Visualisation de l’électrotaxie dépendante de l’âge de cellules souches humaines dérivées de l’adipeux sous champs électriques en courant continu

Summary

Chez une petite cohorte de donneuses, le vieillissement a réduit la migration électrotactique des hADSC. Le DCEF a modifié l’expression génique (747 en montant, 624 en descendant), enrichissant les termes de transport/canal GO du sodium et les voies PI3K-Akt KEGG, suggérant une implication dans l’électrotaxie liée à l’âge, sans établir de causalité.

Abstract

Les cellules souches humaines dérivées de l’adipeux (hADSC) sont essentielles à la régénération tissulaire et à la cicatrisation des plaies, et leur migration dirigée est une condition préalable à l’exercice de ces effets thérapeutiques. Les champs électriques (EF) sont bien reconnus comme des indices clés guidant la migration cellulaire lors de la réparation de la plaie, pourtant le comportement électrotactique des hADSC — notamment la manière dont les caractéristiques du donneur (par exemple, l’âge) régulent ce comportement et ses mécanismes moléculaires sous-jacents — reste peu compris. Cette lacune de connaissances limite l’application optimisée des hADSC en médecine régénérative. Dans cette étude, nous avons d’abord validé l’existence d’électrotaxis chez les hADSC et confirmé sa dépendance à la tension : sous des champs électriques en courant continu (DCEF) de 100 à 200 mV/mm, les hADSC migraient directionnellement vers l’anode, avec des intensités de EF plus fortes augmentant à la fois la directionnalité et la vitesse de migration (contre 0 mV/mm). Nous avons ensuite comparé les hADSC de jeunes donneuses (27,00 ± 4,58 ans) et les donneuses âgées (62,33 ± 4,04 ans) en utilisant le séquençage ARN (RNA-seq) après une stimulation DCEF à 200 mV/mm. L’analyse transcriptomique a identifié 747 gènes à la hausse et 624 à la baisse chez les hADSC âgés, avec des gènes différenciellement exprimés (DEG) enrichis dans des processus/voies biologiques essentiels pour l’électrotaxie — y compris le transport transmembranaire d’ions sodium, l’activité des canaux sodium dépendante de la tension (termes GO) et la voie de signalisation PI3K-Akt (voie KEGG). Sur le plan fonctionnel, les hADSC âgés ont montré une migration anodale significativement réduite (distance accumulée, distance euclidienne et directité diminuées) comparées aux jeunes hADSC sous stimulation DCEF. Cette étude fournit la première preuve d’électrotaxie dépendante de l’âge chez les hADSC, démontrant que l’âge du donneur est corrélé à une capacité électrotactique altérée. Elle révèle en outre que l’activité déréglée des canaux sodium et la signalisation PI3K-Akt pourraient être à l’origine de ce déclin lié à l’âge. Ces résultats mettent en lumière les mécanismes régulateurs potentiels de l’électrotaxie hADSC et offrent de nouvelles perspectives pour adapter les thérapies basées sur hADSC (par exemple, sélectionner des donneurs optimaux ou cibler les voies sodium/PI3K-Akt) afin d’améliorer la régénération tissulaire et les résultats de cicatrisation.

Introduction

Les cellules souches dérivées des adiposes (ADSC) possèdent une forte capacité d’auto-renouvellement et un potentiel régénératif important. Dans des conditions d’induction appropriées, ils peuvent se différencier en ostéoblastes, chondrocytes et adipocytes, entre^{autres 1}. Grâce à la signalisation paracrine, l’ADSC peut également soutenir la génération de vaisseaux sanguins et lymphatiques ^2,3, inhiber la formation de^{cicatrices 4}, et présenter des effets régulateurs^{immunitaires 5}. Par conséquent, l’ADSC est considérée comme une cellule de départ idéale pour les thérapies cellulaires en médecine régénérative.

La fonction de l’ADSC est influencée par diverses caractéristiques du donneur, qui peuvent influencer leur efficacité potentielle dans les thérapies cellulaires, notamment l’âge du donneur, l’indice de masse corporelle, le sexe, et d’autres⁶. Les ADSC dérivés de donneurs plus âgés présentent des caractéristiques de vieillissement plus marquées, avec un potentiel de différenciation adipogénique réduit, un potentiel de différenciation ostéogénique et une capacité migratoire ^7,8,9. De plus, la capacité à favoriser la prolifération des kératinocytes et à stimuler les mécanismes d’auto-réparation de l’organisme est^diminuée.

La migration dirigée par les cellules est un mécanisme physiologique clé dans la cicatrisation des plaies et la régénération tissulaire, les champs électriques (EF) jouant un rôle important dans la migration cellulaire et la promotion de la réparation^{des plaies 11}. Par exemple, lorsque la barrière épithéliale est endométrée, des champs électriques endogènes sont immédiatement générés et persistent jusqu’à ce que la plaie guérisse et que la fonction de barrière épithéliale soit^rétablie 12,13,14. En tant que l’un des signaux guidant la migration dirigée des cellules, il a été démontré que les signaux électriques ont une priorité plus élevée que d’autres signaux coexistants, tels que l’inhibition du contact, les forces mécaniques et les facteurs^{chimiotactiques 15,16}. Plusieurs méthodes ont été développées pour favoriser la cicatrisation des plaies et la régénération des tissus, notamment par des médicaments et des dispositifs externes de stimulation électrique qui amplifient ou imitent les champs électriques endogènes du corps^{humain 17,18}. La capacité des cellules à migrer selon un gradient de champ électrique est appelée électrotaxie. Des études in vitro ont montré que de nombreux types de cellules sont capables de migrer de façon dirigée dans les champs électriques. Certaines cellules migrent vers l’anode, telles que les cellules de la crête neurale crânienne des mammifères, les astrocytes humains et les cellules de cancer du sein^humain 19,20,21. D’autres cellules migrent vers la cathode, telles que les cellules épithéliales tubulaires tubulaires humaines rénales, les fibroblastes dermiques humains et les neutrophiles^humains 22,23,24. L’ADSC peut être guidé pour migrer vers l’anode dans les champs électriques en courant continu (DC), et en conditions de culture prolongée, il a été démontré que le courant électrique pulsé exogène favorise efficacement la migration directionnelle de l’ADSC vers l’anode tout en maintenant la viabilité de la^{cellule 25}. À ce jour, les études sur les caractéristiques d’électrotaxie des cellules souches humaines dérivées de l’adipeux restent rares, et les mécanismes sous-jacents régulant leur comportement électrotactique ne sont pas encore pleinement compris.

Nous sommes les premiers à étudier systématiquement les différences électrotactiques dépendantes de l’âge dans les hADSC chez les donneuses jeunes et âgées sous des champs électriques à courant continu gradient (DCEF), et à mieux découvrir les mécanismes sous-jacents (impliquant l’activité des canaux sodium et la signalisation PI3K-Akt) grâce à l’analyse transcriptomique. Dans cette étude, nous avons examiné les effets du DCEF sur les hADSC. En utilisant le séquençage d’ARN et l’analyse d’enrichissement génétique différentiel, nous avons comparé les profils d’expression génique entre deux groupes hADSC — dérivés de donneuses jeunes et âgées — suivant une stimulation DCEF afin d’identifier les différences transcriptionnelles liées à l’âge. Nous avons émis l’hypothèse que le vieillissement du donneur altère la réactivité électrotactique des hADSC, et que ce déclin lié à l’âge est lié à une altération de l’activité des canaux sodium et à la signalisation PI3K-Akt.

Protocol

Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants avant la collecte de tissus. Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Chine (Approbation n° : [2018]2018-110-2). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant la collecte des tissus

Isolement et culture du hADSC
Collecte de tissus : Des échantillons humains de tissu adipeux abdominal ont été prélevés lors de liposuccions électives de routine réalisées au département de chirurgie plastique du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Chine. Toutes les donneuses étaient des femmes bénévoles en bonne santé subissant une liposuccion abdominale esthétique, et aucune intervention chirurgicale supplémentaire n’a été réalisée à des fins de recherche. Les échantillons de tissu ont été prélevés par le chirurgien opérateur dans des conditions stériles immédiatement après l’aspiration et transférés au laboratoire dans des contenants stériles sur glace dans un délai de 30 minutes.

Taille de l’échantillon : Un total de 6 donneurs ont été inclus dans cette étude, comprenant 3 jeunes donneurs (âge : 27,00 ± 4,58 ans) et 3 donneurs plus âgés (âge : 62,33 ± 4,04 ans).

Traitement des tissus : Transférer les fragments de tissu adipeux dans un tube conique de 50 mL, centrifuger à 1 800 x g pendant 3 minutes à 4 °C, puis aspirer soigneusement la phase olébouse supérieure (pour éliminer l’excès de lipides). Ajoutez 0,2 % de collagénase de type IV (volume final : 5-10 mL par 1 g de tissu adipeux) au granule de tissul, puis placez le tube dans un bain-marie ou un incubateur à 37 °C pendant 45 minutes. Agitez doucement le tube toutes les 10 à 15 minutes pendant la digestion pour assurer un contact uniforme entre la collagénase et le tissu. Après la digestion, interrompez la réaction en ajoutant du DMEM à faible glycémie complété avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine (rapport volumique entre le milieu de neutralisation et la solution de collagénase = 1:1).

ATTENTION : Lors de la manipulation de collagénase, portez des gants jetables, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité pour éviter le contact visuel et de la peau, préparez et utilisez le réactif dans un cabinet de sécurité biologique (BSC) pour éviter la contamination par aérosols, et en cas de déversement, essuyez immédiatement avec de l’éthanol à 75 % et jetez les matériaux contaminés comme déchets biologiques.

Isolation cellulaire : Centrifugez le mélange de digestion neutralisé à 1 200 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour pelleter les cellules. Jetez le surnageant, puis resuspendez le pellet dans un tampon de lyse érythrocytaire (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA ; pH 7,4 ; volume : 2-3 mL par pellet) et incubez à température ambiante (22-25 °C) pendant 5 minutes pour lyser les globules rouges résiduels. Filtrez la suspension cellulaire séquentiellement à travers des filtres de 200 μm pour éliminer les débris tissulaires non digérés et obtenir une suspension unicellulaire.

Comptage des cellules : Avant la mise en graine, le nombre de cellules a été quantifié à l’aide d’un hémocytomètre. En résumé, les hADSC ont été détachés avec 0,25 % de trypsine-EDTA, resuspendus dans un milieu de croissance, et mélangés 1:1 avec une solution bleue de trypan à 0,4 %. Les cellules viables (non colorées) ont été comptées manuellement à l’aide d’un hémocytomètre de Neubauer sous un microscope optique, et le nombre total de cellules viables a été calculé comme : nombre de cellules/mL = (cellules moyennes comptées x facteur de dilution x 10⁴).

Culture cellulaire : Semez les cellules filtrées à une densité de 5 x 10³ cellules/^{cm 2} dans un milieu de croissance (DMEM à faible glucose + 10 % FBS + 1 % pénicilline/streptomycine) et incubez à 37 °C avec 5 % de_CO-2. Remplacez le milieu tous les 2-3 jours pour éliminer les cellules non adhérentes et maintenir des conditions de culture optimales. Tous les hADSC utilisés pour les expériences ultérieures — y compris la caractérisation cellulaire (détection de marqueurs de surface, tests de différenciation trilineage), stimulation DCEF, analyse de migration et morphologie, tests de sénescence/prolifération et séquençage d’ARN — étaient situés du passage 3 au passage 5.

Caractérisation hADSC
Expression des marqueurs de surface cellulaire : Cultivez les cellules jusqu’à 70 % de confluence, puis dissociez les cellules adhérentes avec 0,25 % de trypsine-EDTA (incubez à 37 °C pendant 3 minutes). Centrifugez la suspension de la cellule à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C, jetez le surnageant, puis resuspendez la pellete de cellule dans 1x PBS (volume : 1-2 mL). Aliquote 1 x 10⁵ cellules par échantillon (resuspendu dans 100 μL de 1x PBS) et ajoute des anticorps conjugués fluorescentement aux dilutions spécifiées : anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) et anti-CD105 (1:20)^1,4,7. Incubez le mélange anticorps-cellules à 4 °C pendant 30 minutes dans l’obscurité pour éviter la trempe au fluorophore. Après l’incubation, centrifugez à 1 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C et aspirez complètement le surnageant. Reposez le pellet dans 1 à 2 mL de 1x PBS, centrifugez à nouveau à 1 000 x g pendant 3 minutes à 4 °C, jetez le surnageant, puis répétez ce lavage deux fois pour éliminer les anticorps non liés. Enfin, resuspendez la pellete cellulaire dans 200 μL de PBS 1x frais, obtenez des données de fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux et effectuez une analyse quantitative avec le logiciel FlowJo (v10). Le flux de travail de gating suivait les procédures standard de phénotypage MSC : porte FSC-SSC pour exclure les débris et sélectionner la population cellulaire principale en fonction de la taille et de la granularité, suivi d’une exclusion double-double à l’aide de diagrammes FSC-A vs. FSC-H et SSC-A vs. SSC-H pour garantir les événements à cellule unique. Ensuite, un contrôle des cellules vivantes a été effectué pour exclure les cellules mortes trypan-bleu-positif ou PI-positif. Un filtrage de fluorescence a été réalisé pour les contrôles à coloration unique, et des contrôles non colorés ont été utilisés pour fixer des seuils pour les CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (marqueurs positifs) et CD34, CD45 (marqueurs négatifs). Des parcelles de gating représentatives ont été exportées et analysées pour confirmer l’identité des hADSC.

Potentiel de différenciation
Différenciation adipogénique : Récolter les hADSC de génération P3 à 85 % de confluence en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA, puis les semer dans des plaques à 24 puits à une densité de 1 x 10⁵ cellules par puits (en utilisant un milieu DMEM complet) et incuber à 37 °C avec 5 % de_CO2 jusqu’à ce que les cellules atteignent à nouveau 85 % de confluence. Pour l’induction, utilisez le kit de différenciation d’adipogenèse, reconstituant le composant A du kit (inducteur adipogénique) et le composant B (mainteneur adipogénique) selon le manuel, et utilisez le composant A pendant les 3 premiers jours avant de passer au composant B pendant 1 jour. Répétez ce cycle pendant 3 semaines. Pour la coloration, aspirez le milieu d’induction, lavez doucement les cellules avec 3 mL de 1x PBS (évitez de perturber les couches cellulaires), fixez les cellules avec 4 % de paraformoldéhyde (PFA) à température ambiante pendant 20 minutes, puis incubez avec une solution d’huile rouge O à 0,3 % (préparée en 60 % d’isopropanol) à température ambiante pendant 15 minutes. Laver les cellules 3 fois avec 1 tube de PBS pour enlever l’excès de tache, puis imager les gouttelettes lipidiques au microscope luminique inversé (20 fois).

Différenciation ostéogénique : Semez des hADSC dans des plaques à 12 puits à une densité de 1 x 10⁵ cellules par puits, et lorsque les cellules atteignent 85 % de confluence, utilisez le kit de différenciation ostéogenèse pour l’induction — reconstituez la composante A du kit (inducteur ostéogénique) et la composante B (supplément ostéogène) dans un DMEM à faible glucose (concentrations finales : 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine, 0,1 μM dexaméthasone, 10 mM β-glycérophosphate, 0,05 mM d’acide ascorbique-2-phosphate) et de rafraîchir le milieu tous les 3 jours pendant 3 semaines. Pour la coloration, fixez les cellules avec 4 % de PFA à température ambiante pendant 15 minutes, lavez 3 fois avec 1 x PBS, puis incubez avec une solution d’alizarine rouge S à 2 % (pH 4,2, préparée dans de l’eau déionisée) à température ambiante pendant 30 minutes. Laver les cellules 3x avec 1x PBS pour retirer la tache non liée, puis imager les nodules déposés dans le calcium au microscope à contraste de phase (20x) et quantifier la minéralisation en mesurant la surface des nodules S-positifs à l’alizarine rouge à l’aide du logiciel ImageJ.

Différenciation chondrogénique : Centrifugez 250 000 hADSC à 500 g pendant 5 minutes à 4 °C dans un tube conique de 15 mL pour former une pellete cellulaire, ajoutez 500 μL de milieu DMEM complet au tube, puis incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de_CO2 pour stabiliser la pellete. Le lendemain, utilisez le kit de différenciation de chondrogenèse pour l’induction — reconstituez le composant A du kit (inducteur chondrogénique) dans un milieu indépendant du CO₂ (concentrations finales : 1 % de pénicilline/streptomycine, 10 ng/mL de TGF-β3, 50 μg/mL d’acide ascorbique-2-phosphate, 100 μg/mL de pyruvate de sodium) et rafraîchissant doucement le milieu tous les 3 jours (évitez de déranger le granule). Après 3 semaines d’induction, fixez le granule cellulaire avec 4 % de PFA à température ambiante pendant 30 minutes, aspirez le fixateur, incubez avec une solution de bleu de Toluidine à 0,1 % (p/v) (préparée dans un tampon d’acétate de sodium 0,1 M, pH 4,0) à température ambiante pendant 15 minutes, aspirez la tache, rincez la granule trois fois avec de l’eau déionisée pour éliminer l’excès de colorant, puis imager sous un microscope en champ clair (20x) et quantifier l’accumulation de protéoglycane sulfatés en mesurant la densité optique moyenne (OD) de la coloration au bleu de toluidine Blue O à l’aide du logiciel ImageJ.

ATTENTION : Lors de la manipulation de PFA à 4 % (un réactif toxique et corrosif), travaillez exclusivement dans une hotte en portant des gants jetables, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité pour éviter l’inhalation de vapeur ou le contact avec la peau et les yeux — en cas de contact, rincez immédiatement avec de l’eau courante pendant 15 minutes et consultez un médecin. Pour l’élimination des déchets dangereux, collectez les matériaux usagés contaminés par les PFA et les PFA (par exemple, pointes de pipette, plaques) dans un conteneur dédié à déchets chimiques étiqueté PFA Waste et éliminez les déchets en suivant les protocoles institutionnels de déchets dangereux, en veillant à ne pas se mélanger avec les déchets biologiques.

Assemblage de la chambre électrotaxe : Forez deux trous (0,75 cm de diamètre) aux extrémités opposées de la ligne centrale sur un couvercle de boîte de Petri de 10 cm, positionné à 1 cm du bord de la plaque (pour accueillir des ponts d’agar et de sel). Appliquez une fine couche de graisse sous vide (≤ 2 cm de long, ≤ 1 cm de large) au fond de la boîte de Petri le long de la ligne centrale, à 4 cm de chaque bord (Figure 1A). À l’aide de pinces à pointe fine stériles, placez une goulotte en verre stérile de 1 cm x 2 cm sur chaque patch graisseux, et appuyez doucement pour assurer une étanchéité hermétique (éviter la casse de la couvre-toile ; Figure 1B-C). Appliquez une autre fine couche de graisse sous vide sur chaque gaine de revêtement fixée, puis placez une seconde gaine de verre stérile de 1 cm x 2 cm directement sur la graisse pour former une pile double gaine. Appuyez doucement pour assurer une étanchéité étanche entre les deux bâtons de couverture (éviter les fuites de moyenne ; Figure 1D). Le long de la ligne diagonale reliant le coin supérieur gauche d’une pile de couverture au bord de la vaisselle la plus proche, et le coin inférieur droit de la pile opposée à son bord le plus proche, appliquez de la graisse sous vide pour former une paroi barrière continue. Le mur doit être fermement collé au fond de la vaisselle (sans espaces) et mesurer environ 2 cm de hauteur et 0,5 cm de largeur (Figure 1E). Stériliser la chambre assemblée sous lumière UV pendant 20 minutes (pour éliminer la contamination microbienne), puis conserver à température ambiante dans des conditions stériles jusqu’à utilisation (Figure 1F).

Stimulation DCEF : Placez des lames en verre stériles (pour l’ensemencement cellulaire) dans une boîte de Petri de 10 cm et incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de_CO2 pour préconditionner les lames (favoriser l’adhésion cellulaire). Préparer la solution de Steinberg en diluant 10 mL de solution 10x dans 90 mL de ddH₂O (stérile ; concentrations finales : 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO₃)₂4H₂O, 0,83 mM MgSO₄7H₂O, 10 mM HEPES ; pH 7,4). Ajoutez 0,3 g d’agar à 20 mL de la solution de Steinberg préparée, laissez au micro-ondes pendant 20 s jusqu’à ce que l’agar soit complètement dissous et que la solution soit claire, puis remplissez immédiatement les ponts de sel en verre personnalisés avec le mélange chaud d’agar-Steinberg et laissez solidifier à température ambiante. Après solidification, stériliser les ponts de sel sous lumière UV pendant 15 minutes, puis stériliser deux béchers (chacun contenant 30 mL de solution de Steinberg) sous lumière UV pendant 15 minutes. Semez les hADSC de génération P3 sur les lames stériles préconditionnées à une densité de 2 x 10⁴ cellules/cm², incubez à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 24 h pour permettre l’adhésion cellulaire, puis transférez les lames ensemencées par cellules sur la piste de la chambre d’électrotaxie assemblée et fixez-les avec des lames latérales stériles (pour éviter les mouvements). Scellez la piste en plaçant une toile de revêtement en verre de 3 cm x 2 cm sur la graisse sous vide, en appuyant doucement pour assurer une étanchéité hermétique, puis en appliquant de la graisse sous vide supplémentaire le long des bords de la gaine supérieure pour former une barrière (éviter l’évaporation moyenne). Remplir les réservoirs de la chambre avec un milieu indépendant du CO₂ (complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline/streptomycine ; volume : 5-8 mL par réservoir), insérer les ponts stérilisés d’agar-sel par les trous du couvercle de la boîte de Petri (avec une extrémité immergée dans le réservoir de médium de la chambre et l’autre dans les gobelets remplis de solution de Steinberg), et connecter les béchers à une alimentation via des électrodes Ag/AgCl (pour fournir un courant continu stable). Appliquez un champ électrique en courant continu (DCEF) de 2 V/cm pendant 4 heures, surveillez la tension toutes les 15 minutes à l’aide d’un multimètre numérique (ajustez si nécessaire pour maintenir une intensité de champ constante), et capturez des images en accéléré de la migration des cellules toutes les 5 minutes à 4 champs aléatoires à l’aide du logiciel (mode objectif 5x, champ clair).

REMARQUE : Lorsque vous utilisez un équipement électrique, assurez-vous que l’alimentation et les électrodes sont sèches et placées sur une surface non conductrice pour éviter les chocs électriques. Portez des gants isolants lors de la connexion ou de la déconnexion des électrodes, coupez l’alimentation avant d’ajuster le montage, et en cas de fuite de médium sur des composants électriques, coupez immédiatement l’alimentation et essuyez avec du papier absorbant imbibé d’éthanol à 75 %. Dans cette étude, en minimisant l’épaisseur de la chambre d’électrophorèse et en la maintenant à environ 1 mm, tout en réalisant des mesures de tension multipoints aux deux extrémités de la chambre, la variation de la force du champ a été contrôlée à 10 %. Dans ces conditions, on considère que la distribution du champ électrique dans la zone de culture est essentiellement uniforme^{de 26}.

Migration et analyse morphologique
Imagerie en direct : Pour les hADSC sous stimulation DCEF, importez les séquences d’images en accéléré (intervalles de 5 minutes) dans le logiciel ImageJ, suivez manuellement 100 cellules sur 4 champs indépendants du début (t=0) à la fin de la stimulation (t=4 h) via le plugin de suivi manuel, et calculez la vitesse moyenne de migration (μm/min) et la directionnalité (rapport D/T, où D = distance en ligne droite du début à la fin, T = longueur totale du chemin) en utilisant le plugin Chemotaxis Tool (ImageJ).

Suivi : Calculer les paramètres de migration suivants pour quantifier le comportement électrotactique : Orientation (Σcosθi/n, où θi est l’angle entre le vecteur de déplacement de la cellule et la direction du champ électrique (EF), et n est le nombre total de cellules suivies, allant de -1 à 1 avec des valeurs plus proches de 1 indiquant une migration plus forte dirigée par l’anode), Distance accumulée (longueur totale parcourue par chaque cellule pendant la période de stimulation, en μm), la vitesse de suivi (distance accumulée divisée par le temps de stimulation, en μm/h), et la distance euclidienne (déplacement en ligne droite de chaque cellule en μm, reflétant la migration nette).

Morphometrie : Après la stimulation DCEF, fixez les cellules avec 4 % de PFA à température ambiante pendant 20 minutes, lavez 3 fois avec 1 PBS, colorez le cytosquelette avec du Phaloïdin-TRITC (dilution 1:500 dans 1x PBS ; volume : 200 μL par puits pour des plaques à 24 puits) à température ambiante pendant 30 minutes (pour marquer la F-actine), et contre-coloration des noyaux avec DAPI (1 μg/mL dans 1x PBS ; volume : 100 μL par puits) pendant 5 minutes. Les cellules ont été imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence à un grossissement de 20x (avec des images représentatives à haute résolution capturées à 40x). Phalloidin-TRITC a été visualisé en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 540-555 nm et une longueur d’onde d’émission de 565-580 nm, tandis que DAPI a été imagé avec une longueur d’onde d’excitation de 358-405 nm et une longueur d’onde d’émission de 420-480 nm. Mesurez ensuite les paramètres morphologiques suivants dans ImageJ : Axe long (diamètre maximal de Feret, la plus longue distance entre deux points quelconques sur le périmètre de la cellule), Longueur verticale (largeur de la cellule perpendiculaire à l’axe long) et Verticalité (sinα, où α est l’angle entre l’axe long de la cellule et la direction de la EF, avec des valeurs plus élevées indiquant un alignement plus important avec la EF).

Tests de sénescence et de prolifération
Coloration SA-β-Gal : Utilisez un kit de détection de sénescence pour identifier les cellules sénescentes (cellules colorées en bleu) au microscope en champ clair (objectif 20x). Semez des hADSC de génération P3 dans des plaques à 6 puits à une densité de 2 x 10⁵ cellules par puits, cultivez jusqu’à 80 % de confluence, aspirez le milieu, lavez doucement les cellules 3 fois avec 1x PBS, ajoutez 1 mL de solution fixative (fournie dans le kit) par puits et incubez à température ambiante pendant 15 minutes, puis lavez les cellules 3 fois avec 1x PBS pour éliminer les résidus du fixateur après fixation, ajouter 0,5 mL de solution de travail de coloration SA-β gal (préparée en mélangeant 50 μL de substrat SA-β gal avec 450 μL de tampon de coloration selon le manuel du kit) par puits, sceller la plaque avec un film transparent (pour éviter l’évaporation), incuber toute la nuit (16-18 h) à 37 °C (éviter l’exposition au CO₂ , car cela modifie le pH et inhibe l’activité enzymatique), Capturez des images en champ clair de ≥10 champs aléatoires par puits (objectif 10x) le lendemain, comptez le nombre de cellules colorées en bleu (SA-β-gal⁺) et le nombre total de cellules, et calculez le pourcentage de cellules sénescentes comme (Nombre de cellules SA-β-gal⁺ / Nombre total de cellules) x 100.

Immunocoloration Ki67
Après la coloration SA-β-gal, aspirez la solution colorante, lavez les cellules 2x avec 1x PBS, perméabilisez les membranes cellulaires avec 0,1 % de Triton X-100 (préparé en 1 SGB ; 1 mL par puits) à température ambiante pendant 10 minutes, et bloquez la liaison des anticorps non spécifiques avec 5 % de BSA (dans 1 PBS ; 1 mL par puits) à température ambiante pendant 1 heure. Les cellules ont ensuite été incubées avec l’anticorps primaire Anti-Ki67 (dilution 1:200 dans 1 % de BSA/PBS ; 500 μL par puits) à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été lavées 3 fois avec 1 PBS (5 min chacune) pour retirer l’anticorps primaire non lié et incubées avec un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 488 488 (dilution 1:500 en 1 % de BSA/PBS ; 500 μL par puits) à température ambiante pendant 1 heure dans l’obscurité. Les cellules ont été lavées à nouveau 3 fois avec 1x PBS et contre-colorées avec DAPI (1 μg/mL dans 1x PBS ; 200 μL par puits) pendant 5 minutes. Les images de fluorescence ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence à un grossissement de 20x (avec des images représentatives à haute résolution acquises à 40x). Les cellules Ki67⁺ marquées par Alexa Fluor 488 ont été visualisées avec une longueur d’onde d’excitation de 485-495 nm et une longueur d’onde d’émission de 515-545 nm, tandis que les noyaux colorés par DAPI ont été imagés en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 358-405 nm et une longueur d’onde d’émission de 420-480 nm. Le pourcentage de cellules prolifératives a été calculé comme suit : (Nombre de cellules Ki67⁺ / Nombre de noyaux ^DAPI+ ) x 100.

REMARQUE : Lors de la manipulation d’anticorps primaires et secondaires, intervenir dans un BSC pour prévenir la contamination, aliquoter les anticorps en volumes à usage unique pour éviter les cycles répétés de congélation-dégel, et collecter les matériaux contaminés par anticorps (par exemple, pointes de pipette, plaques) dans un sac dédié à déchets biologiques autoclavable pour stérilisation par autoclavage avant leur élimination.

Analyse par électrotaxie dépendante de l’âge des hADSC : Utilisez une alimentation à impulsion continue pour générer des DCEF de trois intensités : 0 mV/mm (contrôle), 100 mV/mm et 200 mV/mm, employez une station de travail à cellules vives pour observer et enregistrer la migration cellulaire en temps réel, et pour chaque intensité de FE, comparez quantitativement la capacité de migration anodale des hADSC de donneuses jeunes et âgées en mesurant la distance accumulée, Distance euclidienne, vitesse de suivi et direction, avec trois réplications biologiques indépendantes par groupe pour garantir la fiabilité des résultats. Les paramètres de migration électrotactique ont été quantifiés à l’aide des plugins Manual Tracking et Chemotaxis Tool dans ImageJ (NIH). Les cellules individuelles ont été suivies manuellement pendant toute la période de stimulation de 4 heures, et les paramètres suivants ont été calculés selon les méthodes standard : Distance accumulée : la longueur totale du chemin parcourue par chaque cellule pendant la période d’enregistrement. Distance euclidienne : la distance en ligne droite entre les positions de départ et de fin de la cellule. Vitesse de la voie : distance accumulée divisée par le temps total de suivi (μm/h). Orientation : calculée comme le cosinus moyen de l’angle (θ) entre chaque vecteur de déplacement et le vecteur champ électrique (les valeurs varient de -1 à 1 ; les valeurs proches de 1 indiquent une forte migration anodale).

Séquençage de l’ARN
Extraction et préparation de l’ARN : Stériliser un récipient rempli de glace sous lumière UV pendant 15 minutes (pour maintenir la stabilité de l’ARN) et effectuer toutes les étapes suivantes sur la glace. Transférez des lames en verre ensemencées dans hADSC (1 cm x 2 cm) de la chambre électrotaxisée vers une boîte de Petri stérile, lavez les cellules 3 fois avec 3 mL de 1x PBS glacé (ajoutez doucement du PBS, agitez légèrement et aspirez complètement pour éliminer le milieu résiduel), puis ajoutez 1 mL de réactif TRIzol à chaque lame et incubez à température ambiante pendant 20 minutes pour lyser complètement les cellules (assurez-vous que le lysat couvre toute la couche cellulaire). Transférer le lysat dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL sans RNase, ajouter 0,2 mL de chloroforme, faire tourner vigoureusement pendant 15 s pour induire la séparation de phase, incuber le tube sur la glace pendant 15 minutes, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C. Cela sépare le lysat en trois couches : la phase aqueuse supérieure contenant de l’ARN, la couche protéique moyenne et la phase organique inférieure. Transférer délicatement la phase aqueuse supérieure (≈ 0,5 mL) dans un nouveau tube sans RNase (éviter de toucher la couche intermédiaire), ajouter 0,5 mL d’isopropanol, faire un vortex délicat pour précipiter l’ARN, incuber sur glace pendant 10 minutes, puis centrifuger à 12 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C ; L’ARN forme un pellet blanc au fond du tube. Écartez le surnageant, répétez une fois la précipitation d’isopropanol pour améliorer la pureté de l’ARN, aspirez complètement le surnageant, séchez à l’air libre la pellete d’ARN dans un BSC à température ambiante pendant 5 à 10 minutes (ne pas trop sécher, car cela réduit la solubilité), resuspendez la pellete d’ARN dans 30 μL d’eau traitée au DEPC, incubez à 55 °C pendant 10 minutes pour faciliter la dissolution, quantifier la pureté de l’ARN en mesurant le rapport A260/A280 (cible : 1,8-2,0) à l’aide d’un spectrophotomètre, évaluer l’intégrité de l’ARN à l’aide d’une nano-puce ARN ; cible : Numéro d’intégrité de l’ARN [RIN] > 8,0, et stocker des échantillons d’ARN qualifiés à -80 °C jusqu’au séquençage.

ATTENTION : Le trizol et le chloroforme sont toxiques, volatils et cancérigènes, donc manipulez-les exclusivement dans une hotte à fumée en portant des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité — évitez l’inhalation de vapeurs, essuyez avec un essuie-tout et rincez avec du savon et de l’eau pendant 10 minutes si c’est renversé sur la peau, et ne les mélangez pas à de l’eau de Javel ou d’autres agents oxydants (car cela peut produire des gaz toxiques). Pour l’élimination des déchets dangereux liés à l’extraction d’ARN, collectez des mélanges, des surnatants d’isopropanol et des tubes contaminés dans un contenant scellé et chimiquement résistant, marqué comme des déchets d’ARN (ne pas mélanger avec des déchets aqueux ou biologiques) et éliminez les protocoles institutionnels de déchets dangereux, en veillant à ne pas se déverser dans les canalisations.

Prétraitement des données et contrôle qualité : Préparer des bibliothèques de séquençage à l’aide du kit de préparation de la bibliothèque VAHTS mRNA-seq selon le protocole du fabricant — enrichir l’ARNm à l’aide de billes magnétiques oligo(dT), fragmenter l’ARNm en fragments de 200 à 300 pb en cations divalents, synthétiser l’ADNc de première brin à l’aide d’hexamères aléatoires suivis d’ADNc de seconde brin, effectuer la réparation de l’extrémité, ajouter des queues A, ligater des adaptateurs de séquençage, amplifier les bibliothèques par PCR, et purifier avec des billes. Séquencez les bibliothèques sur une plateforme de séquençage (lectures jumelées à 150 pb), générant environ 50 millions de lectures brutes par échantillon, puis utilisez un logiciel pour supprimer les lectures de faible qualité (retirez les lectures avec >50 % de bases ayant un score de qualité Phred <20) et des séquences adaptateurs, conservant environ 48 millions de lectures propres par échantillon (Q30 > 90 %) pour une analyse en aval après le coupage.

Analyse bioinformatique : Aligner les lectures nettes au génome de référence humain (GRCh38/hg38) en utilisant le logiciel Hisat2 v2.2.1 et enregistrer les résultats d’alignement sous forme de fichiers BAM, utiliser le logiciel htseq-count v0.13.5 pour compter le nombre de lectures mappées à chaque gène (basé sur les annotations génétiques Ensembl), normaliser les données de nombre de gènes en utilisant la fonction estimateSizeFactors du package DESeq (2012) R pour éliminer les effets de lots et les différences de profondeur de séquençage, et effectuer une analyse d’expression différentielle à l’aide de la fonction nbinomTest (package DESeq), sélectionnant des gènes exprimés différemment (DEG) en utilisant des seuils de changement de pli (FC) > 2 et une valeur p ajustée (padj) < 0,05. Réaliser une analyse d’enrichissement par Ontologie Génique (GO) (processus biologique, fonction moléculaire, composante cellulaire) et une analyse d’enrichissement des voies par l’Encyclopédie des Gènes et Génomes de Kyoto (KEGG) sur les DEG utilisant le package clusterProfiler v4.0 R, en se concentrant sur les enrichissements liés à la migration cellulaire (par exemple, adhésion cellulaire, migration cellulaire), au transport d’ions (par exemple, transport transmembranaire d’ions sodium) et aux voies de signalisation (par exemple, voie de signalisation PI3K-Akt). Effectuer un regroupement hiérarchique non supervisé sur les DEG à l’aide du package pheatmap v1.0.12 R et visualiser les schémas d’expression génique à travers les échantillons avec une carte thermique (scores z à l’échelle des lignes).

Analyse statistique : Toutes les données expérimentales sont présentées comme Moyenne ± Erreur Standard de la Moyenne (Moyenne ± SEM), avec au moins 3 réplications biologiques indépendantes par groupe (n ≥ 3). Utilisez le test t de Student pour comparer les différences entre deux groupes (par exemple, jeunes et donneurs âgés) et l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test post-hoc de Tukey pour comparer les différences entre trois groupes ou plus (par exemple, différentes intensités de FE), en réalisant des analyses statistiques avec le logiciel SPSS 23.0 et en définissant la signification statistique comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001.

Results

L’application des champs électriques guide la migration directionnelle des hADSC et améliore leur capacité migratoire
Les hADSC extraits présentaient des marqueurs typiques de surface des cellules souches mésenchymateuses (par exemple, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) et possédaient un potentiel de différenciation trilineage (adipogénique, ostéogénique, chondrogénique ; Figure 2A), répondant aux critères standards d’identification du hADSC. Nous avons appliqué des champs él...

Discussion

Au début du processus de réparation et de régénération des lésions tissulaires, les champs électriques apparaissent comme l’un des premiers signes physiques établis dans le microenvironnement. Leurs propriétés directionnelles sont spatiotemporellement corrélées au recrutement cellulaire vers le site^{de lésion 27}. Les champs électriques endogènes proviennent du potentiel transépithélial généré par le transport d’ions polarisés dans les tissus épithéliaux. Lorsque la...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4° ; C/-20° ; C/-80 & degré C Réfrigérateur	Haier, Chine	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
Agar	HUSHI, Chine	10000561
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent Technologies, États-Unis	G2939BA
Alizarin Red S  ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	A5533
Armoire de biosécurité   ;	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	1300 A2 1,5 m
CaNO3· ; 4H2O	HUSHI, Chine	10013960
Centrifugeuse	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	X4R Pro & nbsp ;
Incubateur CO2	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	Forma Steri-Cycle 3307  ;
Colagnase de type IV	Biosharp, Chine & nbsp ;	BS076
Confocal Microscope	ZEISS, Allemagne	LSM 900
Alimentation à impulsions DC   ;	Daedo Powertronics, Corée	DDP-500
Dexaméthasone	Sigma-Aldrich, États-Unis	D4902
Multimètre numérique	Fluke, États-Unis	FLUKE-175
DMSO	Sigma-Aldrich, États-Unis	D2650
Balance électronique & nbsp ;	Sartorius, Allemagne & nbsp ;	BSA224S-CW
FBS  ;	Gibco, États-Unis	10270-106
Cytomètre en flux	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	A24858
IBMX (1-méthyl-3-isobutylxanthine)	Sigma-Aldrich, États-Unis	I7018
Indométhacine & nbsp ;   ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	I7378
Insuline	Sigma-Aldrich, États-Unis	I5500 & nbsp ;   ;
Microscope inversé	ZEISS, Allemagne	Axio Observer 7 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich, États-Unis	I3146
KCl	HUSHI, Chine	10019318
KH2PO4	HUSHI, Chine	10019320
Acide linoléique & nbsp ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	L1376
Station de télévision en direct	Live Cell Instrument, Corée	Chamlide TC  ;
DMEM à faible taux de glucose	Gibco, États-Unis	11885084
MgSO4· ; 7H2O  ;	HUSHI, Chine	10019322
Na2HPO4· ; 12H2O	HUSHI, Chine	10019324
NaCl	HUSHI, Chine	10019318
Spectrophotomètre NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	ND-2000
Oil Red O	Sigma-Aldrich, États-Unis	O0625
Pénicilline/Streptomycine	Gibco, États-Unis	15140122
Pipettes	Eppendorf, Allemagne & nbsp ;	4920000061
SYBR Premix EX Taq	Takara, Chine & nbsp ;	RR420A
Toluidine Blue O  ;   ;   ;   ;   ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	T3260
Tris	HUSHI, Chine	10019326
Trizol	Beyotime, Chine	R0016
Trypsine-EDTA	Gibco, États-Unis	25200056
Microscope vertical	ZEISS, Allemagne	415200-0000-000  ;
Graisse sous vide	DOW CORNING, États-Unis	1597418
Vitamine C & nbsp ;   ;   ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	A4544
Système de purification de l’eau	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	; GenPure xCAD Plus UF-TOC
&bêta ;-Glycérphosphate  ;	Sigma-Aldrich, États-Unis	G9422