Séparation HPLC automatisée utilisant LC-mate : un autoéchantillonneur répétitif intégré et un collecteur de fractions pour la purification à l’échelle microscopique

Résumé

Un autoéchantillonneur intégré et un collecteur de fractions (LC-mate) ont été développés pour automatiser les séparations répétitives de HPLC. Compatible avec les détecteurs HPLC qui émettent des signaux analogiques, LC-mate améliore les performances des systèmes manuels et accélère les flux de travail de recherche dépendant de la chromatographie liquide haute performance.

Résumé

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) joue un rôle crucial dans la purification des composés de grande valeur, répondant aux exigences croissantes des disciplines de chimie et de biologie tant dans le milieu académique qu’industriel. Cependant, l’injection manuelle répétée et la collecte de fractions lors de la purification à l’échelle microscopique limitent considérablement l’efficacité et la reproductibilité. Pour surmonter ce goulot d’étranglement, nous avons développé un système intégré d’autoéchantillonneur et de collecteur de fractions, temporairement nommé LC-mate, qui automatise les séparations répétitives en répondant directement aux signaux analogiques du détecteur HPLC. L’instrument est construit autour d’une vanne à commutation haute pression à six ports pour l’injection d’échantillons et d’une valve sélectrice pour la collecte des fractions, avec des paramètres opérationnels contrôlés via une interface tactile intuitive. LC-mate est compatible avec des détecteurs HPLC commerciaux capables de sortie analogique et peut également assurer une séparation répétitive du mode élution gradient via déclenchement synchrone du signal. Des expériences de démonstration ont confirmé un fonctionnement stable et des séparations reproductibles pour la purification des produits naturels, montrant une réduction nette du temps de manipulation manuelle. Le système propose une solution pratique et accessible pour améliorer l’automatisation dans les flux de travail HPLC conventionnels, comblant ainsi le fossé entre les systèmes de purification manuels et entièrement automatisés.

Introduction

La chromatographie, initiée par M.S. Tswett au début du XXe siècle, a évolué vers la chromatographie liquide à haute performance moderne (HPLC) dans les années 1960 avec des avancées dans^{l’instrumentation 1,2,3}.

Aujourd’hui, le HPLC joue un rôle crucial dans la purification des composés à forte valeur, répondant aux exigences croissantes des disciplines de la biomédecine, de la chimie et de la biologie, tant dans les domaines académique qu’industriel. Dans la recherche académique, la purification à microéchelle des produits naturels et la résolution des molécules chirales dépendent de manière critique des techniques HPLC^{semi-préparatoires} 4,5,6,7,8. Dans la plupart des cas pratiques, les chercheurs injectent une partie de la solution d’échantillon dans une colonne HPLC à la fois plutôt que dans l’ensemble pour éviter une perte imprévisible de l’échantillon ou en raison de la limitation de la taille de la colonne, ce qui rend inévitable l’injection répétée d’échantillons et la collecte de fractions. Malgré sa capacité exceptionnelle de séparation, l’utilisation du HPLC pour la purification des échantillons reste limitée par des contraintes inhérentes à l’instrumentation et aux flux de travail actuels. Un goulot d’étranglement majeur réside dans la forte dépendance à l’intervention manuelle, en particulier dans l’injection d’échantillons et la collecte des fractions. Ces processus ne sont pas seulement chronophages et laborieux, mais aussi sujets à l’erreur humaine, compromettant ainsi le débit, la reproductibilité et l’efficacité opérationnelle^{globale 9,10}.

Les autoéchantillonneurs commerciaux et les collecteurs de fractions des principaux fabricants HPLC, tels qu’Agilent, Shimadzu et Waters, offrent une automatisation fiable et précise, mais sont généralement limités dans des écosystèmes matériels et logiciels propriétaires. Par exemple, l’autosampler Agilent 1260 Infinity II et le collecteur de fractions G1364F sont intégrés de manière fluide dans les systèmes HPLC d’Agilent, offrant une excellente reproductibilité mais une compatibilité multiplateforme limitée. De même, les autoéchantillonneurs SIL-20A/40C de Shimadzu et les collecteurs de fractions FRC-40/FRC-10A offrent un haut débit et une excellente précision mécanique, tout en reposant sur les architectures de contrôle LC-20 et Nexera de Shimadzu. Les modules autoéchantillonneur HPLC et collecteur de fractions III de Waters Alliance offrent également des performances robustes et des formats de collecte flexibles (jusqu’à 300 mL/min), mais restent adaptés aux environnements propriétaires UHPLC et LC-MS de Waters. De plus, les autoéchantillonneurs traditionnels qui reposent sur des aiguilles d’injection peuvent réduire la récupération d’échantillons, et les collecteurs de fractions à tube peuvent être peu pratiques pour manipuler de grands volumes éluents. Pour la plupart des autres instruments HPLC, la séparation semi-préparative dépend encore d’une opération manuelle répétitive et fastidieuse.

Ces défis soulignent la nécessité d’une approche innovante pour automatiser la purification des échantillons dans les flux de travail HPLC. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé LC-mate, un instrument compact et polyvalent qui intègre des modules d’autoéchantillonneur et de collecte de fractions en une seule plateforme. Le noyau fluidique de LC-mate se compose de deux composants clés : une vanne de commutation à six orifices haute pression (SKVA-3130-S) construite en acier inoxydable SUS 316 avec un chemin d’écoulement de 0,4 mm et supportant une pression de fonctionnement allant jusqu’à 45 MPa, permettant un contrôle précis de l’injection d’échantillon, et une vanne sélectrice multi-positions à 10 canaux avec un volume mort minimal (27,5 μL de port à port, Rainure de rotor de 5 μL) avec un diamètre de canal d’écoulement de 1,2 mm pour une collecte efficace des fractions. Cette configuration minimise le volume mort et réduit le risque de contamination croisée. Pour des spécifications détaillées de l’instrument, veuillez consulter le Tableau 1. LC-mate peut recevoir la sortie analogique des détecteurs HPLC et déclencher l’instrument HPLC via un signal synchrone, permettant un contrôle indépendant à la fois de l’injection d’échantillons et de la collecte de fractions.

Tableau 1 : Paramètres d’instrument liés au LC-mate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

L’instrument est équipé d’un logiciel de contrôle convivial et d’une interface tactile intuitive permettant la visualisation en temps réel des signaux chromatographiques analogiques. LC-mate prend en charge à la fois les modes de séparation isocratique et de gradient, permettant aux utilisateurs de configurer des paramètres clés — y compris le volume d’injection, le nombre de temps de répétition, le temps d’intervalle de chaque injection, et le mode de collecte [basé sur le seuil, basé sur le temps ou Collect All (collecter les fractions au-dessus et en dessous du seuil)], et de lancer une opération entièrement automatisée avec une seule commande. Cela élimine le besoin d’interventions manuelles répétitives et améliore considérablement l’efficacité de la purification des HPLC.

La figure 1 illustre l’apparence générale, le principe de fonctionnement et la configuration du LC-mate intégré à un système HPLC.

Figure 1 : Conception et configuration du système LC-mate. (A) Disposition schématique. (B) Schéma d’instruments. (C) Photo de mise en place pratique. (D) Connexion de la ligne de transmission du signal entre le détecteur UV et le LC-mate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Protocole

1. Vérification de la connexion

1. Vérifiez les connexions de plomberie du solvant entre le HPLC, le LC-mate et la colonne chromatographique afin d’assurer les trajectoires d’écoulement correctes (Figure 1A).
2. Vérifiez la connexion de la ligne de transmission du signal entre le détecteur UV et le LC-mate, comme montré à la Figure 1D.
   1. Connectez le fil noir à la borne rouge et le fil blanc à la borne noire pour correspondre à la polarité du signal analogique.
   2. Observez l’affichage LC-mate. Si la forme d’onde du signal analogique apparaît, la connexion est correcte.
      REMARQUE : Si aucune forme d’onde n’est visible, inversez les connexions : connectez le fil noir à la borne noire et le fil blanc à la borne rouge.
3. Vérifiez la connexion de la connexion de déclenchement entre le détecteur UV et LC-mate.
   1. Branchez l’extrémité unique du câble de données dans le port de sortie du détecteur UV.
   2. Connectez les fils noir et blanc de l’autre extrémité aux bornes de déclenchement bleu et noir sur le LC-mate, respectivement.
   3. Serrez la borne et la gâchette pour assurer une connexion ferme.

2. Démarrage du système de séparation intégré

1. Assurez-vous d’un bon démarrage du HPLC.
2. Assurez-vous d’un bon démarrage du LC-mate.
   1. Au démarrage du système LC-mate, cliquez sur l’icône LC-mate à l’interface pour exécuter automatiquement le programme d’auto-test du système et initialiser les modules matériels clés.
   2. Attendez le court signal d’invite Di (environ 0,5 s) et la disparition de l’invite « Auto-test » à l’écran après la fin de l’auto-test, car ils indiquent que l’initialisation est terminée.

3. Optimisation des conditions

1. Configurez la condition de séparation HPLC et commencez l’élution pour atteindre l’équilibre de la colonne.
2. Cliquez sur l’icône Test sur le côté gauche de l’écran de LC-mate, et l’interface suivante s’affichera à l’écran (Figure 2A). Paramètres de volume d’injection, de temps d’élution et de temps de répétition , et appuyez sur l’icône Start ; le fonctionnement de l’autoéchantillonneur, du collecteur de fractions et du HPLC sera initié. Dans ce cas, l’éluent ne s’écoule que par le port 10 de la soupape de sélection, et peut être collecté manuellement ou débarrassé.
3. Identifier les conditions de séparation réalisables, y compris la résolution, le temps de fonctionnement, le temps de rétention, le volume d’injection, la longueur d’onde UV, etc., afin de faciliter la séparation et la collecte des fractions ultérieures sous des modes appropriés.

4. Fonctionnement automatique

REMARQUE : En fonction du chromatogramme des conditions de séparation réalisables, on pourrait sélectionner une méthode de collecte de fractions appropriée parmi les options Seuil, Collecte Temporelle et Collecter Tout sur le côté gauche de l’interface.

1. Collecte des fractions basée sur la valeur seuil
   1. Sélectionnez le module de fonction Seuil sur le côté gauche de l’interface, et le système affichera l’interface de réglage des paramètres comme montré à la Figure 2B.
   2. Entrez le volume d’injection, les temps de répétition, le seuil et le temps d’élution, puis appuyez sur Start ; le HPLC et le LC-mate fonctionneront automatiquement. Les fractions dont les pics chromatographiques dépassent le seuil seront collectées dans différentes bouteilles de collecte.
   3. Surveillez les indicateurs d’état disposés verticalement sur l’écran : Observez l’injection en cours pour confirmer que l’introduction de l’échantillon est lancée. Vérifiez la séparation en cours pour vérifier que la séparation chromatographique a lieu. Notez « Vidage de la seringue » pour identifier lorsque la seringue purge le liquide résiduel. Faites attention à la surlignure bleue du texte correspondant pour confirmer quel état opérationnel est actuellement actif.
      REMARQUE : Pendant le processus de séparation, appuyer sur l’icône « Chromatogramme » affichera le chromatogramme et la ligne de seuil sur une nouvelle interface, et le chromatogramme est identique à celui affiché sur l’écran de l’ordinateur qui contrôle le HPLC.
2. Collecte des fractions selon la période
   1. Sélectionnez le module Collection de Synchronisation à gauche de l’interface pour ouvrir le menu de paramètres (Figure 2C).
   2. Saisissez les paramètres requis : volume d’injection, temps de répétition, temps d’élution et une série de temps de collecte nécessaires.
   3. Appuyez sur le bouton Start pour initier la séquence automatisée, puis le système HPLC et LC-mate s’exécuteront en boucle selon les paramètres définis.
3. Collecte de fractions avec le mode « Collecter tous »
   1. Sélectionnez le module de fonction Collecter Tout sur le côté gauche de l’interface, le système affichera l’interface de réglage des paramètres comme montré à la Figure 2D.
   2. Fixez une valeur seuil de collecte, et les pics chromatographiques supérieurs ou inférieurs au seuil seront tous collectés séparément, ce qui peut garantir qu’aucun composé dans un mélange ne serait perdu.
      REMARQUE : L’acétonitre est un solvant inflammable et toxique. Toutes les procédures impliquant l’acétonitrile ou d’autres solvants organiques doivent être réalisées dans un laboratoire bien ventilé. Le personnel doit porter en permanence un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des lunettes anti-éclaboussures chimiques et des gants résistants aux solvants. Les déchets d’acétonitrile et d’autres solvants organiques doivent être collectés dans des contenants désignés et correctement étiquetés pour les déchets chimiques dangereux. Ces flux de déchets étaient traités conformément au protocole de santé et sécurité environnementale de notre institution par un service d’élimination agréé.

5. Nettoyage des canalisations

REMARQUE : Le nettoyage du pipeline garantit qu’aucun échantillon ne reste dans le pipeline lors de l’utilisation prochaine de l’autosampler.

1. Préparez une petite bouteille de solvant propre, et insérez la canalisation d’injection de l’autoéchantillonneur dans le solvant.
2. Sélectionnez le module Nettoyage depuis l’interface côté gauche pour ouvrir le menu de paramètres (Figure 2E).
3. Nettoyage de la canalisation d’injecteurs
   1. Réglez le volume d’injection entre 0 et 1000, et fixez les temps de répétition (sans limites).
   2. Cliquez sur la section Nettoyage ci-dessous de « Nettoyage terminé » pour commencer le nettoyage du pipeline d’injecteurs.
   3. Surveillez le nombre de cycles pour suivre le nombre de cycles de lavage terminés.
4. Nettoyage du pipeline de collecte
   1. Fixez le temps de purification (sans limites).
   2. Cliquez sur la section Nettoyage ci-dessous de « Pipeline Current » pour commencer le nettoyage de la chaîne de collecte.
   3. Surveillez l’affichage actuel du pipeline pour confirmer quel pipeline est en cours de nettoyage, car le système traite séquentiellement du pipeline 0 au pipeline 10.

Figure 2 : Interface tactile LC-mate pour l’exploitation de la méthode. (A) Écran d’optimisation. (B) Mode seuil. (C) Mode de synchronisation. (D) Mode collecter tout. (E) Nettoyage de canalisation. (F) Réglages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Instructions de sauvegarde des données

1. Activez la sauvegarde automatique. Le système sauvegarde automatiquement le chromatogramme après chaque cycle d’élution terminé.
2. Effectuez la sauvegarde manuelle. Cliquez sur le bouton Enregistrer après la fin de l’élution. Saisissez les métadonnées requises dans la boîte de dialogue pour sauvegarder le fichier.
3. Sélectionnez l’emplacement de stockage. Choisissez d’enregistrer les fichiers sur le stockage local de l’appareil, une carte SD ou une clé USB externe.
   REMARQUE : Utilisez un disque USB externe pour tout le stockage des données afin d’éviter les limitations de capacité et garantir un accès facile aux données.

Résultats

Purification de l’hyperoside 2"-O-galloyl-hyperoside
Le 2"-O-Galloyl-hyperoside (2-GH) est un composant hydrosoluble majeur de l’Euphorbia helioscopia L., une médecine traditionnelle chinoise ayant une longue histoire d’utilisation pour résoudre le mucus et^{l’humidité 11}. Sa structure chimique est illustrée à la Figure 3. Le 2-GH a récemment été identifié ...

Discussion

Ces résultats démontrent que le système LC-mate peut effectuer de manière autonome l’injection continue d’échantillons et la collecte de fractions en suivant les paramètres définis, minimisant ainsi significativement l’intervention manuelle et améliorant l’efficacité de la séparation. Le système propose une interface conviviale, ne nécessitant que la configuration initiale du matériel suivie d’un fonctionnement intuitif de l’écran tactile.

Pour assurer le succ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chromatographe liquide haute performance - EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd. Page web de l’instrument EasySep® ;-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Un système HPLC modulaire préparatif utilisé dans le protocole. Il comprend une pompe d’alimentation en solvant, un détecteur UV/VIS et une valve d’injection manuelle. Ce système forme l’unité de séparation centrale que le LC-mate automatise.
(Colonne chromatographique liquide) Sharpsil-U C18 150 mm (L) et époques ; 30 mm (I.D.) S-10 & micro ; m, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Colonne chromatographique inversée en phase C18 avec une taille de particule de 10 et mu ; m et une taille de pores de 100 Å ;. Il est conçu pour la séparation de petites molécules (telles que des médicaments, des composés organiques) et offre une bonne reproductibilité et stabilité. Les dimensions de la colonne (150 mm de longueur, 30 mm de diamètre intérieur) la rendent adaptée à la chromatographie préparatoire ou semi-préparative.
LC-mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. Pour toute demande sur   ; l’instrument LC-mate, veuillez contacter l’auteur correspondant par e-mail : wmzhao@simm.ac.cn  ;	GD202200337	Équipements auxiliaires pour les systèmes de chromatographie liquide, probablement utilisés pour l’injection d’échantillons, la gestion de la phase mobile ou l’acquisition de données. Il peut être intégré aux systèmes HPLC pour améliorer l’automatisation et l’efficacité des processus expérimentaux