. La plaque était placée dans un analyseur préchauffé à 3 °C pour l’adaptation. Une fois adapté, le milieu de détermination a été ajouté. Après étalonnage automatique, la plaque était équilibrée pendant 15-2 minutes à 3 °C sans CO2. La TOC de base a été mesurée, et le programme de test a été configuré pour enregistrer la TOC mitochondriale à intervalles définis. Les données ont été exportées pour une analyseultérieure 28.

Détection par sonde fluorescente MitoSOX des espèces réactives de l’oxygène (ROS)
Les cellules A172 et U251 ont été ajustées à une densité de 1 × 104 cellules/mL, et 1 mL par puits a été ensemencé dans une boîte confocale, puis l’intervention médicamenteuse a été réalisée. Le surnageant de la cellule a été abandonné, et 1 mL de sonde MitoSOX diluée (1:1 000) a été ajouté. Les cellules ont été incubées dans l’obscurité à 3 °C pendant 1 minute. Le signal de fluorescence a été capté à l’aide d’un microscope à fluorescence (excitation/émission : 510/580 nm) pour évaluer les niveaux de ROSmitochondrial 29.

Immunofluorescence
Les couvertures ont été lavées une fois avec un milieu de culture DMEM. Ils ont ensuite été placés dans des plaques à six puits pour l’ensemencement cellulaire et l’intervention médicamenteuse. Après 24 heures, les cellules ont été fixées dans du paraformoldéhyde à 4 % puis bloquées avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % pendant 30 minutes. La solution bloqueante a été retirée, et des anticorps primaires dilués ciblant la dihydrolipoamide acétyltransférase (DLAT) et la β-caténine ont été appliqués, suivies d’une incubation nocturne à °C 30. Des anticorps secondaires marqués par fluorescence ont ensuite été introduits et incubés à 3 °C pendant 30 minutes. Les noyaux cellulaires étaient contre-colorés avec du DAPI, et les lames étaient montées à l’aide d’un réactif antifondu. Les images de fluorescence ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence, et l’intensité du signal a été quantifiée avec le logiciel ImageJ. Les images étaient converties en format 8 bits, et un seuil cohérent était appliqué pour distinguer les signaux cibles du bruit de fond. L’outil Rectangle a été utilisé pour sélectionner les régions cellulaires souhaitées, et l’intensité moyenne de fluorescence a étémesurée à 27. Pour visualiser les mitochondries, les cellules ont été traitées avec 20 nM MitoTracker Red CMXRos pendant 30 minutes, puis fixées avec du paraformoldéhyde30.

Kit de reporter luciférase TCF/LEF1
L’activation Wnt/β-caténine dans les cellules A172 et U251 a été évaluée à l’aide d’un kit de signalement de luciférase TCF/LEF1. Le vecteur rapporteur TCF/LEF contient une boîte TATA et des éléments de réponse facteur T/facteur amplificateur lymphoïde (TCF/LEF), permettant la détection indirecte de l’activité transcriptionnelle de la β-caténine via l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP). Les cellules A172 et U251 cultivées ont été transfectées inversement avec un vecteur rapporteur TCF/LEF de 5 ng. Seize heures après la transfection, l’intensité de fluorescence a été enregistrée à l’aide d’un lecteur de microplaques avec des réglages d’excitation et d’émission de 488 et 51 nm, respectivement31.

Souris porteuses de tumeurs
Dix souris nues mâles BALB/c (7 semaines, 2 ± 2 g) ont été maintenus dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes (2 °C, 65 % d’humidité) avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau standards. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique du Premier Hôpital affilié de l’Université du Yangtsé (n° 2023092 ; date d’approbation : 18.10.2023).

Pour établir un modèle de xénogreffe GBM, des cellules A172 (4 × 106 cellules/mL) ont été suspendues dans un milieu sans sérum, et 0,1 mL a été injecté par voie sous-cutanée dans le flanc droit de chaque souris. Les animaux ont été assignés aléatoirement soit à un groupe témoin, soit à un groupe de traitement CUM (n = 5 par groupe). Le groupe CUM a reçu 60 mg/kg de curcumine par jour via une gavage orale, tandis que le groupe témoin a reçu un volume équivalent de sérum physiologique. Les diamètres des tumeurs étaient enregistrés tous les 7 jours à l’aide d’un caliper vernier, et le volume tumoral calculé selon la formule de 1/2 × longueur ×largeur 2 (mm3). Après 5 semaines, les souris ont été euthanasiées par luxation cervicale, et les tumeurs ont été prélevées dans des conditions stériles pour une mesurede poids 32.

Dosage TUNEL
Les tissus tumoraux ont été fixés à 4 % de paraformoldéhyde pendant 24 heures, déshydratés dans de l’éthanol, intégrés dans la paraffine et sectionnés à une épaisseur μm. Les sections ont été décirées et réhydratées, rincées avec PBS, traitées avec la protéinase K pendant 50 minutes pour la récupération antigénique, puis incubées avec du peroxyde d’hydrogène à 3 %. Un mélange de réaction TUNEL était appliqué pendant 1 heure, suivi d’un montage avec un réactif antifade. Des images de fluorescence ont été obtenues par microscopie, et les cellules TUNEL-positives par champ ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ.

Immunohistochimie
Les coupes tumorales incrustées dans la paraffine ont été cuites à 6 °C, décirées dans du xylène et réhydratées à travers une série d’éthanol graduée. La récupération d’antigènes a été réalisée à l’aide d’un tampon EDTA chauffé, suivie d’un trempage de l’activité endogène peroxydase. Les lames ont été incubées avec l’anticorps primaire anti-Ki-67 pendant la nuit à °C. Après incubation avec un anticorps secondaire pendant 20 minutes, les sections ont été colorées à la diaminobenzidine (DAB) pendant 5 minutes puis contre-colorées avec de l’hématoxyline. Après déshydratation et montage avec une résine neutre, les lames ont été photographiées au microscope. La coloration positive a été identifiée par un précipité brun-jaune, et les cellules Ki-67 positives ont été quantifiées à l’aide de l’ImageJ27.

Coloration par fluorescence au dihydroethidium (DHE)
Les niveaux de ROS ont été évalués à l’aide de coloration fluorescente DHE. Les sections de tissu tumoral gelé ont été rincées avec du PBS. La fluorescence de fond a été trempée, et μM DHE a été ajouté à chaque section pendant 3 minutes. Après le lavage PBS, les sections ont été scellées dans l’obscurité. La fluorescence a été observée au microscope (excitation/émission : 518/605 nm), et cinq images aléatoires ont été collectées par groupe. ImageJ a été utilisé pour quantifier les niveaux ROS.

Détection de contenu cu2+
La concentration de Cu2+ dans les cellules GBM et les tissus tumoraux a été évaluée à l’aide d’un kit de détection colorimétrique. Les cellules A172 et U251, après traitement, ont été prélevées et centrifugées à 1 500 × g pendant 10 minutes à °C. Les granulés cellulaires ont été resuspendus en 0. mL d’eau distillée, sonique sur glace, puis centrifugée à nouveau. Les tissus tumoraux ont été homogénéisés dans de l’eau distillée puis centrifugés de manière similaire à 4 °C pendant 10 minutes. Les surnatants (1 μL) ont été transférés sur une plaque à 96 puits, mélangés avec 23 μL de réactif chromogénique, scellés et incubés pendant 5 minutes. La densité optique (OD) a été mesurée à 58 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques, et les niveaux de Cu2+ ont étécalculés à 14.

Western Blot (WB)
Des protéines ont été isolées à partir de cellules cultivées et de tissus tumoraux. Les surnadants ont été obtenus par centrifugation à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C, et les concentrations en protéines ont été quantifiées à l’aide d’un test BCA. Après la dénaturation, les échantillons ont été séparés par SDS-PAGE, transférés dans des membranes PVDF, puis bloqués avec 5 % de lait écrémé pendant 1 heure. Les membranes ont été lavées dans le TBST et incubées toute la nuit à °C avec des anticorps primaires contre FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-caténine, p-β-caténine et β-actine (voir le tableau des matériaux)14,33. Après des lavages supplémentaires de TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 heure, développées à l’aide d’un réactif ECL, et visualisées par chimiluminescence. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour quantifier l’intensité du signal en utilisant l’outil de sélection Rectangle et la fonction d’analyse Gels. L’expression relative des protéines a été calculée comme le rapport entre la valeur grise de la bande cible et le contrôle interne (GAPDH). Des extraits nucléaires des cellules A172 et U251 ont été préparés à l’aide d’un kit d’extraction de protéines nucléaires. L’expression de la β-caténine et de la Lamin B1 a été évaluée, avec la Lamin B1 servant de contrôle de chargenucléaire 34.

Analyse statistique
Les résultats quantitatifs reflètent la moyenne de trois réplications indépendantes. Toutes les données ont été évaluées pour la distribution normale et l’homogénéité de la variance. L’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey a été utilisée pour des comparaisons entre plusieurs groupes. Les données sont présentées en moyenne ± écart-type (DS). Une valeur P inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Ces procédures ont été utilisées pour garantir la robustesse des données et soutenir la fiabilité des conclusions.

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Résultats

Inhibition de la viabilité des cellules GBM et mort cellulaire induite
Premièrement, il n’y a pas eu de changement significatif de la viabilité des cellules NHA après 2 heures, 48 heures et 72 heures d’intervention avec CUM (Figure 2A), indiquant que les concentrations de CUM utilisées n’avaient aucun effet toxique sur les cellules normales. En revanche, la viabilité des lignées cellulaires GBM (A172, U251, LN229 et SHG-44) a été significativement réduite à des concentrat...

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Discussion

Le taux de récidive de la GBM est associé à ses caractéristiques biologiquesmalignes 36. Le CUM exerce des effets anti-GBM en régulant le stress oxydatif, l’apoptose, l’autophagie, les métastases, l’invasion et des cibles moléculairesclés 37. Dans cette étude, des expériences au niveau cellulaire ont démontré que le CUM augmentait significativement la mortalité cellulaire GBM et inhibait la prolifération, la formation de colonies, la migrat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution de coloration violette cristalline à 0,1 %ServicebioG1014Cellules de marquage
4 % de paraformoldéhydeBeyotimeP0099Réparer les cellules ou les tissus
Inhibiteur d’AKT (MK-2206)Selleck.cn, Shanghai, ChineS1078Inhibiteur spécifique de l’AKT
Anticorps (anticorps primaires et secondaires)Technologie ABclonale, Wuhan, Chine / abcam, Cambridge, Royaume-Uni / Servicebio, Wuhan, Chine / Beyotime, Shanghai, Chine / Signalisation cellulaire, Danvers, MA, États-UnisA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Détection des niveaux d’expression des protéines
Kit de détection de l’apoptose cellulaireServicebio, Wuhan, ChineG1021Détection de l’apoptose
Colorant Cell Trace CFSEInvitrogen, Carlsbad, CA, États-UnisC34570Détection de la prolifération cellulaire
Système d’imagerie chimiluminescenceBio-Rad, Hercules, CA, USAChemi Doc XRS+Détection ultra-haute sensibilité des protéines
Kit de test colorimétrique Cu2+Elabscience, Wuhan, ChineE-BC-K300-MDétection de la teneur en Cu2+ dans les tissus tumoraux et les cellules GBM
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne751944Inducteur de cuproptose
Curcumine (CUM)Feuille source de Shanghai, Shanghai, ChineS19245Composé polyphénolique
Kit de détection DHEBeyotime, Shanghai, ChineS0063Détection des niveaux ROS
Diméthylsulfoxyde (DMSO)ServicebioG4101-2Solvant pour le test MTT
Développeur ECLServicebioG2161Utilisé pour le western blot
ElesclomolSelleck.cnS1052Inducteur de cuproptose
Cytométrie en fluxBD en biosciences, New Jersey, États-UnisBD FACSAria IIIUtilisé pour les tests de mort cellulaire et CFSE
Microscope à fluorescenceOLYMPUS, Tokyo, JaponIX73Utilisé pour les tests d’immunofluorescence, ROS, TUNEL, DHE et MMP
Lignées cellulaires de glioblastome A172 (RRID : CVCL_0131), U251 (RRID : CVCL_0021), LN229 (RRID : CVCL_0393) et SHG-44 (RRID : CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChineCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Lignées cellulaires de glioblastome humain
Logiciel GraphPad Prism 9.0GraphPad Software, LLCVersion 9.0Analyse statistique
Logiciel ImageJ 1.53kInstitut national de la santé mentaleVersion 1.53kCalcul statistique
Solution fonctionnelle JC-1Solarbio, Pékin, ChineM8650Détection de la MMP
Souris nues mâles BALB/cSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, ChineExpérience de souris
Lecteur de microplaquesBio-Tek, Vermont, États-UnisELX-800Pour la mesure de la valeur OD450 nm
MicroscopeOLYMPUSBX53Utilisé pour le test de rayage cellulaire, l’expérience de Transwell et les tests d’immunohistochimie
Sonde MitoSOXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-UnisM36008Utilisation pour la détection ROS
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Marquage spécifique des mitochondries dans les cellules vivantes
Kit de détection MTTServicebioG4101-1Détection de la viabilité cellulaire
Cellules NHA normales des astrocytes du cerveau humain (RRID :CVCL_B0DK)Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, ChineHTX2408Lignée cellulaire pour les expériences témoins
Kit d’extraction de protéines nucléairesBeyotimeP0027Extraction de protéines nucléaires
Analyseur de métabolisme énergétique des cellules hippocampesAgilent,   ; Pékin, ChineHippocampe XFUtilisé pour la détection OCR
Kit de reporter luciférase TCF/LEF1Biolab Technology Co., Ltd, Pékin, ChineDétection de l’activité de la voie de signalisation Wnt/&bêta ;-caténine
Kit de détection TUNELBeyotimeC1088Détection de l’apoptose dans les tissus tumoraux
Inhibiteur de Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143Inhibiteur spécifique de la Wnt

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