Transformation efficace basée sur la régénération médiée par Agrobacterium d’une espèce amphibie asexuée de Brassicacées, Rorippa aquatica

Résumé

Nous présentons un protocole efficace et optimisé pour la transformation médiée par Agrobacterium d’une espèce amphibie asexuée de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sans procédures de culture tissulaire stérile gourmands en ressources. L’utilisation d’un marqueur de transformation visuelle et d’un pipeline de régénération de pousses a généré avec succès des transformants quasi clonaux, faisant ainsi progresser les études futures sur l’adaptation des plantes à l’environnement sous-marin.

Résumé

La transformation génétique stable des plantes médiée par Agrobacterium tumefaciens a été un outil puissant pour la recherche fondamentale en biologie végétale ainsi que pour les biotechnologies végétales ayant un impact direct sur l’amélioration des cultures. Des pipelines de transformation simples et efficaces, tels que la méthode de plongée florale pour Arabidopsis, ont considérablement fait progresser les analyses à grande échelle de la fonction génique. Cependant, un tel pipeline ne peut pas être appliqué aux espèces végétales qui ne se reproduisent pas sexuellement. Rorippa aquatica est une espèce modèle amphibie émergente de Brassicaceae présentant une hétérophylité et des changements drastiques de la forme des feuilles et des plantes dans des environnements terrestres ou sous-marins. R. aquatica se propage exclusivement par voie végétative. Le pipeline optimisé présenté ici permet une transformation efficace et fiable de R. aquatica médiée par Agrobacterium, sans nécessiter de culture tissulaire stérile. Les boutures foliaires sont brièvement immergées dans Agrobacterium suspendu dans un tampon de transformation contenant un vecteur binaire exprimant un marqueur visuel, RUBY, sous le promoteur constitutif. Par la suite, les inoculants sont cultivés sur un papier filtre imbibé d’eau dans une chambre de croissance. Ensuite, les plantes régénératrices avec une pigmentation rouge rubis sont séparées et rempotées dans la terre. Ces premiers régénérateurs T1 (R1-T1) expriment des secteurs rouges. En coupant le secteur rouge et en répétant les étapes de régénération, un grand nombre de frères transgéniques sont produits lors de la prochaine génération R2-T1, dont certains sont presque uniformément rouges ; indicative de l’expression RUBY. Ce pipeline de transformation simple peut être adopté pour R. aquatica et éventuellement d’autres espèces végétales à propagation végétative afin d’introduire des gènes d’intérêt pour étudier leurs fonctions dans l’adaptation à la terre versus la Environnements aquatiques.

Introduction

La transformation génétique stable, c’est-à-dire l’introduction et l’expression de gènes d’intérêt pour une espèce végétale donnée, est centrale pour la science et la biotechnologie végétales fondamentales. La transformation médiée par Agrobacterium tumefaciens est de loin le moyen de génie génétique végétal le plus utilisé pour sa génération fiable de transformants^{stables 1}. Le développement d’un système vectoriel binaire, dans lequel le vecteur de clonage de T-ADN et le plasmide auxiliaire de vir désarmé sont séparés en deux entités, a révolutionné la transformation médiée par Agrobacterium ^1,2. Pour la plante modèle Arabidopsis thaliana, une procédure simple et économique de transformation par trempage floral a permis la génération à haut débit de transformants clonaux (hémizygotes) pour la génétique fonctionnelle et la génomique ^3,4. Cependant, une telle approche n’est pas envisageable pour les espèces végétales qui se propagent principalement ou exclusivement de façon végétative.

Les plantes amphibies présentent une capacité unique à prospérer aussi bien dans les environnements terrestres qu’aquatiques^{(sous-marins) 5}. Rorippa aquatica est une espèce amphibie de Brassicaceae qui présente une hétérophilie. Dans un environnement terrestre, R. aquatica développe des feuilles rondes avec un épiderme composé de cellules de chaussée et de stomates. En revanche, leurs feuilles aquatiques présentent des morphologies bien adaptées à l’environnement sous-marin : feuilles très disséquées en forme d’aiguilles, avec un épiderme dépourvu de cellules cuticulées du pavage^{ou de stomates 6,7}. Phylogénétiquement, R. aquatica est étroitement apparentée à Arabidopsis thaliana ; toutes deux appartiennent à la même famille,^{Brassicaceae 6}. Avec la disponibilité de données de séquences du génome complet et la forte conservation des séquences des gènes codants entre R. aquatica et A. thaliana, R. aquatica sert de plante modèle amphibie émergente pour étudier la base moléculaire de l’adaptation à la terre et^{à l’eau 8}. En effet, des études physiologiques et d’expression génique récentes suggèrent que le recâblage des voies lumineuses et hormonales est crucial pour l’hétérophyllie de R. aquatica ^7,8.

Pour tester les fonctions moléculaires des gènes et voies candidats, la transformation génétique est absolument essentielle. R. aquatica se propage de façon végétative dans la^{nature 8,9}. Par conséquent, contrairement à A. thaliana, la transformation par trempage floral d’Agrobacterium ne peut pas être appliquée à R. aquatica. Fait remarquable, R. aquatica régénère facilement des plantes entières à partir de feuilles détachées sans supplémentation exogène en^{phytohormones 10}. En quelques jours seulement après le détachement des segments de la feuille, la prolifération cellulaire devient active dans le tissu vasculaire à l’extrémité proximale de la surface de la coupe. En une semaine, racines et pousses se régénèrent toutes deux, produisant finalement de jeunes plants (plants rosettes). Les plantes individuelles peuvent être séparées et poussées jusqu’à leur^{maturité 10}. Ce processus spontané de régénération complète des plantes peut être facilement utilisé pour une transformation génétique de R. aquatica.

Le pipeline optimisé rapporté ici permet une transformation efficace et fiable de R. aquatica par Agrobacterium en exploitant sa capacité à la régénération spontanée après le décollement des feuilles. Pour une sélection facile de transformants sans nécessiter de coûteux processus de culture stériles, un marqueur de sélection visuelle non invasif a été adopté, RUBY, un vecteur synthétique avec trois gènes menant à la biosynthèse de la bétalaine¹¹. En optimisant les conditions de culture bactérienne, les étapes d’inoculation et les processus d’incubation des boutures de feuilles pour la régénération, des plantes transgéniques fiables de R. aquatica ont été produites jusqu’à maturité. Presque tous les transformants initiaux de la génération R1-T1 présentent des secteurs rouges, indiquant qu’ils sont hétérogènes, des mosaïques génétiques. En supprimant les secteurs de feuilles rouges RUBY+ et en répétant les processus de régénération, la génération de transformants R. aquatica entièrement rouges, donc presque clonales, est possible lors de la génération R2-T1 suivante. Ce pipeline de transformation peut être facilement appliqué pour introduire ou exprimer des gènes étrangers d’intérêt chez R. aquatica, accélérant ainsi les études génétiques moléculaires de l’hétérophyllie et de l’adaptation des plantes à des environnements extrêmes.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des matières végétales

1. Écartez et coupez les feuilles matures en bonne santé entièrement lobulées en morceaux de 1 à 2 cm provenant de plantes mères matures âgées de deux mois (Figure 1A).
2. Tapisser un plateau de propagation des plantes (plateaux de nidification permanente de 20 x 30 cm) de deux couches d’essuie-tout pliés autoclavés. Saturez les essuie-tout avec de l’eau stérile, afin qu’il y ait une fine couche d’eau par-dessus.
3. Placez les boutures côté adaxial vers le haut, avec un espace autour de chaque explant pour éviter les chevauchements (Figure 1A).
4. Vaporisez légèrement les boutures et couvrez bien le plateau avec du film plastique.
5. Placez les gouttières dans la chambre de croissance à 25 °C-28 °C avec 16 heures de lumière et 8 heures de période d’obscurité sous conditions humides et une intensité lumineuse de 50 μmol/^{m 2}/s.
6. Inspectez et maintenez des plateaux de propagation propres et humides 2 à 3 fois par semaine.
   1. Ajoutez de l’eau stérile pour maintenir une fine couche d’eau sur les essuie-tout saturés.
   2. Remplacez le film plastique qui a perdu son adhérence et/ou montre des signes de contamination (par exemple, turbidité visible de l’eau).
7. À l’aide de micro-ciseaux ou de scalpel, on excise soigneusement des plants individuels en rosette en bonne santé régénérés qui portent à la fois une pousse et une racine entre 14 et 21 jours après l’établissement (Figure 1B).
   REMARQUE : Une excision soigneuse est nécessaire pour obtenir une seule plante rosette avec la pousse et la racine intactes. Les plants de la rosette de Rorippa prolifèrent densément le long de l’intersection de l’explante foliaire et de la nervure centrale, compliquant l’identification des plants individuels de la rosette. La pousse d’une plante rosette pousse de façon adaxique, tandis que les racines poussent sous la surface de la feuille, compliquant la visibilité de l’ensemble de la plante rosette (Figure 1B).
8. Transplantez des plants à rosette individuels dans des pots contenant un substrat humide (ratio 2:1:1 de terreau : Vermilculite : Perlite) complété par un engrais à libération lente (Figure 1B).
9. De l’eau du robinet amendée avec 0,25 g/L d’engrais NPK granulé et couvre d’un dôme d’humidité ou d’un film plastique pour maintenir des conditions humides.
10. Placez les plateaux dans la chambre de croissance dans des conditions préalables (25 °C-28 °C avec 16 heures de lumière et 8 heures de période d’obscurité sous conditions humides et une intensité lumineuse de 50 μmol/^{m 2}/s)
    REMARQUE : Il est essentiel de préserver les conditions humides du sol. Maintenez une fine couche d’eau sous les transplantations en pot.

2. Cultures d’agrobactéries pour la transformation

1. La souche Streak A. tumefaciens GV3101 abritant le plasmide Ti-plasmide pMP90 (pTiC58DT-ADN) qui contient le vecteur RUBY sur une plaque de 30 mL contenant de la rifampicine (0,03 mg/mL), de la gentamycine (0,025 mg/mL) et de la spectinomycine (0,05 mg/mL) et se développe à 28° C pendant 48 à 72 h jusqu’à ce que des colonies uniques apparaissent.
2. Sélectionnez une seule colonie et inoculez 5 mL de bouillon MG/L amendé avec de la biotine et des antibiotiques sélectifs préalables (Tableau 1), puis incubez dans un shaker rotatif à 28 °C à 200 tr/min pendant 16 heures.
3. Transférez l’inoculum dans une fiole conique avec un bouillon de 250 MG/L et incubez dans un shaker rotatif à 28 °C à 200 tr/min pendant 16 heures.
4. Assurez-vous que la culture liquide a un OD minimum_{de 600} de 1,2 à l’aide d’un spectrophotomètre. Pelletez les bactéries par centrifugation à 3396 x g pendant 10 minutes à température ambiante (environ 22 °C). Ajustez le bouillon d’inoculation avec 200 μM d’acétosyringone (AS).
   REMARQUE : Les aliquotes d’AS filtre-stérile sont préparées en DMSO à une concentration de travail de 100 mM et stockées à -20 °C. Le bouillon d’inocule doit être préparé frais. L’AS est ajouté directement avant l’étape de centrifugation pour minimiser la dégradation. Les descriptions et composants des médias sont listés dans le Tableau 1.
5. En évitant la perturbation directe du pellet bactérien, jetez le surnageant et remettez le pellet dans un bouillon d’inocule.
6. Faites tourner la fiole à la main afin que la solution ait un OD₆₀₀ d’environ 0,8.
7. Incubez l’inoculum sur un shaker à 90 tr/min pendant 2,5 h à température ambiante (environ 22 °C).
8. Enregistrer les conditions pertinentes (Culture et Inoculum OD₆₀₀, concentration d’AS, quantité de tensioactif, période d’inoculation, et nombre d’unités expérimentales nécessaires à l’efficacité de la transformation.
   REMARQUE : Des concentrations optimales de bactéries et de cultures en resuspension sont essentielles pour maximiser l’efficacité de la transformation tout en minimisant la croissance bactérienne excessive. Avant centrifugation, assurez-vous que la culture bactérienne a un OD600 minimum de 1,2 ; resuspendre à un inocule OD600 de 0,8. Les amendements apportés au bouillon d’induction sont optimisés pour améliorer la transformation sans compromettre la viabilité du régénérateur. Les concentrations recommandées sont de 150 à 225 μM pour le SA et de 0,005 % pour le tensioactif.
   ATTENTION : Éliminez toutes les bactéries et plantes transgéniques dans des conteneurs désignés pour déchets bio-dangereux.

3. Transformation des boutures de feuilles de R. aquatica

1. Pendant l’incubation de la culture de resuspension de l’inocule, sélectionnez plusieurs plants de 2 mois qui présentent des feuilles saines avec des marges entières.
2. Préparez un plateau de propagation des plantes (plateaux de nidification permanente de 20 x 30 cm) avec 2 couches d’essuie-tout autoclavé. Pliez les essuie-tout. Saturez les essuie-tout avec de l’eau stérile, afin qu’il y ait une fine couche d’eau par-dessus.
   REMARQUE : Établir un plateau de contrôle négatif dans lequel les explantes non inoculées subissent des conditions environnementales identiques.
3. Assurez-vous que le banc de laboratoire est équipé de récipients stériles de 100 à 500 mL ddH₂O, adaptés au volume anticipé d’inoculum en suspension réintégré, d’une micropipette et de pointes.
4. Avant la fin de la phase d’incubation, exciser rapidement dix feuilles à la base du pétiole des plants sélectionnés. Placez les explantes dans une boîte de Petri avec de l’eau stérile.
   REMARQUE : Il est essentiel d’utiliser des tissus fraîchement excisés pour l’inoculation foliaire afin d’éviter la dessiccation foliaire.
5. Après 2,5 heures, pipeter 50 μL de tensioactif dans une solution de resuspension de 1 L (concentration de 0,005 % de tensioactif) et faire doucement tourner la fiole pour mélanger (Figure 2A). Assurez-vous d’avoir accès à un plateau de propagation pour placer les explants après l’inoculation (Figure 2B).
6. Placez le côté abaxial de la feuille vers le haut et coupez perpendiculairement le long de la nervure centrale en morceaux de 1 cm de long avec un scalpel (Figure 2C).
7. Placez immédiatement les feuilles fraîchement coupées dans un tube de 50 mL, adapté au mélangeur rotatif de tubes, pour servir d’explants d’inoculation.
8. Verser l’inoculum dans le tube explant à un volume pour saturer tout le matériau, puis agiter dans un mélangeur rotatif pendant 10 minutes à température ambiante pour l’inoculation (Figure 2D,E).
9. Retirez toutes les feuilles inoculées de la solution avec des pinces et placez-les directement dans le plateau de propagation préparé.
10. Séparez et étalez les explantes trempées de sorte qu’elles soient partiellement mais pas totalement immergées dans la fine couche d’eau au-dessus des essuie-tout saturés (Figure 2F).
    ATTENTION : Maintenez des conditions aseptiques et évitez tout contact avec les surfaces ou les outils utilisés lors des procédures d’Agrobacterium avant leur désinfection.
11. Scellez chaque plateau avec du film plastique et faites éclore dans l’obscurité à température ambiante (22° C) pendant trois jours.
12. À la fin de la période d’obscurité, assurez-vous que les gouttières sont bien scellées avec du film plastique transparent et amendez-les avec ddH_2Opour maintenir le niveau d’humidité.
13. Déplacez les gouttières d’inoculation dans une chambre de croissance en conditions de propagation végétative.
    ATTENTION : Consolidez les déchets d’inoculation dans un récipient, traitez-les avec une solution d’eau de Javel à 10 %, puis éliminez-les conformément aux recommandations de biosécurité.

4. Régénération des plantes à rosettes et établissement de la génération R1-T1

1. Inspectez les gouttières d’inoculation 2 à 3 fois par semaine pour garantir des conditions propres et humides.
   1. Ajoutez_{ddH 2}O avec une bouteille à presser. Si disponible, vaporisez les explants à l’aide d’un vaporisateur avant de refermer les plateaux.
   2. Maintenez une humidité élevée en remplaçant le film plastique qui a perdu son adhérence ou présente des signes de contamination (par exemple, turbidité visible de l’eau).
2. Inspectez visuellement les plants rosettes régénérés pour vérifier les caractéristiques d’aptitude au transplante. Les régénérants idéaux présenteront une pousse intacte avec plusieurs feuilles et racines d’au moins 2 à 3 mm de longueur (Figure 2G).
   REMARQUE : Les plantes en rosette transgénique se régénèrent généralement plus lentement, atteignant généralement la compatibilité de la transplantation 21 à 28 jours après leur insertion dans la chambre de croissance.
3. Acciser et transplanter des plantes rosettes transgéniques intactes dans les mêmes conditions que les régénérants clonaux WT.
4. (Optionnel) Notez le nombre de transformants régénérés et corréléz-les à leurs conditions de transformation pour évaluer l’efficacité.
   REMARQUE : Faites preuve d’une prudence supplémentaire lors de la sélection. Les régénérants transgéniques sont souvent petits et facilement négligés. Inspectez soigneusement les surfaces foliaires adaxiales et abaxiales à l’aide de pinces pour maximiser le rendement et minimiser les dommages.
5. Retirer la plante rosette en accise, tout en évitant de toucher les feuilles transgéniques. Taillez tout excès de feuillage immédiatement autour de la feuille transgénique. Transplantez une plante par pot.
6. Fertilisez, arrosez et vaporisez rapidement chaque plante et placez-les sous un dôme en plastique pour conserver l’humidité (Figure 2G,H).
7. Marquez et enregistrez chaque semis transgénique.
8. Retournez les explants contenant des transformants dépourvus de pousses, de racines ou qui semblent trop petits pour être transplantés sur le plateau de propagation afin de poursuivre le criblage. Transplantez des transformants supplémentaires lorsque la croissance est suffisante.
9. Des greffes de brume et d’eau quotidiennement pendant la première semaine. Assurez-vous qu’il y ait toujours de l’eau dans le plateau.
10. Retirez et jetez toutes les greffes qui ont séné ou ne présentent plus d’expression de pigment RUBIS.
    ATTENTION : Éliminez toutes les matières transgéniques conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité.

5. Régénération ultérieure et établissement de la génération quasi clonale R2-T1

1. Une fois que les plants à rosette deviennent de grandes plantes en bonne santé (2 mois), les feuilles élargies exprimant du RUBI d’un seul plant (Figure 2H) se développent.
   REMARQUE : Bien que les feuilles exprimant le rubis puissent paraître uniformément rouges, elles sont plus souvent chimériques. Les deux phénotypes sont adaptés à la propagation. Poursuivez les méthodes de propagation végétative standard dans les étapes suivantes.
2. Divisez les feuilles transformées et placez-les dans un plateau de propagation. Étiquetez clairement chaque plateau de propagation avec l’identifiant donneur de semis correspondant.
   ATTENTION : Ne mélangez pas les feuilles de plusieurs semis dans le même plateau. Chaque plant représente un événement transgénique unique et doit être suivi comme une génération distincte.
3. Transplantation régénérée des plantes R2-T1 (14-28 jours après la propagation). Attribuer à chaque usine un nouvel identifiant reflétant son second statut. Poursuivre les soins standards après la transplantation comme décrit précédemment (Figure 2I,J).

Résultats

Les paramètres de transformation d’A. tumefaciens ont été optimisés pour produire avec succès des plantes transgéniques exprimant du RUBY, R. aquatica , en contournant les limitations liées à la stérilité tout en tirant parti de son taux rapide de régénération asexuée (Figure 1 et Figure 2). Après l’inoculation des explants de feuilles et exposés à un traitement sombre de 72 heures, les plants régénérés ont commencé à pousser en moins de 2 semaines dans les conditions décrites. Les plantules régénérées présentant des secteurs chimériques de RUBIS , suffisamment grandes pour être transplantées, ont été trouvées entre 3 et 5 semaines après l’inoculation (Figure 3) et étaient un peu plus petites que celles des plantules à rosette non exprimantes. Aucune plante régénérée en RUBIS n’a été trouvée sur les plateaux témoins de type sauvage, ce qui confirme que ce phénomène était différent de la physiologie de R. aquatica . Le type de bouillon de culture bactérienne, le type de bouillon d’inoculation en résuspension, la méthode d’infiltration et la période d’inoculation n’ont pas différé significativement dans leur capacité ou leur taux de production de transformants (Tableau 2 et Tableau 3). Les facteurs de traitement ayant eu un impact positif sur l’efficacité de la transformation comprenaient une augmentation de la concentration d’ASA et un traitement d’exposition à l’auxine avant l’inoculation par explant foliaire. Une concentration accrue de tensioactifs a eu un effet négatif sur le rendement et s’est avérée inadaptée.

La version R 4.4.2 12,13,14,15 a été utilisée pour effectuer l’analyse du Poisson General Linear Mixed Model (Poisson GLMM) des données de comptage de plantes à rosettes. Cependant, dans l’Expérience D (Tableau 2D), où des régénérants exprimés par RUBI ont été examinés pour une inoculation de 15 minutes modifiée avec 150 μM d’AS ou 225 μM AS, le modèle a violé les hypothèses dues à une sous-dispersion, et un GLMM binomial négatif a été appliqué à la place.

Les effets des différentes conditions de bouillon bactérien et de culture sur l’efficacité de la transformation ont été soigneusement examinés. Parmi les cinq réplications expérimentales, l’utilisation du bouillon Miller LB ou du bouillon MG/L spécifique à la transformation a conduit à des transformants exprimant RUBY sous des paramètres quasi identiques et n’ont pas différé significativement dans leurs effets (Tableau 2A). Les moyens de RUBY exprimés par des plants de rosette régénérés à partir de morceaux individuels de feuilles, composés de 15 à 60 explants par traitement, variaient de 1,61 ± 0,71 régénérant produits à partir d’expériences utilisant un bouillon de resuspension en culture à base de LB et non MS (Bouillon d’induction contrôle, Tableau 1) et 3,23 ± 1,13 régénérants issus de ces expériences comprenant MG/L et le bouillon d’induction optimisé. Malgré l’absence de différence significative, due à des observations subjectives, la culture MG/L et le bouillon d’induction optimisé (tableau 1) ont été sélectionnés pour les futures expériences d’optimisation.

Ensuite, nous avons testé des facteurs influençant la charge bactérienne et la capacité d’accéder aux tissus végétaux méristématiques. Parmi huit réplications (Tableau 2B), les explants inoculés avec une concentration accrue de surfactant de 0,01 % ont montré un stress extrême un mois plus tard, entraînant de petits régénérants largement non viables. Il ne semblait y avoir aucun transformant régénéré parmi ces répliqués, bien que le phénotype régénérant stressé des explantes était une pigmentation bordeaux, bruns et jaunes, il pourrait donc y avoir eu des transformants potentiels. Quoi qu’il en soit, l’inviabilité des régénérants a validé le maintien d’une concentration de tensioactif de 0,005 %.

Deux techniques mécanistes, agitation ou infiltration sous vide, ont été comparées dans leur effet pour introduire l’ADN désiré dans la plante hôte. La méthode d’infiltration témoin, où les explants étaient immergés dans 50 mL d’inoculum en suspension et tournés dans un mélangeur tubulaire, a réussi à produire des régénérants exprimés par RUBI à travers les traitements listés. L’infiltration sous vide appliquée a également produit des régénérants exprimés en RUBY, mais n’a pas différé dans son efficacité de transformation par rapport à la méthode de contrôle (p = 0,478, Tableau 2D). Environ 2 à 5 régénérants exprimés à RUBY par plateau de propagation ont été observés, qu’ils soient inoculés par infiltration sous vide ou par agitation physique.

La concentration modifiée d’acétosyringone (AS) dans l’inoculum bactérien différait clairement dans son effet sur l’efficacité de la transformation. L’augmentation de la concentration d’AS de 150 μM à 225 μM a considérablement amélioré la production d’explantes transgéniques exprimant du RUBBY (p = 0,000309, 0,000458 ; Tableau 3C,D). Parmi les quatre expériences, chaque traitement consistait en un plateau contenant 40 explants inoculés traités de manière identique. Ceux inoculés à la concentration la plus élevée ont obtenu en moyenne près de 5 régénérants exprimés par RUBY contre 1 transformant par plateau d’ASA témoins (Tableau 3C). De plus, l’effet AS semblait distinct des périodes de durée d’inoculation.

Parmi les trois expériences avec des durées d’inoculation de 15 minutes, avec des explants modifiés avec un taux d’ASA de 225 μM, une moyenne de 7,28 ± 4,13 régénérants exprimés à RUBY a été trouvée, ce qui était nettement supérieur aux traitements de 150 μM, où 2,03 ± 1,32 taux de régénération (Tableau 3D). Il n’y a eu aucun effet clair sur l’intervalle de temps parmi les traitements témoins à 150 μM (p = 0,676) pour lesquels le taux moyen d’inoculation sur 10 minutes était de 1,48 ± 0,954 contre 1,84 ± 1,230 régénération sur 15 minutes d’inoculation (Tableau 3B). De même, des inoculants traités à 10 minutes et 225 μM ont régénéré environ 5 plantes rosettes exprimées par rubis par traitement, ce qui n’était pas clairement différent des traitements inoculants de 15 minutes, où 6 à 7 régénérants pour le plateau de traitement étaient indiqués (Tableau 3A).

De plus, l’hormone végétale auxine, qui favorise la régénération des plantes en général, a été testée. L’exposition de fragments de feuilles fraîchement excisées à un traitement à l’auxine pulsée avant inoculation a eu un effet positif clair sur une régénération accrue du RUBIS par rapport à ceux du ddH_2O(p = 0,00969, Tableau 2C). Lorsqu’ils ont été placés dans_{ddH 2}0 amendé avec 285 μM d’acide indole-3-acétique (IAA), les explants ont affiché un taux moyen de transformant de 6,67 ± 1,490 par traitement, comparé au traitement sans auxine, qui a donné un taux de régénération moyen de 2,00 ± 0,816.

La lignée transgénique immédiatement régénérée a été désignée comme génération R1-T1 (Figure 2), avec des régénérants individuels sous forme de lignes. Toutes les premières plantes rosettes R1-T1 présentaient une expression RUBI sous forme de feuilles chimériques, avec une variété de motifs chimériques. Le plus souvent, 1 à 3 feuilles de plante exprimaient des chimères distinctes où les tissus exprimés par RUBI et non exprimés divergaient au niveau de la nervure centrale. La majorité des semis R1-T1 âgés d’un mois ont conservé une expression chimérique (Figure 3A), mais un petit nombre de semis exprimant entièrement le RUS a été trouvé.

Les secteurs chimériques pigmentés au RUBI propagés de manière asexuée à partir de fragments de feuilles de semis R1-T1 (Figure 3B) se sont régénérés soit entièrement en rubis, soit en rosets chimériques R1-T1 dans les 2 à 4 semaines suivant l’excision (Figure 3C). Après un mois, la plupart des semis R2-T1 présentaient principalement des feuilles RUBIS, certaines présentant de légères régions chimériques non exprimées (Figure 3D,E).

Figure 1 : Protocole et chronologie de propagation végétative. Des images représentatives illustrent le pipeline de production utilisé pour régénérer les plants à rosette asexuée. (A) Extraction des feuilles mûres, saines et lobées entières des plantes mères établies et les découpe en 2 à 3 morceaux. (B) Placer les explants dans un plateau de propagation et les entretenir dans des conditions spécifiées. Après 3 semaines, les plantes rosettes ont été retirées des explantes et transplantées dans le substrat du sol. Ci-dessous se trouve une photo réelle des rosettes régénérées encore attachées (flèches roses) à la coupure de la feuille mère. Ces plantes sont à l’étape optimale pour la transplantation. Barre à l’échelle : 10 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Transformation des boutures de feuilles de R. aquatica et régénération des transformants exprimant des transcrits RUBY. Aperçu graphique de la procédure de transformation et de la production des régénérants transformés. (A) Obtention de l’inocule bactérien. (B) Préparation d’un plateau de propagation avec du papier filtre stérile et de l’eau. (C) Évasion des feuilles en morceaux d’explantation. (D) Immerger les explants dans l’inoculum. (E) Agitation dans un mélangeur rotatif pendant 20r/1 min pendant 10 min. (F) Étalage des explants saturés dans le plateau, recouvrement d’un dôme plastique, et incubation dans des conditions sombres pendant 72 h. (G,H) Après 1 mois, excisation des régénérants transformés intacts des explantes exposées à Agrobacterium et transplantation pour établir des plantes matures. (I,J) Répéter l’étape de propagation (G,H) pour produire une génération quasi clonale de R2-T1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Générations propagées asexuément d’une lignée transgénique RUBY. (A) Plantule R1-T1 mature présentant des feuilles chimériques présentant une expression RUBIS. Barre d’écaille : 1 cm. (B) Deux des vingt explants fraîchement placés dans un plateau de propagation à partir du semis de 3 mois montré dans (A). Les explants présentent un motif chimérique de RUBIS, séparés au niveau de la nervure médiane. Barre-écaille : 1 cm. (C) Plantules de rosette R2-T1 régénérées avec différents degrés d’expression chimérique du RUBY, un mois après l’excision, avant la greffe. Racines RUBIS positives régénérées (flèche marron). Barre d’écaille : 2 cm. (D) Semis R2-T1 montré 1 mois après la transplantation, présentant une expression RUBY. Barre d’écaille : 2 cm (E) Plant mature R2-T1 3 mois après la transplantation présentant de petits secteurs (flèches vertes). Barre d’échelle : 2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Organigramme du pipeline optimisé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Formulations médias. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Effet de quatre paramètres d’optimisation sur l’efficacité de transformation de R. aquatica. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Effet de la concentration en acétosyringone de l’inocule sur l’efficacité detransformation de R. aquatica. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Dans cette étude, nous avons établi une transformation stable simple et directe basée sur la régénération Agrobacterium de R. aquatica, une plante amphibie des Brassicaceae qui ne se propage qu’asexuément^10,16. Un pipeline de transformation complet des plantes amphibies propagées par voie végétative n’a pas été établi, et la transformabilité pratique de R. aquatica n’a pas été exploitée avec un marqueur visuel. Notamment, ce pipeline ne nécessite pas un processus laborieux et stérile de culture de tissus végétaux ni d’incubateurs spécialisés pour la croissance des plantes. Ainsi, ce protocole peut être largement adopté dans divers contextes expérimentaux, des laboratoires de recherche scientifique aux salles de classe.

Parmi les différentes conditions d’inoculation et d’incubation testées, quelques facteurs ont permis une amélioration significative de l’efficacité de la transformation. Notamment, une concentration légèrement plus élevée en acétosyringone (SA) ainsi qu’une concentration d’acide indole-3-acétique (IAA) ont eu un impact positif sur l’efficacité de la transformation (Tableau 1 et Tableau 2). L’AS est un composé phénolique qui attire Agrobacterium, et il a été démontré qu’il améliore l’efficacité de la transformation des plantes chez^{Arabidopsis 17}. La phytohormone auxine est centrale pour la reprogrammation des cellules végétales. Une augmentation rapide de l’expression génique liée à l’auxine a été observée lors de la régénération induite par la^{plaie 10}. Pour cette raison, on peut supposer que l’application exogène d’auxine (IAA) lors de l’inoculation par explant augmente l’efficacité de la régénération. Cependant, les différences dans le nombre observé de plantes régénérées sur trois essais n’ont pas été observées (57 7,55 contre 59,67 5,51 pour le contrôle vs le traitement). Par conséquent, le traitement à l’auxine pourrait probablement aider le processus de transformation plutôt que la régénération elle-même.

Un tensioactif non ionique, le trisilane alkoxylé (connu sous le nom de Silwet L-77), augmente considérablement l’efficacité de transformation d’Arabidopsis via la méthode de trempage^{floral 3}, et à ce titre, il est largement utilisé au sein de la communauté de la biologie végétale. Un stress végétal minimal a été observé parmi les explantes amendées avec Silwet L-77 à 0,005 % (concentration recommandée pour le trempage floral). Lorsque cette dose a été doublée (0,01 %), les boutures de feuilles de R. aquatica ont été gravement endommagées, entraînant la récupération de presque aucun transformant (Tableau 2B). Lors du bain floral d’Arabidopsis, l’utilisation de tensioactifs réduit la tension superficielle des inoculants et améliore l’accès aux bourgeons floraux. En revanche, en tant qu’espèce amphibie, R. aquatica développe des feuilles lisses, dépourvues de tricomes ou de cuticules^{épaisses 5}. L’augmentation du tensioactif a causé des dommages aux tissus foliaires, indiquant que des facteurs autres que le tensioactif doivent être prioritaires pour l’efficacité de transformation dans les tissus foliaires non pubescents. Le tensioactif est plus pertinent pour le phénotype pubescent, où il facilite la pénétration tissulaire. Après avoir intégré tous les paramètres testés, un pipeline avec les conditions les plus optimales est fourni sous forme de diagramme de flux (Figure 4).

L’utilisation d’un marqueur visuel, RUBY, est essentielle à ce pipeline de transformation. RUBY est un rapporteur synthétique codant trois gènes codants (CYP76AD1, DODA et Glucosyl transférase) qui synthétisent un pigment rouge vif, la bétalaine¹¹. Lorsque l’expression du RUBY a été observée chez les régénérants R1-T1, elle s’est manifestée sous forme de secteurs rouges, indiquant qu’ils sont très probablement chimériques (Figure 2 et Figure 3). Une étude précédente a révélé que la régénération de R. aquatica provient d’un cambio vasculaire d’une feuille^{coupée en section 10}. Fait frappant, les régénérants R1-T1 présentent parfois une bordure chimérique le long de la nervure médiane, avec la moitié du limbe de la feuille rouge et l’autre moitié verte (Figure 3A,B). La régénération à partir de secteurs RUBIS a parfois donné des plants entièrement rouges avec des racines rouges (Figure 3C, flèche bordeaux), qui ont ensuite été cultivées en plantes R2-T1 uniformément rouges (Figure 3D). Aucun effet indésirable de la surexpression de RUBY sur la croissance et le développement de R. aquatica n’a été observé (Figure 3). À l’appui, aucune différence notable n’a été observée dans la taille et la forme des feuilles de rosette R1-T1 avec des secteurs RUBIS (par exemple, Figure 3B). Il est possible que tout transgène fort, constitutif, propulsé par un promoteur interfère avec la croissance normale des plantes et la réponse physiologique.

À certaines occasions, ces plantes RUBIS « quasi clonales » ont développé des secteurs verts (Figure 3E, flèches vertes), suggérant une réversion ou un silence transgène. Cela indique que posséder un marqueur visible comme RUBY est indispensable pour l’expression ectopique ou le silence (par exemple, l’ARNi) d’un gène d’intérêt pour de futures études moléculaires et mécanistiques. On peut introduire un transgène d’intérêt dans la cassette RUBY et observer les phénotypes dans les secteurs rouge, RUBY . En conclusion, en exploitant la reprogrammation directe induite par la coupe des feuilles et un marqueur visible non invasif, un pipeline de transformation simple et efficace est optimisé pour R. aquatica, une Brassicacée à propagation végétative. Bien qu’il ne soit pas dans le cadre de ce protocole, une compréhension future de l’origine exacte de la régénération de R. aquatica transformée pourrait fournir un éclairage sur la reprogrammation cellulaire chez les plantes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1000 & micro ; Pointes de pipette LTS filtrées à faible rétention	Rainin	30389213
Acétosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Extrait de levure bacto, technique	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Tryptone déshydratée	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Poudre lyophilisée à la biotine	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Dômes transparents pour les plateaux PermaNest	Solution du producteur	GD221
Film plastique transparent	Thomas Scientific	22-305654
Vermiculite grossière	Bectine
Di-potassium phosphate d’hydrogène anhydre	Sigma-Aldrich	105109
Plaques de Petri jetables 100 x 15 mm	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Éthanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-720
Tubes centrifugeuses coniques Falcon 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Essuie-tout pliés 9,3" x 10,5"	Kimberly-Clark	2920
Spectrophotomètre visible GENESYS 30	Thermo Scientific	840-277000
Solution de gentamicine	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
L-Glutamique sel monosodique hydrate	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Sulfate de magnésium, heptahydrate	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Shaker incubateur MaxQ 6000	Thermo Scientific	SHKE6000
Hydrate MES	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Mélange de sel basal Murashige et Skoog (MS), poudre	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro : Rotateur à tube de rôtissage	Scilogex	824222019999
myo-inositol	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Chambre de croissance de Percival	Percival	AR36L3
Additif pour la plantation de perlite	PVP Industries	PVP105408
Plateaux de plantes Perma-Nest 8''x12''	VWR International	470150-476
Mètre de pH Sept Compact 5220	Mettler Toledo	30019028
Scalpel protégé	Fisher Scientific	02-688-79
Rifampicine	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Engrais à libération intelligente pour plantes	Osmocote	B0071CZTBA
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	S271-3
Spectinomycine dihydrochlorure pentahydrate	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Vaporisateurs avec vaporisateur à pompe	Thomas Scientific	1141V43
Casseroles carrées de 3,5" GAGE	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Sunshine #4 Sol de culture professionnelle	Sun GRO Horticulture	1341CFL0028P S
Tensioactif - Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Déssicateur à vide	Le dépôt de laboratoires	55207
Nourriture végétale polyvalente soluble dans l’eau	Miracle-Gro	160101