Validation du système de pression hyperbare avec anesthésie au xénon pour Drosophila melanogaster

Résumé

Des gaz qui semblent inoffensifs à la pression atmosphérique peuvent induire des comportements comme la narcose dans des conditions hyperbariques. Les chambres à pression hyperbare conventionnelles sont coûteuses et demandent beaucoup de main-d’œuvre. Cette étude propose une méthode simple et peu coûteuse pour examiner les effets du xénon sur Drosophila melanogaster à des pressions modérées inférieures à 4 atm.

Résumé

Dans des conditions hyperbares, les concentrations élevées des gaz ambiants peuvent déclencher une gamme de réponses comportementales chez divers animaux. Une part importante de ces comportements représente des changements dans les états cognitifs encore mal compris. Un exemple notable est l’anesthésie générale. L’effet comportemental de plusieurs gaz en conditions hyperbares en anesthésie générale, ou narcose, est une étude scientifique de longue date, malgré l’utilisation extrêmement fréquente de ces médicaments en médecine. Le xénon, classé comme un gaz noble et un agent anesthésique, est considéré comme l’une des options les plus sûres pour l’anesthésie générale chez l’humain. Cependant, il n’anesthésie pas les mouches dans des conditions normobaires. Ici, nous avons mis en place un dispositif expérimental simple qui augmente la pression ambiante jusqu’à ~3 atm et permet l’étude de l’anesthésie au xénon chez l’un des organismes modèles les plus populaires, Drosophila melanogaster. Cette configuration expérimentale facilite également l’étude d’autres gaz et de leur effet dans des conditions hyperbariques.

Introduction

Les deux extrêmes des effets comportementaux observés chez les animaux dans des conditions hyperbares sont la convulsion par oxygène et la narcose due à^{l’azote 1,2}. Curieusement, des troubles cognitifs tels que les hallucinations et les troubles de la mémoire ont été rapportés avec de l’azote et de l’hydrogène à des valeurs de pression antérieures au niveau d’inconscience ^3,4. Une anesthésie induite par le xénon, le krypton et le protoxyde d’azote en conditions hyperbares a été signalée avant ^5,6.

L’anesthésie générale est à la fois une pierre angulaire de la médecine et un phénomène d’un intérêt scientifique considérable. Malgré son usage long et généralisé, notre compréhension reste limitée de la manière dont certains produits chimiques induisent l’absence temporaire de mouvement, de mémoire, de douleur et^{de conscience 7}. Le Xenon, étant un gaz noble, pouvait être désigné comme le membre le plus particulier parmi les agents anesthésiques. Il est considéré comme une option sûre pour l’anesthésie, offrant une induction et une récupération rapides, des perturbations physiologiques minimales, et seulement des effets secondaires légers tels que des nausées^{postopératoires 8,9}.

Compte tenu de l’importance médicale de l’anesthésie et des propriétés chimiques inhabituelles du xénon, cette étude vise à étudier l’anesthésie induite par le xénon en utilisant le modèle animal simple Drosophila melanogaster. Diverses études de recherche ont été menées avec des mouches à fruits pour étudier l’anesthésie générale, avec de nombreuses configurations proposées et l’utilisation de divers anesthésiques^volatils 10,11,12,13. Cependant, aucun cas d’anesthésie au xénon n’a été signalé chez Drosophila. Dans des conditions normobaires, le xénon n’induit pas d’anesthésie chez Drosophila melanogaster, communément appelée mouches à fruits. Pour répondre à cette limitation, cette étude propose un système hyperbare permettant une manipulation contrôlée de la pression ambiante entre 1 atm et environ 4 atm. Plusieurs études ont été menées utilisant des chambres hyperbare pour répondre à des curiosités similaires^14,15. Cependant, la plupart des chambres hyperbare commerciales bénéficient de matériaux robustes et étanches, mais elles ont un volume élevé (~3 L) et sont systématiquement complexes à exploiter et coûteuses. Au contraire, la méthode décrite dans cet article est simple et peu coûteuse, permettant d’explorer les effets de divers gaz et de leurs combinaisons. Il offre un environnement adapté aux petits modèles animaux comme D. melanogaster et C. elegans.

Protocole

1. Préparation de Drosophila melanogaster

1. Prélever 20 mouches femelles et 20 mâles âgées de 1 à 3 jours pour chaque expérience en utilisant du_CO2.
2. Reposez les mouches sélectionnées dans un flacon avec de la nourriture pendant au moins 24 heures avant l’expérience à une température de ~22 °C.

2. Administration anesthésique

1. Transférez les gaz de leurs bouteilles de gaz dans les conteneurs vers les sacs de gaz étanches pour un usage expérimental. Pour le transfert direct de gaz du récipient aux sacs, utilisez des tubes en silicone.
2. Fixez un tube en silicone de 25 mm (3,4 mm de diamètre) à la seringue en polypropylène. Ensuite, connectez la seringue en polypropylène aux sacs de gaz et au robinet à trois voies. Pour plus de clarté, la seringue en polypropylène sera désignée comme seringue #1 dans le reste du texte.

3. Assemblage de la configuration hyperbare (Figure 1)

1. Placez la table lumineuse LED en orientation paysage sur la table (long bord horizontal à la surface de la table).
2. Placez la pompe d’injection à côté d’un des côtés courts de la table lumineuse LED, afin de garantir que l’orientation de la pompe permette à la seringue expérimentale de s’étendre au-dessus du contre-jour.
3. Localisez la caméra au-dessus de l’installation pour couvrir la région où se trouve la seringue expérimentale.
4. Coupez un tube en silicium de 75 mm de long (diamètre de 3,4 mm). Reliez le robinet à trois voies au manomètre en utilisant le tube en silicone de la buse centrale.
5. Utilisez des colliers à ressort de tuyau sur la buse sur le côté du manomètre et le robinet à trois voies pour garantir que le tube est bien serré.
6. À l’aide du bouton marqué par une double flèche dans l’unité de commande de la pompe d’injection, réglez la vitesse à 80 mm/m et la durée à 38 s pour la compression ou la décompression automatique du piston.

4. Procédure pour l’anesthésie au xénon

1. Limitez la lumière ambiante dans la salle d’expérimentation, allumez la table lumineuse LED et réglez la luminosité au niveau 3. Cela aide à augmenter le contraste dans la vidéo.
2. Retirez le plongeon de la seringue en polycarbonate. Insérez une petite quantité de coton dans le téton de la seringue pour empêcher les mouches de s’échapper. Pour plus de clarté, la seringue en polycarbonate sera désignée sous le nom de seringue #2 dans le reste du texte.
3. Pour transférer 40 mouches de leur flacon à la seringue #2, retirez d’abord le couvercle de la fiole et placez le fon de la seringue verticalement sur le flacon. La bride du canon doit fusionner avec le dessus du flacon pour permettre aux mouches d’entrer dans le fût de la seringue. Tournez la structure à 180° et tapez. Cela placera les mouches au fond du canon de la seringue. Remets le plongeon en place. Placez la seringue avec les mouches à l’intérieur de la pompe d’injection.
4. Orientez les marques du canon de la seringue sur le côté pour mieux voir les mouches du point de vue de la caméra.
5. Fixez la seringue du canon et de la tête du plongeur à la pompe d’injection à l’aide des vis réglables.
6. Retirez le coton de la pointe de la seringue #2 et connectez-le avec le robinet à trois voies.
7. Commence l’enregistrement vidéo. Allume le manomètre. Tournez le robinet d’arrêt pour connecter le manomètre à la seringue #2 et confirmez la pression de 0 kPa dans la seringue à l’aide du manomètre.
8. Tournez le robinet à trois voies en position latérale pour permettre l’échange d’air avec la seringue avant l’expérience.
9. Déplacer le piston de la marque des 20 à 2 mL via l’option de commande manuelle de la pompe d’injection, conçue pour faciliter l’option la plus rapide.
10. Aspirez 18 mL de gaz anesthésiant du sac à gaz vers la seringue #1. Connectez la seringue #1 avec le tap à trois voies provenant de la prise latérale de verrouillage du Luer. Pour évaluer le volume correct, 18 mL de gaz anesthésique dans un mélange total de 20 mL donneraient 90 % du pourcentage de gaz. Cela peut être modifié en fonction du pourcentage final de gaz souhaité.
11. Replacez le piston vers la conduite de 20 mL via l’option manuelle de la pompe d’injection.
12. Tournez le robinet d’arrêt pour relier le manomètre à la seringue #2. Habituellement, le manomètre affiche une pression de ~-3 kPa après le remplissage de l’anesthésie.
13. Déplacez automatiquement le piston, avec des réglages de vitesse et de temps à 80 mm/s et 38 s. La pompe devrait atteindre les 5 mL de barres du baril en 38 s. Lorsque le plongeur s’arrête, la pression maximale doit être de ~200 kPa.
14. Laissez le plongeur à la position 5 mL pendant 20 secondes. Notez la pression de pic.
15. Tapotez la seringue pour déloger les mouches accrochées au piston, les faisant s’immobiliser au fond.
16. Commencez la décompression automatique à la fin de 20 s. Arrêtez l’expérience lorsque le ventouse sera de retour à la barre de 20 mL. Notez la pression finale pour le contrôle de fuite.

5. Analyse des données

REMARQUE : Dans cette expérience, l’émergence anesthésique a été utilisée comme point final. Les mouvements de la mouche étaient quantifiés dès le début de la décompression du plongeon. Deux méthodes d’analyse différentes ont été développées : l’analyse des pixels et le suivi de la mouche. Chaque méthode d’analyse avait ses inconvénients, qui sont communiqués dans la discussion.

1. Analyse des pixels
   1. Utilisez ScreenFlow pour monter les vidéos. Recadrez chaque vidéo selon la région d’intérêt (ROI), c’est-à-dire les premiers 5 mL du canon de la seringue.
   2. Réduisez la vidéo aux 20 premières secondes après la décompression à la seringue. Exportez les vidéos éditées sous forme de GIFs. Duplique le GIF.
   3. En utilisant Fiji, retirez la première image d’un doublon et retirez la dernière image de l’autre doublon. Pour cela, sélectionnez Image > Montage vidéo > Supprimer les images.
   4. Faites en sorte que chaque GIF binaire aux Fidji apparaisse comme des mouches blanches sur un fond noir. Pour cela, sélectionnez Processus > Binaire > Rendre binaire.
   5. Ouvre les deux GIFs aux Fidji. Calculez la différence de pixels entre les GIFs. Pour cela, sélectionnez Processeur > Image. Cette opération créera un GIF à différence de pixels.
   6. Sauvegardez le GIF de différence de pixels. Analysez la particule dans les différents GIFs. Pour cela, sélectionnez Analyser > Analyser des particules aux Fidji. Ajustez les seuils de taille de pixel pour augmenter le rapport signal/bruit.
   7. Après analyse des particules, Fiji produit un CSV avec des différences de pixels par image. Garde le CSV. Les données CSV peuvent être utilisées pour tracer le mouvement par image. Utilisez le mouvement cumulatif à travers les images pour attribuer des différences statistiques entre les expériences.
2. Suivi de la mouche
   REMARQUE : Pour la méthode de suivi des mouches, la technologie IA a été utilisée pour détecter et suivre le centre de masse de chaque mouche dans les vidéos de l’expérience. Deux modèles ont été combinés pour cela : YOLO (You Only Look Once) pour la détection et MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) pour le suivi. Les modèles ont été réalisés sur Google Colab à l’aide d’un GPU Tesla T4.
   1. Installez la bibliothèque YOLO d’Ultralytics dans Colab, puis chargez le modèle yolo11n.pt. Utilisez CVAT (Computer Vision Annotation Tool) pour annoter les mouches dans les images extraites des vidéos, puis exportez le jeu de données au format YOLO pour l’entraînement. Les procédures détaillées d’installation et de formation sont décrites dans le dépôt en ligne.
   2. Installez le dépôt MASA dans Google Colab et intégrez un filtre de Kalman pour effectuer le suivi d’objets sur des trames consécutives. Intégrer le modèle de détection YOLO entraîné avec le cadre de suivi MASA.
   3. Utilisez FixTrack pour revoir manuellement les pistes générées par le pipeline combiné MASA+YOLO. Identifier et fusionner des traces fragmentées incorrectement ou corriger des inadéquations d’identité pour obtenir des trajectoires continues pour des mouches individuelles. Les procédures détaillées d’installation et de formation sont décrites dans le dépôt FixTrack.

Résultats

La méthode décrite dans cet article permet de surveiller à la fois le timing et l’étendue de l’activité locomotrice chez les mouches dans des conditions hyperbariques. Cette configuration permet à des gaz comme le xénon et le protoxyde d’azote, qui n’ont pas de propriétés anesthésiques dans des conditions normales, de produire l’anesthésie chez Drosophila melanogaster. Pour le démontrer, nous avons expérimenté différentes concentrations de xénon et d’air. Nous avons commencé à é...

Discussion

Cette configuration simple et peu coûteuse rend les tests comportementaux hyperbares chez Drosophila largement accessibles, permettant des expériences rapides et reproductibles sans récipients de pression spécialisés. Cependant, cela présente quelques limites. L’un de ses compromis importants est la pression maximale plus faible par rapport aux installations existantes. La pression la plus élevée que nous pouvons induire avec cette configuration est de ~4 atm, alors que les vase...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sacs à gaz hermétiques (0,5 L)	Techinstro	7440440
Caméra	Apple	iPhone 15
Colliers de serrage à ressort à double fil	Carte des sources	a24120200ux2109
Mélange alimentaire pour Drosophila	Élevage avancé	DM900
Drosophila melanogaster	Darwin Biological	LZ-210
Tuyau d’injection	Aitoserlea	B09M8G5BQ8
Table lumineuse LED	Lairi	M1-3878368
Manomètre	Dwyeromega	477AV-8
Robinet d’arrêt d’écrou de compression à trois voies en métal   ;	Sigma Aldrich & nbsp ;	Z182184
Seringue en polycarbonate (20 mL)	DMC Medical	FD-1031NS
Syringue polypropylène (20 mL)	BD	301031
Tubes en silicone
Gaz xénon	Gaz industriels de Chengdu Taiyu