Évaluation de la fonctionnalité multimodale des lymphocytes T récepteurs d’antigènes chimériques à une seule cellule par analyse optofluidique

Summary

La thérapie adoptive par cellules T utilisant les cellules CAR-T montre des promesses pour le traitement des cancers du sang, bien que les réponses durables soient incohérentes. Les lymphocytes T polyfonctionnels sont corrélés à la durabilité en rémission, mais les tests standards obscurcissent les sous-populations clés. Nous présentons un flux de travail monocellulaire utilisant une plateforme optofluidique pour identifier et isoler des cellules CAR-T hautement fonctionnelles en vue d’études ultérieures.

Abstract

La thérapie adoptive par lymphocytes T est un nouveau paradigme de traitement dans lequel les lymphocytes T autologues sont génétiquement modifiés pour exprimer un récepteur antigénique chimérique (CAR) ciblant la tumeur avant une expansion ex vivo et une réinjection dans le patient. Malgré des démonstrations remarquables de puissance antitumorale chez les patients atteints de cancers hématologiques avancés, les réponses durables ne se manifestent pas dans une fraction substantielle des cas. Bien que plusieurs facteurs idiosyncratiques puissent contribuer à la variabilité des résultats cliniques, il existe de plus en plus de preuves que le pourcentage de lymphocytes T polyfonctionnels dans le produit CAR-T pré-infusion est fortement corrélé à la durabilité de la rémission cancéreuse. Malheureusement, les évaluations standard des produits à cellules CAR-T reposent actuellement sur des mesures de population en vrac ou des tests terminaux, limitant la capacité d’isoler et d’étudier des sous-populations aux propriétés fonctionnelles accrues. Ici, nous démontrons un flux de travail qui exploite une plateforme optofluidique pour évaluer à la fois le profil de sécrétion des cytokines et l’activation via l’expression du CD137 de cellules CAR-T individuelles, ce qui peut être éventuellement combiné avec une évaluation de l’activité cytotoxique. Les cellules présentant le plus grand degré de fonctionnalité multimodale peuvent être isolées pour des analyses ultérieures visant à orienter la conception de thérapies CAR-T de nouvelle génération.

Introduction

Les lymphocytes T exprimant les récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont démontré une puissance antitumorale remarquable chez des patients atteints de cancers hématologiques^{avancés 1,2}. Cependant, une fraction importante des patients traités finit par rechuter, soulignant la nécessité de développer des produits à cellules CAR-T avec une persistance fonctionnelle plus^élevée 3,4,5,6. Bien que de nombreux facteurs idiosyncratiques puissent contribuer à la variabilité des résultats cliniques, il existe de plus en plus de preuves que le pourcentage de lymphocytes T polyfonctionnels dans le produit CAR-T pré-infusion est fortement corrélé à la durabilité de la rémission cancéreuse. Ainsi, des stratégies visant à enrichir ou à modifier les cellules CAR-T avec une plus grande polyfonctionnalité pourraient produire des produits thérapeutiques au potentiel accru de médiation de réponses cliniques ^{durables 6,7,8}. Malheureusement, les méthodes actuelles pour caractériser les fonctions des cellules CAR-T reposent en grande partie sur des mesures de population en vrac ou des tests terminaux. Ces éléments limitent la capacité d’isoler et d’étudier des sous-populations spécifiques présentant des propriétés multifonctionnelles accrues. Par exemple, la sécrétion de cytokines est généralement évaluée soit par des surnadants en masse, soit par coloration intracellulaire. Ce dernier nécessite une fixation cellulaire en échange d’informations au niveau⁹ de la cellule unique. De même, le potentiel cytotoxique est le plus souvent évalué pour les populations massives de cellules CAR-T en quantifiant la perte de viabilité cellule cible après la co-culture T/cellule^{cible 10}. La capacité à évaluer la sécrétion, l’activation et l’activité cytolytique des cytokines des cellules CAR-T viables à une seule résolution cellulaire pourrait stimuler le développement de produits thérapeutiques à une efficacité anti-tumorale plus durable.

Ici, nous présentons une méthode pour profiler simultanément les cellules CAR-T individuelles pour leur fonctionnalité multimodale via une plateforme optofluidique monocellulaire (Figure 1). Le système utilise le positionnement opto-électrique (OEP) pour déplacer des billes de capture de cytokines et des cellules individuelles dans des enclos spatialement séparés, permettant des évaluations fonctionnelles de cellules CAR-T uniques (Figure 2A). Dans ce protocole, nous démontrons un flux de travail pour générer des cellules CAR-T via un transfert de gènes non viraux et évaluons la sécrétion et l’activation des cytokines via CD137 de cellules CAR-T individuelles lors de la co-culture avec des cellules cibles exprimant et antigènes négatifs (Figure 3 et Figure 4)¹¹. Le potentiel de différencier les profils de cytokines et d’activation entre des produits cellulaires modifiés est illustré par la comparaison des cellules CAR-T standard à celles c-Jun^{surexprimant 6}. L’activité cytotoxique contre les cellules cibles uniques peut également être évaluée à l’aide de lectures basées sur la caspase ou la fluorescence sur la plateforme optofluidique (Figure 2B). Cependant, une analyse en accéléré temporel est nécessaire pour déterminer la cinétique d’interaction, qui peut varier considérablement selon chaque construction et expérience CAR. De même, les tests de tuerie répétitive qui imitent la stimulation chronique nécessitent un flux de travail alternatif. Ainsi, dans cet article, nous décrivons la procédure de base pour réaliser l’évaluation de la cytotoxicité sans en discuter en détail.

En fonction de l’évaluation choisie et des caractéristiques cibles, les cellules CAR-T vivantes présentant le plus grand degré de fonctionnalité multimodale peuvent être déchargées de l’instrument et transférées dans des puits individuels dans des plaques de 96 puits pour une étude ultérieure (Figure 2C).

Protocol

REMARQUE : Le tampon et la préparation des médias sont fournis dans le Tableau 1.

1. Isolation des lymphocytes T CD8 à partir de cônes du système de réduction des leucocytes

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes avec une technique stérile et aseptique dans un cabinet de biosécurité en culture tissulaire. Tous les supports pour dilutions, lavages et resuspensions doivent être maintenus à 4 °C tout au long de la procédure.

1. Ajoutez 15 mL de milieu de séparation cellulaire (densité 1,077 g/mL) à chacun des deux tubes coniques de 50 mL (tube de séparation).
2. Tenir un cône du système de réduction des leucocytes (LRS) (côté conique vers le bas) sur un tube conique de 50 mL non condensé. À l’aide de ciseaux stérilisés, coupez le tube en plastique qui s’étend sous le cône LRS. Posez le cône LRS sur le tube conique ouvert de 50 mL et coupez le tube en plastique au-dessus. Prélever environ 8 à 10 mL de sang dans le tube conique de 50 mL.
3. Remplissez le tube conique de 50 mL jusqu’à 50 mL avec PBS + EDTA (préparé comme indiqué dans la liste des milieux et tampons) et pipetez pour mélanger le sang dilué. Répartir le sang dilué également entre les deux tubes de séparation.
4. Centrifugez les tubes de séparation avec du sang dilué à 750 x g pendant 15 minutes à température ambiante (RT), avec 9 pour l’accélération et 2 pour la décélération.
5. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, prélevez soigneusement et transférez la couche buffy de chaque tube de séparation dans un nouveau tube conique de 50 mL.
6. Remplir chaque tube conique de 50 mL à 40 mL avec PBS + EDTA et resuspendre pour obtenir des suspensions monocellulaires. Centrifugez les suspensions monocellules à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant.
7. Resuspendez et combinez les granulés cellulaires dans 40 mL de PBS + EDTA. Centrifugez la suspension monocellule à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant.
8. Resuspendez la granule cellulaire dans PBS + EDTA et déterminez la densité cellulaire viable de la suspension de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) via la coloration au bleu de Trypan.
   REMARQUE : Le bleu de Trypan est un colorant imperméable à cellules vivantes qui colore l’ADN. Ainsi, les PBMC vivantes et les cellules non nucléées (c’est-à-dire les globules rouges) resteront intactes. Il est important d’exclure les petites cellules (par exemple, les globules rouges) lors de la détermination de la densité viable de PBMC.
9. Transférer le nombre désiré de PBMC dans un tube conique neuf de 50 mL pour l’enrichissement magnétique des cellules T CD8⁺ . Estimer 10 fois le nombre désiré de cellules T CD8⁺ comme quantité de départ de PBMC requise pour l’enrichissement magnétique. Gardez les réactifs au froid pendant la procédure.
10. Centrifugez la suspension à cellules PBMC à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant. Resuspendez la pellete cellulaire dans 40 μL de tampon MACS (préparé comme indiqué dans la liste des milieux et tampons) par 1 x 10⁷ cellules.
11. Ajoutez 10 μL de cocktail Biotine-Ab à cellules T CD8⁺ par 1 x^{10 7} cellules. Mélangez en pipettant et incubez pendant 5 minutes à 4 °C.
12. Ajoutez 30 μL de tampon MACS par 1 x 10⁷ cellules. Ajouter 20 μL de microbilles CD8⁺ par 1 x^{10 7} cellules. Mélangez en pipettant et incubez pendant 10 minutes à 4 °C.
13. Placez la ou les colonnes LS pré-refroidies sur un aimant. Placez un tube conique de 15 mL en dessous pour collecter le flux de liquide. Équilibrez chaque colonne LS avec 3 mL de tampon MACS.
14. En utilisant le même tube conique de 15 mL que le tube de collecte, appliquez la suspension de la cellule sur la colonne LS équilibrée. Lavez la colonne 3 fois avec 1 mL de tampon MACS. Laissez chaque lavage de 1 mL passer complètement à travers la colonne LS avant d’appliquer le lavage suivant.
15. Suspendez soigneusement les cellules collectées et déterminez la densité cellulaire viable de la suspension enrichie CD8⁺ en T-cellules via une coloration au bleu de Trypan.

2. Activation par billes des lymphocytes T CD8⁺

1. Calculez le nombre de billes humaines CD3/CD28 nécessaires pour un ratio 1:1 des cellules T :billes. La crosse de billes d’activation contient 1 x 10⁶ billes par 25 μL.
2. Faites légèrement vortexer les billes d’activation pendant au moins 30 s avant de transférer le volume calculé de suspension des billes dans un tube conique de 15 mL. Ajoutez un volume égal de substrat pour laver les billes et le vortex pendant au moins 5 secondes.
3. Placez le tube conique de 15 mL dans l’aimant correspondant pendant 1 minute pour collecter les billes sur les côtés du tube. Aspirez et jetez le surnageant.
4. Calculez le volume de milieu nécessaire pour une concentration finale de cellules T de 1 x 10⁶ cellules T/mL. Retirez le tube conique de 15 mL de l’aimant et resuspendez-le dans le volume calculé du milieu de culture. Ajoutez de l’IL-2 humaine recombinante à une concentration finale de 50 U/mL.
5. Transférez le milieu entièrement supplémenté dans le tube contenant les lymphocytes T et remettez en suspension. Ensemencer la suspension cellulaire dans un format de culture cellulaire approprié (par exemple, 1 mL dans des plaques à 48 puits, 2 mL dans des plaques à 24 puits) et incuber pendant 40 heures.

3. Génération de cellules CAR-T par transfert de gènes non viraux via nucléofection

REMARQUE : Le préchauffage du milieu (37 °C), des réactifs (RT) et de la centrifugeuse (RT) est essentiel pour garantir une grande efficacité de transfert génétique.

1. Préparez et étiquetez une plaque de 48 puits avec 1 mL de milieu de culture cellulaire pour chaque condition de nucléofection. Incubez la plaque pendant au moins 30 minutes pour fournir un milieu chaud et ajusté en CO₂ avec un pH physiologique.
2. Allumez le nucléofecteur et sélectionnez les positions à nucléofecter dans la bande de 16 puits. Sélectionnez le programme approprié (par exemple, FI-115 pour favoriser une haute efficacité ou EO-115 pour une meilleure viabilité).
3. Sortez la plaque de culture cellulaire contenant les lymphocytes T de l’incubateur et utilisez un microscope pour vérifier l’apparence visuelle des cellules, afin d’avoir une première impression si l’activation a été réussie. Les lymphocytes T activés avec succès devraient présenter un regroupement uniforme et une forme cellulaire agrandie. Une couleur moyenne qui diffère d’un substrat frais vers une teinte légèrement orangée indique que l’activation a conduit à un état métabolique plus actif et est considérée comme un bon signe. À ce stade, une analyse en flux cytométrique des marqueurs d’activation précoces CD25 et CD69 peut valider l’activation.
4. Reposer, prélever et compter les lymphocytes T activés. Calculez le nombre de cellules T nécessaires en considérant 1,2 à 2 x 10 cellules T^{de 6} par condition. Transférez le volume calculé dans un tube conique neuf de 15 mL et centrifugez à 200 x g pendant 10 minutes en RT.
5. Aspirez et éliminez le surnageant et lavez les lymphocytes T avec 10 mL de PBS tiède. Centrifugez à 200 x g pendant 10 minutes en RT. Utilisez le temps de centrifugation pour décongeler les plasmides codant le CAR, généralement avec une concentration de 1 μg/μL d’ADN. Assemblez un plasmide codant par transposase (SB100x), un plasmide (1,0 μg) ou un minicercle (0,5 μg) avec un plasmide codant CAR (1,0 μg) ou un minicercle (0,6 μg) dans un tube de microcentrifugation individuel de 1,5 mL sans ADN par condition de nucléofection.
6. Préparez une quantité suffisante de solution de nucléofecteur P3 avec supplément ajouté (par condition : 16,4 μL de solution nucléofectrice + 3,6 μL de supplément).
7. Retirez le tube conique de 15 mL contenant les lymphocytes T de la centrifugeuse, aspirez le surnageant, puis centrifuge-le pendant 1 minute à 200 x g pour collecter le liquide résiduel au fond. Prenez une pipette de 200 μL pour retirer soigneusement autant de tampon que possible sans toucher à la pellete cellulaire.
8. Poursuivez immédiatement la resuspension de la pastille de cellule T dans 20 μL de tampon P3 (comme indiqué dans la liste des matériaux) par condition. Transférer 20 μL de suspension cellulaire dans un tampon P3 dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant les constructions respectives, mélanger doucement sans introduire d’air, puis transférer la suspension cellulaire sur la bande de nucléofection à 16 puits. Tapotez doucement pour éliminer tout air au fond du puits.
9. Placez la bande à 16 puits dans le système nucléofecteur 4D et commencez la procédure de nucléofection. Après une nucléofection réussie, une croix verte devrait être visible à l’écran pour chaque puits choisi.
10. Ajoutez immédiatement 100 μL de milieu pré-chauffé à partir de la plaque préparée à 48 puits avant d’incuber la bande à 16 puits pendant 10 minutes dans l’incubateur.
11. Resuspendez soigneusement 2 à 3 fois, transférez la suspension cellulaire dans la plaque préparée à 48 puits, puis remettez-la dans l’incubateur.
12. Après 4-5 heures, retirez soigneusement 500 μL de chaque puits et ajoutez délicatement 500 μL de milieu de culture frais et préchauffé, complétés par un IL-2 humain recombinant de 50 U/mL.
13. Effectuer des changements réguliers de milieu tous les deux jours pour agrandir les cellules, en maintenant une densité cellulaire comprise entre 0,5 et 2 x^{10 6} cellules T/mL.
14. Le jour 6, retirez les billes d’activation CD3/CD28. Prélève les lymphocytes T en les resuspendant doucement 10 fois et en transférant la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Placez le tube conique de 15 mL dans l’aimant correspondant pendant 1 minute.
15. Aspirez la suspension cellulaire, transférez sur une plaque de culture fraîche, et nourrissez les cellules avec un milieu de culture cellulaire frais complété en IL-2 jusqu’à une concentration finale de 50 U/mL. Les billes doivent rester visibles dans les parois latérales du tube conique de 15 mL restant dans l’aimant.
16. Analysez l’efficacité du transfert génétique au jour 7 via une analyse cytométrique en flux de l’expression des marqueurs CAR ou de substitut respectifs avant de procéder au tri magnétique des cellules CAR T positives au transgène au jour 8 (Stratégie de Gating dans la Figure Supplémentaire 1).

4. Enrichissement magnétique des lymphocytes T positifs au transgène

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes avec une technique stérile et aseptique dans un cabinet de biosécurité en culture tissulaire. Tous les supports pour dilutions, lavages et resuspensions doivent être maintenus à 4 °C tout au long de la procédure.

1. Prélever les lymphocytes T en les resuspendant doucement et en les transférant vers des tubes coniques de 15 mL. Compter les cellules T, prendre le nombre de cellules à enrichir magnétiquement et centrifuger pendant 10 minutes à 300 x g.
2. Aspirez et jetez le surnageant puis lavez en resuspendant 10 mL de tampon MACS. Centrifugez pendant 10 minutes à 300 x g. Aspirez et jetez le surnageant.
3. Calculez la quantité d’anticorps biotinylé dirigé contre le marqueur de substitution (par exemple, tEGFR) nécessaire. En général, l’anticorps doit être titré à 1 μL pour 1 x 10⁶ cellules.
4. Resuspendez les lymphocytes T à une densité de 1 x 10⁷ cellules par mL et ajoutez la quantité calculée d’anticorps biotinylé. Incubez pendant 20 minutes à 4 °C.
5. Lavez en ajoutant 10 mL de tampon MACS et centrifugez 10 minutes à 300 x g. Aspirez et jetez le surnageant.
6. Resuspendez les cellules T à 1 x 10⁷ cellules par 80 μL de tampon MACS. Ajoutez des microperles d’antibiotine à un volume de 20 μL par 1 x^{10 7} cellules. Mélangez bien et faites écouver pendant 15 minutes à 4 °C.
7. Lavez en ajoutant 10 mL de tampon MACS et centrifugez 10 minutes à 300 x g. Aspirez et jetez le surnageant. Resuspendez les cellules dans 500 μL de tampon MACS.
8. Placez la ou les colonnes LS pré-refroidies sur un aimant. Placez un tube conique de 15 mL en dessous pour collecter le flux de liquide.
9. Équilibrez chaque colonne LS avec 3 mL de tampon MACS. En utilisant le même tube conique de 15 mL que le tube de collecte, appliquez la suspension de la cellule sur la colonne LS équilibrée.
10. Lavez la colonne 3 fois avec 1 mL de tampon MACS. Laissez chaque lavage de 1 mL passer complètement à travers la colonne LS avant d’appliquer le lavage suivant.
11. Pour collecter des cellules transgène-positives, prenez la colonne LS de l’aimant et mettez-la dans un tube conique neuf de 15 mL. Ajoutez 5 mL de tampon MACS et poussez doucement le liquide hors de la colonne.
12. Comptez les cellules isolées et centrifugez pendant 10 minutes à 300 x g. Resuspendez les cellules positives au transgène dans un volume approprié de milieu complété en IL-2 et incubez jusqu’à ce que les évaluations fonctionnelles et/ou phénotypiques soient effectuées. Effectuez une vérification de pureté avant de commencer les flux de travail en colorant pour le CAR ou le marqueur de transduction de substitut (Figure supplémentaire 2).

5. Préparation du système

1. Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel Cell Analysis Suite (CAS). Assurez-vous que le bac de collecte des déchets est vide. Vérifiez qu’il y a de l’eau dans la colonne de l’humidificateur.
2. Naviguez vers le panneau des flux de travail. Ouvrez le flux de travail Full Clean (préchargé lors de l’installation du système).
   REMARQUE : Il est recommandé d’exécuter le flux de travail Full Clean dans les 72 heures suivant le début d’une expérience sur l’instrument.
3. Effectuez toutes les vérifications et continuez en cliquant sur Démarrer. Lorsqu’on le demande, échangez les tubes coniques et les bouteilles de réactifs dans chaque fente de la baie de réactifs contre des contenants neufs par une solution nettoyante BLI. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
4. Sur demande, échangez les tubes coniques et les bouteilles de réactifs dans chaque fente de la soute des réactifs contre des contenants frais par de l’eau stérile. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
5. Ouvrez le flux de travail Pre-flight Check (préchargé lors de l’installation du système). Effectuez toutes les vérifications et continuez en cliquant sur Démarrer.
6. Préparez un tube conique de 50 mL avec 2 mL de solution mouillante. Préparez un tube conique séparé de 50 mL avec 39,6 mL de 1x DPBS et 400 μL d’additif mouillant.
7. Lorsqu’on le demande, remplacez la puce Flush par une puce optofluidique. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer. Nettoyez soigneusement la surface de la puce d’optofluidiques et des viroles du nid avec 70 % d’éthanol avant de fermer les nids.
8. Sur demande, échangez les tubes coniques et les bouteilles de réactifs dans chaque fente de la baie de réactifs contre des contenants neufs avec les solutions appropriées.

6. Création de flux de travail par essais

1. Naviguez vers le panneau des flux de travail. Sélectionnez Créer un nouveau flux de travail (+), sélectionnez Profilage des cellules T Opto, puis sélectionnez MCA et Dosage de cytotoxicité dans le menu déroulant.
2. Double-cliquez sur Multiplex Cytokine Bead Load pour élargir la liste de charge des billes. Si vous testez moins de 3 cibles de cytokines, cliquez sur X pour supprimer la ou les billes de cytokine de la liste de charge des billes.
3. Mettez à jour chaque champ avec le type de bille approprié, la cible de cytokine et l’emplacement d’importation.
   REMARQUE : Le logiciel CAS chargera automatiquement chaque bille de capture de cytokine dans l’ordre décroissant de la luminosité Cy5, quel que soit l’ordre des entrées de chargement des billes.
4. Double-cliquez sur Charge prioritaire du CPA avec contrôle pour élargir la liste de charge de la cellule cible. Si vous testez plus d’une cellule cible de contrôle et d’une lignée cellulaire cible d’échantillon, ajoutez des étapes supplémentaires de chargement de cellule.
5. Mettez à jour chaque champ avec le nom de la ligne cellulaire cible souhaité, le champ de vue désiré (FOV) sur le stylo, et les critères de sélection des APC (en spécifiant le fichier modèle de sélection du stylo cible (TPS)).
6. Sélectionnez Configuration de charge T Cell et sélectionnez Multiple Cell Lines. Double-cliquez sur Charge prioritaire des cellules T pour étendre la liste de charge des cellules T.
7. Mettez à jour chaque champ avec le nom de la lignée de cellules T souhaité, les FOV souhaités à l’enclos et les critères de sélection des cellules T (en spécifiant le fichier modèle TPS).
8. Double-cliquez sur le test de cytotoxicité pour élargir les paramètres du test de cytotoxicité. Mettez à jour les champs de paramètres d’imagerie spécifiques au flux de travail avec la durée de test souhaitée (h).
9. Double-cliquez sur les tests de phénotype et de cytokine pour élargir le protocole de coloration pour le test de sécrétion de cytokines.
10. Mettez à jour les champs On Chip Staining avec le lieu d’importation approprié pour les colorations primaire et secondaire.
11. Double-cliquez sur T Cell Décharger pour élargir la liste de déchargement. Mettez à jour le champ # d’Exportations par puce (y compris les blancs) au nombre souhaité d’exportations. Sauvegardez et ouvrez le nouveau flux de travail.

7. Charge de billes de capture de cytokines

1. Sonicez et/ou faites un vortex sur chaque fiole de perles pour resuspendre complètement les perles de capture. Déterminez la concentration de billes via un compteur cellulaire.
2. Ajustez la densité des billes à 4,5 x 10⁶ billes/mL (billes de type A) ou 4 x 10^{billes de 6} billes/mL (billes de type B) dans 30 μL de tampon de dilution des billes.
3. Stockez les suspensions à billes à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit invité à charger dans la baie de chargement des échantillons. Effectuez toutes les vérifications et continuez en cliquant sur Démarrer.
4. Lorsqu’il est demandé, mélangez la suspension de billes cytokinées avec une pipette de 20 μL et chargez la suspension à billes à l’emplacement d’importation approprié. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
5. Lorsqu’on le demande, inspectez visuellement plusieurs FOV pour vérifier que les billes de capture ont été chargées avec une distribution uniforme à travers les canaux fluidiques à une densité appropriée. Si la distribution et/ou la densité de charge étaient sous-optimales, sélectionnez Flush et Import pour tenter à nouveau le chargement par billes. Si la répartition et la densité de charge étaient suffisantes, sélectionnez Procéder pour commencer à faire des billes de pennage.
6. Répétez l’étape 7.3 pour chaque bille de capture de cytokines.

8. Charge de la cellule cible

1. Déterminer la densité cellulaire vivante de chaque lignée cellulaire cible via la coloration par bleu de Trypan.
   REMARQUE : Ce flux de travail suppose que les cellules cibles proviennent de cultures actives. Si des cellules cryopréservées doivent être utilisées à la place, assurez-vous que les cellules ont été cultivées pour au moins un passage après la décongélation et qu’elles sont viables à au moins 90 %.
2. Prélever 1 x 10⁶ cellules cibles dans un tube de microfuge de 1,7 mL. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes en RT. Aspirez le surnageant.
3. Résuspendez chaque pellet de cellule cible dans 100 μL de solution de coloration Annexin V. Incuber pendant 30 minutes en temps de réanimation, protégé de la lumière.
4. Ajouter 400 μL de tampon de liaison 1x Annexin V et resuspendre par pipetage. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes en RT. Aspirez le surnageant.
5. Resuspendez chaque pellet de cellule cible dans 250 μL de milieu de charge + CaCl₂. Stockez les suspensions de la cellule cible à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit invité à charger dans la baie d’échantillonnage.
6. Lorsqu’il est demandé, resuspendez les cellules cibles avec une pipette de 200 μL et chargez la suspension de la cellule cible à l’emplacement d’importation approprié. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
7. Lorsqu’on le demande, inspectez visuellement plusieurs champs de vision pour vérifier que les cellules cibles ont été chargées avec une distribution uniforme à travers les canaux fluidiques à une densité appropriée. Si la distribution et/ou la densité de charge étaient sous-optimales, sélectionnez Flush et Import pour recommencer à charger la cellule cible. Si la répartition et la densité de charge étaient adéquates, sélectionnez Procéder pour commencer le verrouillage TPS.
8. Lorsque vous le demandez, allez dans Opérations manuelles, puis cliquez sur TPS, et chargez le modèle TPS demandé.
9. Spécifiez le(s) filtre(s) optique(s) et les FOV à imager pour définir les portes TPS, puis cliquez sur Capturer uniquement pour initier l’acquisition d’image.
10. Ouvrez l’éditeur de configuration de portails, cochez la case à cocher pour Annexin, et sélectionnez le canal approprié pour la coloration Annexin V pour le paramètre X. Dans le menu déroulant, sélectionnez Journal (Luminosité médiane Delta). Sélectionnez OEP pour le paramètre Y. Dans le menu déroulant, sélectionnez Voisin le plus proche.
11. Faites glisser les coins de la porte résultante pour exclure^{les cellules basses} Annexin V et Nearest Neighbor, puis enregistrez le modèle TPS sans changer le nom du fichier.
12. Retournez dans Workflows et cliquez sur Continuer pour continuer à écrire des textes. Répétez les étapes 8.7-8.11 pour chaque lignée cellulaire cible.

9. Charge des cellules T

1. Déterminez la densité cellulaire vivante de chaque lignée de lymphocytes T via la coloration au bleu de Trypan.
   REMARQUE : Ce flux de travail suppose que les lymphocytes T proviennent de cultures actives. Si des cellules cryopréservées doivent être utilisées à la place, assurez-vous qu’elles ont été cultivées toute la nuit après le dégel et qu’elles sont viables à au moins 90 %.
2. Prélever 1 x 10⁶ cellules T dans un tube microfuge de 1,7 mL. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes en RT. Aspirez le surnageant.
3. Résuspendez chaque pellet de cellule cible dans 100 μL de solution de coloration Annexin V. Incuber pendant 30 minutes en temps de réanimation, protégé de la lumière.
4. Ajouter 400 μL de tampon de liaison 1x Annexin V et resuspendre par pipetage. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes en RT. Aspirez le surnageant.
5. Resuspendez chaque pellet de cellule T dans 250 μL de milieu de charge + CaCl₂. Stockez les suspensions à cellules T à 4 °C jusqu’à ce qu’on leur demande de charger dans la baie de chargement des échantillons.
6. Lorsque demandé, resuspendez les cellules cibles avec une pipette de 200 μL et chargez la suspension des cellules T à l’emplacement d’importation approprié. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
7. Lorsqu’on le demande, inspectez visuellement plusieurs FOV pour vérifier que les lymphocytes T ont été chargés d’une distribution uniforme à travers les canaux fluidiques à une densité appropriée. Si la distribution et/ou la densité de charge étaient sous-optimales, sélectionnez Flush et Import pour refaire la tentative de chargement des cellules T. Si la répartition et la densité de charge étaient adéquates, sélectionnez Procéder pour commencer le verrouillage TPS.
8. Lorsque vous le demandez, allez dans Opérations manuelles, puis cliquez sur TPS, et chargez le modèle TPS demandé.
9. Spécifiez le(s) filtre(s) optique(s) et les FOV à imager pour définir les portes TPS, puis cliquez sur Capturer uniquement pour initier l’acquisition d’image.
10. Ouvrez l’éditeur de configuration de portails, cochez la case à cocher pour Annexin, et sélectionnez le canal approprié pour la coloration Annexin V pour le paramètre X. Dans le menu déroulant, sélectionnez Journal (Luminosité médiane Delta). Sélectionnez OEP pour le paramètre Y. Dans le menu déroulant, sélectionnez Voisin le plus proche.
11. Faites glisser les coins de la porte résultante pour exclure^{les cellules basses} Annexin V et Nearest Neighbor, puis enregistrez le modèle TPS sans changer le nom du fichier.
12. Retournez dans Workflows et cliquez sur Continuer pour continuer à écrire des textes. Répétez les étapes 9.7-9.11 pour chaque lignée de lymphocytes T.

10. Dosage de cytotoxicité

1. Préparez un milieu de perfusion dans un tube conique de 50 mL en ajoutant 100 μL de réactif NucView 530 Caspase-3 prédécongelé à 20 mL de milieux T (concentration stock 1 mM, concentration finale 5 μM).
2. Lorsqu’on le demande, échangez le tube conique approprié dans les emplacements de la soute de réactifs par le tube conique préparé contenant le milieu de perfusion. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
   REMARQUE : 20 mL de milieux de perfusion suffisent à perfuser une seule puce optofluidique pendant 24 heures. Préparez un milieu de perfusion supplémentaire si le test de cytotoxicité doit durer plus de 24 heures.
3. Si désiré, interrompez toute étape restante de l’analyse de cytotoxicité après 14 heures en cliquant sur Sauter le reste de l’imagerie TPS et poursuivez le flux de travail.

11. Dosage de phénotype et de cytokines

1. Préparez la solution primaire de coloration dans un tube microfuge de 1,7 mL en mélangeant 76 μL d’anticorps multiplex de détection du panneau CD8/NK humain et 4 μL d’anti-CD137_BV421.
2. Mélangez en pipettant et conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’on vous invite à charger. Lorsqu’on le demande, mélangez la solution primaire de coloration avec une pipette de 20 μL et chargez à l’endroit d’importation approprié. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.
3. Préparez la solution secondaire de coloration dans un tube microfuge séparé de 1,7 mL en mélangeant 72 μL de 1x DPBS avec 8 μL du kit multiplex SA-PE.
   REMARQUE : La solution de coloration secondaire doit être préparée à l’avance, de sorte qu’elle soit prête à être chargée dès que la coloration primaire est terminée.
4. Mélangez en pipettant et conservez à 4 °C jusqu’à ce qu’on vous invite à charger. Lorsqu’on le demande, mélangez la solution secondaire de coloration avec une pipette de 20 μL et chargez dans le lieu d’importation approprié. Cliquez sur l’icône Courir pour continuer.

12. Analyse des essais

1. Naviguez jusqu’au bureau et ouvrez le logiciel Analyseur d’essai . Sélectionnez Analyseur d’essai, sélectionnez Workflows, puis sélectionnez le type de workflow à analyser.
2. Utilisez tous les critères souhaités pour définir les stylos d’intérêt à décharger. Générez la liste de déchargement selon les critères souhaités, puis revenez au logiciel CAS et sélectionnez Continuer le flux de travail sélectionné.
3. Vérifiez que cette case pour la liste Créer l’exportation avec Assay Analyzer pour : [ID de puce optofluidiques] est coché.

13. Décharger

1. Préparez une plaque à fond rond de 96 puits avec 50 μL de média T-cell par puits. Cliquez sur Continuer pour procéder au déchargement de la cellule.
2. Lorsqu’on le demande, ouvrez la baie de chargement des copes, ouvrez le couvercle du nid et retirez la puce optofluidique. Placez la puce dans une boîte de Petri stérile, avec le bord supérieur de la puce optofluidique surélevé >1° pour empêcher les cellules de sortir des stylos. Conserver dans un incubateur stérile de culture tissulaire lors de l’étape suivante de rinçage.
3. Placez une puce Flush stérile dans le nid vide, fermez le couvercle du nid, puis fermez la baie à puces. Cliquez sur Terminé puis sur Continuer.
4. À la demande, ouvrez la baie de chargement des puces, ouvrez le couvercle du nid, et retirez la puce Flush. Replacez la puce optofluidique dans le nid vide, fermez le couvercle du nid, puis fermez la baie à puces. Cliquez sur l’icône de course pour continuer.
5. Lorsqu’on le demande, sélectionnez Ouvrir pour afficher le menu Charger/Décharger la plaque du puits . Cliquez sur Décharger pour retirer la plaque précédente. Mettez à jour l’identifiant de la plaque et le type de plaque de puits, sélectionnez Charge, puis sélectionnez Terminé.
6. Cliquez sur Continuer pour procéder au déchargement de la cellule. Une fois tous les stylos désirés déchargés, allez dans le service Opérations manuelles et ouvrez la soute à puces pour récupérer la plaque contenant les cellules d’intérêt.

Results

En utilisant le protocole décrit, nous avons contesté des cellules T CAR simulées (CAR) et c-Jun surexprimées avec des cellules tumorales de la Figure 3 K562 antigène-négatives ou positives à antigènes positifs, ou les avons laissées non stimulées (cellules T uniquement). Les cellules cibles ont été évaluées pour leur expression homogène de l’antigène comme condition préalable à des résultats reproductibles (Figure supplémentaire 3). Grâce à leur isolement dans des nanopens simples, nous avons pu caractériser les profils d’expression des cytokines de ces cellules comme producteurs simples, doubles ou triples, selon la condition testée (Figure 3). Ces résultats ont été vérifiés à l’aide de l’ELISA comme méthode établie pour la détection des cytokines (Figure supplémentaire 4).

Comme prévu, la majorité des lymphocytes T simulés nucléofectés sont restés négatifs pour les trois cytokines mesurées (TNF-α, IFN-γ et IL-2). Parmi les cellules CAR T standards, des producteurs de cytokines IFN-γ double, triple et simple positif, ainsi que de petites fractions de cellules sécrétentes de TNF-α et d’IL-2, ont été détectées lors d’un défi antigénique, tandis que l’exposition à des cellules tumorales antigène-négatives n’a pas induit de sécrétion multicellulaire de cytokines. Fait intéressant, la surexpression de c-Jun a augmenté la proportion de producteurs de doubles et triples cytokines, ainsi que de cellules sécrétent une seule cytokine, lors de la rencontre de la cible, réduisant ainsi la fraction globale de cellules cytokines négatives par rapport aux cellules CAR T standards. Ces résultats sont cohérents avec les rapports précédents décrivant la modulation phénotypique des cellules CAR T par l’expression forcée de ce facteur^{de transcription 6}. Notamment, nous avons observé une plus grande proportion de cellules IFN-γ positives dans le groupe uniquement de cellules T que dans le groupe de cellules tumorales antigènes négatives, ce qui pourrait être dû au nombre plus faible de cellules analysées dans cette condition.

Pour approfondir l’activation des lymphocytes T, nous avons évalué l’expression de CD137 dans des cellules T CAR CAR surexprimées par des nucléoféctées simulées, CAR et c-Jun traitées comme décrit ci-dessus (Figure 4 et Tableau supplémentaire 1). La mise en question des cellules CAR T avec des cellules cibles K562 exprimant des antigènes a entraîné une augmentation de l’expression de CD137 par rapport aux cellules faussement nucléofétées. De plus, nous avons observé une tendance vers une fraction légèrement plus élevée de cellules CD137 positives chez les cellules CAR surexprimant c-Jun par rapport au produit CAR standard.

En conclusion, le protocole décrit a permis d’évaluer la sécrétion et l’activation des cytokines CAR T au niveau unicellulaire, permettant d’identifier les producteurs de cytokines unicellulaires et multicellulaires et de récapituler les tendances phénotypiques précédemment décrites au niveau⁶ de la masse.

Figure 1 : Flux de travail schématique pour le profilage multimodal via une plateforme optofluidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images représentatives des différentes fonctionnalités des plateformes optofluidiques. (A) Importer la séquence de particules individuelles dans des stylos individuels via OEP. Les stylos de la partie gauche des images ont été chargés dans la séquence précédente. (B) Des événements de mort dans trois enclos individuels au fil du temps, montrant des cellules tumorales exprimant des antigènes exprimant des antigènes en GFP. (C) Exportation d’une cellule individuelle à partir d’un stylo via OEP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Analyse représentative des profils de sécrétion de cytokines au niveau unicellulaire. Des lymphocytes T ou CAR-T individuelles mock-nucléofectées ont été cultivées en présence ou en absence de cellules tumorales K562 antigène-négatives ou antigène-positives dans des nanopens contenant des billes de capture de cytokines pour TNF-α, IL-2 et IFN-γ. Les graphiques circulaires montrent les proportions de cellules CAR-T individuellement pennées analysées avec le profil de sécrétion de cytokines indiqué après 24 heures de co-culture (analyse des points finals). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Analyse représentative de l’expression de CD137 au niveau de la cellule unique. Des lymphocytes T ou cellules CAR-T simulées individuelles ont été colorées pour l’expression de surface CD137 sur la puce optofluidique, 24 heures après la culture en présence ou absence de cellules tumorales K562 antigène-négatives ou antigène-positives. Les graphiques de violon illustrent l’intensité de fluorescence de l’expression de CD137 sur les lymphocytes T et CAR-T faussés nucléofectés après 24 heures de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Composants du milieu T (Filtrés stériles à l’aide d’unités de filtration à vide 0,22μM)	Volume (concentration finale)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Pénicilline/Streptomycine (10,000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Mercaptoéthanol (50 mM)	0,5 mL (45μM)
Sérum humain (inactivé par la chaleur)	50 mL (9 %)
Supplément GlutaMAX (100x)	5 mL (0,9x)
Composants du milieu cellulaire tumoral	Volume (concentration finale)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Pénicilline/Streptomycine (10,000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Sérum fœtal pour veaux (inactivé par la chaleur)	50 mL (9 %)
Composants tampons MACS	Volume (concentration finale)
DPBS (Mg2+-libre, Ca2+-libre)	500 mL
Sérum fœtal pour veaux (inactivé par la chaleur)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Composants tampons PBS/EDTA	Volume (concentration finale)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Composants du média de chargement	Volume (concentration finale)
Milieu à cellules T	18 mL
Réactif de chargement	2 mL
Supports de chargement + composantsCaCl 2	Volume (concentration finale)
Chargement des médias	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Milieu de perfusion + substrat de caspase	Volume (concentration finale)
Milieu à cellules T	20 mL
Substrat Caspase-3 NucView 530 (1 mM en DMSO)	100 μL
Composants tampons à dilution à billes	Volume (concentration finale)
DPBS	800 μL
BSA (2 % en va-et-à-vers)	100 μL (0,2 % en v/v)
Préados-20 ans (10 % en travail/v)	10 μL (0,1 % en mousse/v)

Tableau 1 : Préparation des médias et des tampons.

Figure supplémentaire 1. Stratégie exemplaire de gating pour évaluer l’efficacité du transfert génétique avant l’enrichissement magnétique. Des graphiques de contour et d’histogrammes exemplaires illustrent la stratégie de gating pour identifier les cellules T CAR exprimant CAR (tEGFR-positives) après un transfert génique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2. Contrôle de pureté après le tri. Des diagrammes de contours exemplaires représentent une fraction de cellules CAR CAR positives (tEGFR-positives) après un tri magnétique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3. Expression d’antigènes sur les cellules tumorales ciblées. Des graphiques histogrammes représentatifs représentent les cellules tumorales WT K562 ou sont modifiées pour exprimer ROR1 colorées avec un anticorps isotype ou ciblant ROR1 via cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 supplémentaire. Détection de cytokines utilisant ELISA standard. Concentrations d’IL-2 et IFN-γ dans le surnageant après 24 heures de co-culture avec les cellules tumorales^{K562 ROR1} à un taux E :T de 4:1, mesuré via ELISA pour les cellules CAR vs CAR+cJ T (cellules CAR+cJ). Signification statistique déterminée par le test t non apparié avec *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Cellules analysées. Le tableau indique le nombre de cellules individuelles analysées par condition. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le flux de travail démontré permet d’évaluer le profil de sécrétion et d’activation des cytokines individuellement des cellules CAR-T lors de la co-culture avec des cellules cibles antigènes et antigènes négatifs, qui peuvent être éventuellement combinées à une évaluation de l’activité cytolytique. Bien que la capacité à capturer des données fonctionnelles multimodales à la résolution d’une seule cellule offre un moyen d’analyser la performance des cellules CAR T avec une précision sans précédent, la quantifiabilité des mesures dépend fortement de la précision de la technologie OEP pour charger le même nombre de billes de capture de cytokines, de cellules cibles et de cellules CAR-T dans chaque stylo. Il est donc crucial de s’assurer que la densité de charge et les critères TPS de chaque réactif ou échantillon de cellule soient optimisés pour permettre un chargement à bille unique et/ou cellule unique dans chaque stylo. Bien que l’adaptation de la concentration de la suspension à billes ou cellules dans les canaux fluidiques puisse permettre un chargement adéquat de la pénétration, les options Flush et Import de la plateforme servent de stratégie supplémentaire pour recommencer le processus de chargement.

Une caractéristique avantageuse de la conception de puces optofluidiques est la séparation de la disposition du stylet en 22 FOV distincts. En chargeant des cellules T conçues avec différentes constructions CAR dans différents champs de vision au sein de la puce optofluidique, nous avons également pu évaluer si une construction alternative imposant la surexpression de c-Jun pouvait améliorer la génération de cellules CAR-T à fonctionnalité multimodale, par rapport à une construction standard de CAR (Figure 3 et Figure 4). Ainsi, une plateforme optofluidique permet d’identifier rapidement les constructions candidates à la CAR susceptibles d’augmenter la durabilité de la rémission du cancer induit par les cellules CAR-T. Il est à noter que l’analyse de l’interaction entre cellules cibles et effectrices au niveau de la cellule unique exige un contrôle crucial de paramètres clés, par exemple l’hétérogénéité de l’expression de l’antigène cible sur les cellules tumorales et la pureté de la population de cellules CAR-T (Figure 2 et 3 Supplementary Figur).

Bien que nous nous soyons concentrés sur l’évaluation de la sécrétion d’IL-2, TNF-α et IFN-γ, la large gamme d’analytes solubles détectables avec des panels multiplex de capture de cytokines disponibles dans le commerce permet une personnalisation considérable du flux de travail. Les développements récents montrent que le domaine progresse également dans la direction de la cytométrie à flux de haute dimension, ouvrant de nouvelles possibilités de synergies avec le profilage fonctionnel de différents types de cellules^{immunitaires 12,13}. Par exemple, de futures applications pourraient impliquer des campagnes de dépistage visant à identifier les lymphocytes T régulateurs polyfonctionnels exprimant des CAR (Tregs). Celles-ci sécrètent plusieurs cytokines anti-inflammatoires telles que TGF-β et^IL-10-14. Ainsi, l’adaptabilité d’un système optofluidique pourrait ouvrir la voie à des connaissances cruciales à mesure que les immunothérapies cellulaires s’étendent à de nouveaux horizons dans le traitement des maladies non malignes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nucléofecteur 4-D	Lonza
Microperles anti-biotine	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
Kit d’isolation CD8+ T Cell	Miltenyi Biotec	130-096-495
Tubes coniques CELLSTAR de 15 ml (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
Tubes coniques CELLSTAR de 50 ml (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75 cm et sup2 ; Fiole de culture cellulaire à cou incliné en forme de U avec bouchon de bouchon	Corning	430720U
Plaques multiples à puits Costar 24 puits transparentes traitées par TC, enveloppées individuellement, stériles	Corning	3526
Plaques multiples à puits transparents Costar de 48 puits traitées TC, enveloppées individuellement, stériles	Corning	3548
DPBS, pas de calcium, pas de magnésium	Thermo Fisher	14190169
DynaMag-15 Aimant	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	pour la conjugaison interne (biotine)
Anticorps EGFR (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Sérum bovin fœtal, valeur	Thermo Fisher	A5256801
Supplément GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher	35050038
IL-2 IS humain, qualité premium	Miltenyi Biotec	130-097-748
Sérum humain	Deutsches Rotes Kreuz (DRK) / Croix-Rouge allemande (GRC)	N/A
Colonne de séparation des cellules MACS, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Kit de nucléofecteur X 4D à cellule primaire P3	Lonza	V4XP-3032
Pancoll humain, densité : 1,077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
Kit de détection d’apoptose PE Annexin V	BD Biosciences	559763
Pénicilline-Streptomycine (10,000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Kit de biotinylation et d’isolement de la surface cellulaire Pierce	Thermo Fisher	A44390
Kit de démarrage QuadroMACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, supplément Glutamax, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Pipettes sérologiques 2, 5, 10, 25 et 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Trypan Blue Stain (0,4 %)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  ; M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
&bêta ;-Mercaptoéthanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Réactifs de balises
Plaque à 96 puits à fond rond	Corning	3799
Puce Beacon Plastic Flush		500-00030
Solution nettoyante BLI, hypocloite sodique, 0,825 %	Bruker	520-08000
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Anticorps anti-humain Brilliant Violet 421 CD137 (4-1BB)	Biolégende	309820
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex IFN-& gamma humain ; Capture Beads B3, 13X	Biolégende	740545
LEGENDplex Humain IL-2 Capture Bead A5, 13X	Biolégende	740934
Anticorps de détection du panel TH humain LEGENDplex V02	Biolégende	741041
LEGENDplex Humains TNF-& alpha ; Capture Bead B7, 13X	Biolégende	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolégende	740452
Substrat Caspase-3 NucView 530, 1 mM en DMSO	Hö ; Izel	B-10406
OptoSelect Chip 3500	Bruker	500-12001
Azidée de sodium	Sigma-Aldrich	S2002
PRÉADOLESCENT 20	Sigma-Aldrich	P1379
Tampon d’exportation végane	Bruker	520-00040
Bouteilles VWR Media, carré, PETG, 125 ml	VWR	216-2265
Bouteilles VWR Media, carré, PETG, 500 ml	VWR	216-2267
Additif mouillant	Bruker	520-08016
Solution mouillante	Bruker	520-00009