Effets thérapeutiques de l’extrait d’Acorus calamus L. sur les lésions cutanées induites par les radiations dans un modèle de rat

Xiaodan Wu; Yanan Tong; Wenxuan Luo; Zhaomin Yao; Yusong Pei; Ying Zhan; Guoxu Zhang; Zhiguo Wang

doi:10.3791/69705

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Article de méthode

Effets thérapeutiques de l’extrait d’Acorus calamus L. sur les lésions cutanées induites par les radiations dans un modèle de rat

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DOI :

10.3791/69705

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9 janvier 2026

Xiaodan Wu¹ , Yanan Tong¹ , Wenxuan Luo² , Zhaomin Yao¹^,³ , Yusong Pei¹ , Ying Zhan¹ , Guoxu Zhang¹ , Zhiguo Wang¹

¹Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, ²College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, ³Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

Dans cet article

Résumé

Les lésions cutanées induites par les radiations sont une complication fréquente et grave de la radiothérapie chez les patients atteints de cancer. Il n’existe pas de traitement clinique efficace. Ce protocole évalue l’effet thérapeutique de l’extrait d’Acorus calamus L. sur les lésions cutanées induites par les radiations, dans le but de proposer de nouveaux candidats médicamenteux et des stratégies thérapeutiques pour sa prévention clinique et son traitement.

Résumé

Les lésions cutanées induites par les radiations sont une complication courante et invalidante dans le traitement du cancer, entraînant souvent un retard de la cicatrisation des plaies et un inconfort accru des patients. Il existe quelques médicaments thérapeutiques disponibles pour la prévention ou le traitement. La médecine traditionnelle chinoise, en particulier Acorus calamus L., a montré un potentiel pour traiter divers troubles cutanés, mais son efficacité dans les lésions cutanées induites par les radiations reste peu explorée.

Cette étude a utilisé un modèle de rat Sprague-Dawley exposé à 45 radiations Gy pour induire des lésions cutanées. Les rats ont été traités avec 10 %, 20 % et 40 % d’extrait d’Acorus calamus L. pendant 45 jours. La cicatrisation, l’inflammation, l’apoptose et l’angiogenèse ont été évaluées à l’aide des taux de cicatrisation, de l’analyse histopathologique, des mesures de cytokines, de la coloration TUNEL et de l’immunohistochimie. Le traitement par Acorus calamus L. a accéléré la cicatrisation des plaies, le groupe à dose moyenne montrant le taux de cicatrisation le plus élevé (88,97 % à 45 jours). L’analyse histopathologique a révélé une réduction de l’inflammation, une amélioration de l’organisation du collagène et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Les niveaux sériques de cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) ont été significativement réduits, et l’apoptose a été diminuée, avec une modulation des protéines apoptotiques clés (P53, Bax, Bcl-2). L’expression de VEGF et de bFGF a été augmentée, favorisant l’angiogenèse et la réparation tissulaire. Acorus calamus L. améliore la guérison des lésions cutanées induites par les radiations en réduisant l’inflammation, en inhibant l’apoptose et en favorisant l’angiogenèse. Ces résultats suggèrent son potentiel comme agent thérapeutique pour gérer les lésions cutanées induites par les radiations, offrant une alternative prometteuse pour gérer les lésions cutanées induites par les radiations en oncologie clinique. Des études supplémentaires sont nécessaires pour clarifier ses mécanismes moléculaires.

Introduction

Les lésions cutanées induites par les radiations sont une complication fréquente et difficile à la fois des accidents nucléaires et de la radiothérapie^{tumorale 1}. En radiothérapie, environ 95 % des patients développent un certain degré de lésions cutanées, notamment érythème, desquamation, ulcères nécrotiques récurrents, douleurs persistantes et un risque accru de progression^{maligne 2}. Ces lésions sont souvent réfractaires au traitement, réduisant considérablement la qualité de vie des patients et nécessitant parfois l’interruption de la radiothérapie, posant ainsi un défi clinique majeur en^{radio-oncologie 3}. Les mécanismes sous-jacents des lésions cutanées induites par les radiations sont complexes, impliquant principalement la production de radicaux libres dans les tissus cutanés, ce qui perturbe les processus cellulaires et aggrave le processus de^guérison ^4,5. Cela entraîne une expression prolongée de gènes liés à l’apoptose, des réponses inflammatoires dérégulées et des voies de signalisation modifiées, qui contribuent tous à la persistance des plaies induites^{par les radiations 6}.

Il n’existe actuellement aucune thérapie universellement reconnue pour les lésions cutanées induites par les radiations. La prise en charge clinique met l’accent sur des approches anti-inflammatoires ou^{antioxydantes 7}, notamment les corticostéroïdes topiques, qui réduisent les réactions cutanées par des effets anti-inflammatoires, immunosuppresseurs et vasoconstricteurs, mais peuvent entraîner un amincissement cutané avec une utilisation^{prolongée 8}. L’amifostine, un agent radioprotecteur approuvé par la FDA, est limitée en usage clinique en raison d’effets indésirables importants⁹. Les facteurs de croissance accélèrent la cicatrisation des plaies en favorisant la prolifération cellulaire, l’angiogenèse et la formation de tissu de granulation, mais leurs actions sont étroitement focalisées, offrent un contrôle limité sur les lésions et inflammations des tissus profonds, et comportent un risque d’hyperplasie^{excessive 7}. Par conséquent, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) a attiré l’attention par sa philosophie holistique, ses multiples constituants actifs aux effets thérapeutiques variés et son profil de sécurité favorable. Des études antérieures ont montré que des produits naturels, tels que l’extrait de réglisse, les polysaccharides d’aloès et la curcumine, soulagent l’inflammation induite par les radiations et les lésions tissulaires en éliminant les radicaux libres, en inhibant les médiateurs pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6) et en favorisant la prolifération des^fibroblastes 10,11,12. Cependant, la plupart de ces recherches examinent des composés actifs uniques ou des cibles uniques, fournissant une compréhension insuffisante des mécanismes d’action synergique multicomposante. Acorus calamus L., une plante bien connue pour ses propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes, antibactériennes et cicatrisatrices, a montré un potentiel dans divers troubles cutanés.

Acorus calamus L., une herbe vivace de la famille des Araneae, contient plusieurs composés bioactifs, notamment des terpènes, des phénylpropanoïdes, des flavonoïdes, des stéroïdes et des alcaloïdes. Sa composition multicomposante permet une action simultanée sur plusieurs cibles, produisant des effets pharmacologiques^{synergiques 13}. Des études montrent qu’il inhibe les voies de signalisation inflammatoires telles que le NF-κB et le MAPK, et que cela réduit l’expression de facteurs pro-inflammatoires tels que le TNF-α et l’IL-6 dépendante de la dose, tout en augmentant les activités d’enzymes antioxydantes telles que le SOD et le GSH-Px, exerçant ainsi des effets anti-inflammatoires, antioxydants et^{antibactériens14,15}. Malgré ses bienfaits documentés dans le traitement des affections cutanées causées par les infections et allergies, le rôle d’Acorus calamus L. dans les lésions cutanées induites par les radiations reste peu exploré. Des études récentes ont démontré ses effets protecteurs contre les dommages induits par les radiations, favorisant la cicatrisation des plaies et réduisant^{l’inflammation 13}. Cependant, les mécanismes thérapeutiques spécifiques d’Acorus calamus L. dans les lésions cutanées induites par les radiations n’ont pas été entièrement élucidés.

L’objectif global de cette étude est d’évaluer les effets thérapeutiques de l’extrait d’Acorus calamus L. dans des modèles animaux de lésions cutanées induites par les radiations. Nous évaluons la cicatrisation des plaies, les réponses inflammatoires et le comportement cellulaire afin d’élucider les mécanismes d’action de l’extrait sous plusieurs angles. Les résultats visent à établir une base théorique pour l’utilisation d’Acorus calamus L. dans la prise en charge clinique des lésions cutanées résultant de la radiothérapie cancéreuse. De plus, l’étude présentera les caractéristiques fonctionnelles de l’extrait, les scénarios d’intervention appropriés et les données d’efficacité de base afin d’aider les lecteurs à juger si cette approche basée sur le produit naturel complète leurs besoins de recherche ou cliniques. En fin de compte, ce travail recherche des options thérapeutiques efficaces pour améliorer la qualité de vie des patients recevant une radiothérapie tumorale.

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Protocole

Les expériences animales décrites dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche médicale animale de l’Hôpital général du Northern Theater Command (Numéro d’approbation éthique : 2018-03). Des rats mâles SD de grade SPF (6-8 semaines, poids 190-220 g) ont été utilisés pour l’étude. Les détails des réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Hébergement des animaux expérimentaux

Sélectionnez 108 rats mâles SD avec SPF, âgés de 6 à 8 semaines et pesant entre 190 et 220 g.
Maintenir la température de la pièce à 22 ± 2 °C, une humidité relative à 50 ± 5 %, et un cycle clair-obscur de 12 h. Permettre aux rats d’avoir un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Après une semaine d’acclimatation, procédez aux expériences de suivi.

2. Regroupement des animaux

Répartissez aléatoirement les rats en cinq groupes distincts : groupe normal (Normal, n = 18), Groupe modèle (Modèle, n = 18), groupes de médicaments positifs (Positif, n = 18, crème de bétaméthasone⁾¹⁶, groupe expérimental à faible dose (Expérimental-L, n = 18), groupe expérimental à dose moyenne (Experimental-M, n = 18), et groupe expérimental à dose élevée (Experimental-H, n = 18). À l’exception du groupe normal, tous les groupes ont été exposés aux radiations.

3. Établir un modèle animal de lésions cutanées radioactives

Administrez une anesthésie avec précision et un inconfort minimal grâce à une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution pentobarbitale sodique à 1 % (40 mg/kg). Confirmez la profondeur de l’anesthésie en observant l’absence du réflexe cornéen et l’absence de réponse au pincement des orteils. Appliquez une pommade sur les yeux du rat pour éviter la sécheresse.
Enlève les poils du dos des rats avec un rasoir électrique. Ensuite, désinfectez la zone du dos avec de l’iode et de l’alcool à 75 %.
Placez chaque rat en position couchée. Fixez l’irradiateur ³²P-β (taux de dose de surface : 0,9 Gy/min) sur la région spinale bilatérale (2 cm × 2 cm de surface) centrée de 1 cm latéralement par rapport à la ligne médiane, afin que la source entre en contact avec l’épiderme sans espace. Fixez l’applicateur avec du ruban médical stérile pour éviter le déplacement lors de l’irradiation. Irradiez la zone cutanée cible pendant 50 minutes pour atteindre une dose totale absorbée de 45 Gy¹⁷.
Une fois que le rat reprend conscience après irradiation, il est replacé dans sa cage individuelle, en assurant un accès à l’eau et à la nourriture à volonté et en maintenant une température à 22 ± 2 °C, une humidité relative à 50 ± 5 %, et un cycle clair-obscur de 12 h.
REMARQUE : Le processus expérimental doit respecter strictement les principes établis de protection biologique et radioactive du travail. De plus, toutes les procédures opérationnelles doivent suivre des directives pour une élimination correcte et conforme des déchets médicaux et radioactifs afin d’assurer la sécurité et la santé de tout le personnel impliqué.

4. Préparation de l’extrait d’Acorus calamus L. et administration des médicaments

Peser les rhizomes d’Acorus calamus L., assurer un nettoyage approfondi, laisser sécher à l’air libre, puis broyer en poudre grossière (maille 40). Incorporez 10 à 20 volumes d’éthanol à 50 % et homogénéisez à température ambiante pendant 24 heures
Après avoir laissé l’extrait se déposer pendant 30 minutes, décantez le surnageant et effectuez une filtration préliminaire à travers 4 à 8 couches de gaze pour éliminer les impuretés grossières. Ensuite, filtrez avec du papier filtrant, puis évaporez le filtrat sous pression réduite dans un évaporateur rotatif à 50-60 °C pour récupérer le solvant, ce qui donne un résidu solide sans solvant (AE, teneur en humidité < 5 %).
Préparation de la pommade anti-décharge¹⁸
REMARQUE : Formulez des pommades d’extrait d’Acorus calamus L. à 10 % (Expérimental-L, à l’a/n), 20 % (Expérimental-M, à la fois à 10 % (Expérimental-H, à la fois à la fois à la Pharmacopée chinoise édition 2020 (Chapitre général 0109⁾¹⁹.
1. Pesez avec précision l’AE (par exemple, 20 g pour une pommade à 20 %) et le pétrolatum de qualité pharmaceutique correspondant (par exemple, 80 g pour une pommade à 20 %).
2. Ajoutez 10 % du pétrolatum total à l’AE, triturez vigoureusement pendant 5 minutes pour former une pâte homogène (méthode de dilution géométrique, garantissant une dispersion uniforme de l’AE dans la base lipophile).
3. Faites fondre le reste du pétroliatum à 60 °C, refroidissez à 55 °C, puis ajoutez lentement à la pâte AE-pétrolatum.
4. Remuez magnétiquement à 250 tr/min pendant 30 minutes à 55 °C, puis remuez continuellement tout en refroidissant à température ambiante pour obtenir une pommade lisse et sans particules.
5. Préparation de contrôle à blanc : faire fondre le pétroliatum à 60 °C, remuer à 250 tr/min pendant 30 minutes, puis refroidir à température ambiante (identique à la base de la pommade AE).
6. Conservez toutes les pommades et pétrolatum vierge à 4 °C dans des contenants stériles fermés.
Tous les groupes ont reçu des agents administrés localement deux fois par jour à 09h00 et 17h00 pendant 45 jours consécutifs après irradiation (le groupe normal, non irradié, a reçu le même schéma d’administration synchrone). La dose appliquée était de 0,2 g/cm², répartie uniformément sur une surface de peau dorsale de 2 cm × 2 cm. Le groupe normal recevait le véhicule (pétrolatum), et le groupe de modèles recevait le véhicule (pétrolatum). Le groupe témoin positif a reçu une crème de bêtaméthasone. Les groupes expérimentaux L, M et H ont reçu des crèmes contenant respectivement 10 %, 20 % et 40 % (mois/mère). Après chaque application, la zone traitée était doucement massée pendant 10 secondes pour améliorer l’absorption, et les rats étaient retenus pendant 5 minutes pour éviter qu’ils ne soient léchés.

5. Collecte de tissu cutané et de sang de rats

Anesthésiez les rats à l’aide d’une solution de pentobarbital sodique à 1 % (40 mg/kg, i.p.). Désinfectez les instruments chirurgicaux et excisez la peau le long de la zone de la plaie.
Fixez une partie du tissu dans 4 % de paraforméldéhyde (10 mL), une autre portion dans du glutaraldéhyde/tétroxyde d’osmium (5 mL, 2,5 %), et conservez le reste dans de l’azote liquide pour une analyse approfondie (voir le tableau des matériaux).
Prélève des échantillons de sang de l’aorte abdominale du rat. Centrifugeuse à 3 000 × g à 4 °C pendant 15 minutes ; aspirer le surnageant dans des tubes EP ; aliquote et conserver à -80 °C.

6. Évaluation de la guérison

Observez la blessure les 7e, 15e, 30e et 45e jours après l’irradiation et prenez des images de la surface de la plaie avec une caméra haute définition. Importez les images dans ImageJ et dessinez la zone de la plaie le long du bord de la plaie. Calculez la surface dans l’image. Assurez-vous que chaque opération est cohérente pour éviter les erreurs de mesure. Calculez le temps de cicatrisation et le taux de cicatrisation.
REMARQUE : Taux de cicatrisation des plaies ( %) = (Zone irradiée initiale - Zone de plaie non cicatrisée) / Zone irradiée initialement. Critères de cicatrisation : La cicatrisation complète est définie soit comme une zone croûtée < 5 % de la surface de la plaie, soit une zone cicatrisée > 95 % de la surface de la plaie. Zone irradiée initiale : la surface de la plaie mesurée au moment où les animaux irradiés présentaient une plaie stable (une ligne de base).

7. Examen par microscopie électronique

Prélèvement rapide et fixation des tissus
1. Utilisez une lame tranchante pour exciser un bloc de tissu cutané mesurant 1 mm³, englobant la couche épiderme-derme.
2. Immergez immédiatement l’échantillon dans un tampon phosphate de glutaraldéhyde pré-refroidi à 2,5 % (0,1 M, pH 7,4) à 4 °C pendant 24 heures pour fixation.
Lavage des tampons
1. Effectuez trois lavages avec 0,1 M de phosphate tampon (pH 7,4), en laissant 15 minutes pour chaque lavage.
Post-fixation
1. Transférez l’échantillon vers une solution de tétroxyde d’osmium à 1 % à 4 °C pour une fixation durant 1,5 h.
Déshydratation du gradient
1. Passez progressivement par des concentrations d’acétone de 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, en allouant 15 minutes à chaque étape.
2. Répétez le traitement avec de l’acétone à 100 % trois fois, chaque immersion durant 10 minutes.
Incrustation en résine époxy
1. Faites tremper l’échantillon dans un mélange 2:1 d’acétone et de résine époxy pendant 2 heures, suivi d’une immersion nocturne dans de la résine époxy pure.
2. Polymériser l’échantillon à 60 °C pendant 48 heures pour former un bloc solide.
Coupe et teinture
1. Produire des sections ultrafines de 70 nm à l’aide d’un ultramicrotome.
2. Teindre avec de l’acétate d’uranium pendant 15 minutes, puis avec du citrate de plomb pendant 5 minutes à 60 °C.

8. Coloration à l’hématoxyline-éosine (HE)

Effectuer l’intégration de paraffine
1. Exciser des échantillons cutanés, déshydrater avec un gradient d’alcool (par exemple, 70 %, 80 % et 95 % d’éthanol, chacun pendant 15 minutes, suivi de deux changements d’éthanol à 100 %, chacun pendant 15 minutes), puis transféré au xylène jusqu’à ce que le tissu atteigne un état translucide.
2. Plongez dans la paraffine pour assurer l’immersion, puis laissez la solidification.
Effectuez le décirage et la réhydratation
1. Immergez les sections de paraffine dans le xylène I/II pendant 10 minutes chacune.
2. Rincez le xylène avec 100 % d’éthanol, puis plongeez dans 95 % d’éthanol pendant 3 minutes, 80 % d’éthanol pendant 3 minutes, 70 % d’éthanol pendant 3 minutes, et enfin rinçez à l’eau distillée.
Conduire la coloration nucléaire à l’hématoxyline
1. Faites tremper dans la solution d’hématoxyline de Harris pendant 7 minutes à température ambiante.
2. Rincez sous l’eau courante pendant 10 minutes jusqu’à ce que la coloration bleue apparaisse.
Différenciation des implémentaires et contre-coloration
1. Différenciez en utilisant de l’acide chlorhydrique à 1 % dans l’éthanol pendant 3 secondes (observez la clarté nucléaire au microscope).
2. Contre-teinte avec une solution d’ammoniac à 0,5 % pendant 30 secondes.
Effectuer une contre-coloration à l’éosine
1. Coloration avec une solution d’éosine à 0,5 % (contenant 1 % d’acide acétique glaciaire) pendant 90 s.
2. Rincez rapidement à l’eau distillée pendant 5 secondes pour enlever l’excès de tache.
Effectuez la déshydratation et le nettoyage
1. Passer séquentiellement par 70 %, 80 %, 95 %, 100 % éthanol I/II (1 min chacun).
2. Clarifiez avec du xylène I/II pendant 2 minutes chacun.
Appliquez le scellement et l’observation
1. Appliquez de la résine neutre dans le sens des gouttes, puis couvrez avec une couche de revêtement.
2. Laissez sécher dans un four à 60 °C pendant 30 minutes avant un examen microscopique.

9. Coloration trichrome de Masson

Effectuez un décirage de routine similaire à la teinture avant l’HE.
Coloration nucléaire
1. Faites tremper dans une solution d’hématoxyline pendant 10 minutes.
2. Rincez sous l’eau courante pendant 5 minutes jusqu’à ce que la teinte bleutée soit rétablie.
Coloration des fibres de collagène
1. Immergez dans un mélange d’Alizarin Red et de Fuchsine acide pendant 5 minutes.
Différenciation des acides phospholybdiques
1. Transférez dans une solution aqueuse acide phospholybdique à 1 % pendant 1 minute.
Contre-coloration des myofibres
1. Transférez directement dans une solution bleue d’aniline à 2,5 % pendant 5 minutes.
2. Rincez rapidement avec une solution aqueuse d’acide acétique glaciaire à 0,5 % pendant 5 secondes.
Déshydratation et montage
1. Exécutez la déshydratation par gradient d’éthanol : 95 % d’éthanol I, 100 % d’éthanol II (30 s chacun).
2. Clear avec du xylène.
3. Monter avec une résine neutre, sécher à 60 °C, puis examiner au microscope.

10. Détection ELISA des niveaux d’IL-1β, IL-6 et TNF-α

REMARQUE : IL-1β, IL-6 et TNF-α sont des cytokines pro-inflammatoires importantes, couramment utilisées pour évaluer à la fois la présence et l’intensité de l’inflammation. Surveiller leurs niveaux est crucial pour mieux comprendre les processus inflammatoires et déterminer l’efficacité des traitements anti-inflammatoires.

Préparez des échantillons de sérum
1. Suivez le protocole détaillé à l’étape 5.3 pour prélever des échantillons de sérum.
Étalons et échantillons dilués
1. Créer une dilution de gradient des étalons en utilisant le diluant de l’échantillon ; Diluez les échantillons de sérum dans un ratio de 1:4.
Ajoutez des échantillons et incubez
1. Introduire 100 μL de l’étalon/échantillon dans chaque puits ; couvrir les puits d’une membrane ; incuber à 37 °C pendant 90 minutes ; Ensuite, jetez le liquide et séchez les puits jusqu’à l’assèchement.
Détection de la réaction anticorps-enzyme
1. Dispenser 100 μL de réactif marqué par enzyme spécifique à IL-1β, IL-6 et TNF-α dans chaque puits ; incuber à 37 °C pendant 60 minutes ; retirer le liquide et sécher ; Lavez la plaque quatre fois avec 200 μL de tampon de lavage.
2. Ajouter 100 μL de solution de travail streptavidine-HRP (dilution 1:100) à chaque puits ; incuber à 37 °C dans le noir pendant 30 minutes ; Lavez la plaque quatre fois avec 200 μL de tampon de lavage.
Développer la couleur et terminer
1. Introduire 100 μL de solution de substrat TMB dans chaque puits ; incuber à température ambiante dans le noir pendant 10 minutes ; ajoutez ensuite 50 μL de solution d’arrêt à chaque puits.
Données lues
1. Mesurez l’absorbance à 450 nm (avec une longueur d’onde d’étalonnage de 630 nm) à l’aide d’un lecteur immunosorbant lié à une enzyme dans les 30 minutes ; calculer la concentration (pg/mL) en utilisant la courbe standard.

11. Dosage TUNEL

Prétraitement de la section
1. Le dewax et la déshydratation de la paraffine jusqu’à ce qu’ils atteignent de l’eau distillée.
2. Introduire une solution active de protéinase K à une concentration de 20 μg/mL, puis incuber à 37 °C pendant 20 minutes.
3. Lavez les sections trois fois avec du PBS, chaque lavage durant 2 minutes.
Réaction de marquage
1. Appliquez le mélange de réaction TUNEL contenant l’enzyme TdT et le dUTP marqué à la fluorescéine.
2. Incubez dans une chambre humidifiée à 37 °C dans le noir pendant 60 minutes.
Conversion du signal
1. Lavez trois fois avec du PBS, en laissant 5 minutes à chaque lavage.
2. Introduisez un anticorps anti-fluorescéine marqué par HRP à une dilution de 1:500.
3. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
Développement chromogénique du DAB
1. Après le lavage par PBS, appliquez une solution chromogénique DAB et surveillez le développement au microscope pendant 1 à 3 minutes.
2. Arrêtez la réaction avec de l’eau distillée.
Contre-teinture et montage
1. Contre-coloration des noyaux avec de l’hématoxyline pendant 1 minute.
2. Déshydrater avec de l’éthanol gradué, clarifier avec du xylène et monter avec une résine neutre.
Interprétation des résultats
1. Identifier les noyaux apoptotiques comme brun-jaunâtre, tandis que les noyaux normaux apparaissent bleus.
2. Sélectionnez aléatoirement cinq champs de haute puissance (400×) par diapositive pour calculer le taux d’apoptose.

12. Coloration immunohistochimique

Décirage et récupération d’antigènes
1. Faites tremper des sections de paraffine dans Xylène I pendant 10 minutes, puis transférez sur Xylène II pendant encore 10 minutes. Ensuite, déshydratez avec une série d’éthanol gradient, commençant par 5 min dans 100 % d’éthanol I, puis 5 min en 100 % d’éthanol II, 3 minutes chacun avec 95 %, 80 % et 70 % d’éthanol, puis enfin rincez avec de l’eau distillée pendant 2 minutes.
2. Effectuer une réparation thermique haute pression avec un tampon de citrate de sodium de 0,01 M à pH 6,0, en maintenant une température de 121 °C pendant 3 minutes.
Bloquer l’interférence endogène
1. Introduisez_{une solution à} 3 %_H2O2 à température ambiante pendant 10 minutes pour inactiver les enzymes endogènes.
2. Appliquez une solution bloqueuse à 5 % de BSA sur le tissu et incubez dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 45 minutes ; Aspirez tout excès de solution bloqueante sans rincer.
Incubation des anticorps
1. Administrez une solution bloqueante à 5 % de BSA et incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
2. Ajouter la solution principale d’action des anticorps à la concentration optimisée (par exemple, P53, Bax, Bcl-2, VEGF et bFGF) et incuber toute la nuit dans une chambre humidifiée à 4 °C ; laver trois fois avec un tampon PBS-T contenant 0,1 % Tween-20 pendant 5 minutes chacun.
3. Introduire un anticorps secondaire marqué par HRP dilué 1:200 ; incuber dans une chambre humidifiée à 37 °C pendant 60 minutes ; Laver trois fois avec un tampon PBS-T pendant 5 minutes chacune. Ensuite, ajoutez la solution conjuguée ABC et incubez à 37 °C pendant 30 minutes, suivis de trois lavages avec PBS buffer pendant 5 minutes chacun.
Développement des couleurs DAB
1. Ajoutez une solution de développement DAB contenant 0,02 % de H₂O₂ et surveillez le développement au microscope à température ambiante pendant 1 à 4 minutes.
2. Arrêtez immédiatement la réaction avec de l’eau distillée.
Contre-teinture et montage
1. Immergez l’échantillon dans la solution d’hématoxyline de Harris pendant 1 minute et rincez sous l’eau courante pendant 10 minutes pour obtenir la récupération bleue.
2. Immergez séquentiellement dans les solutions suivantes : 70 % d’éthanol pendant 30 secondes, 80 % d’éthanol pendant 30 secondes, 95 % d’éthanol pendant 30 secondes, 100 % d’éthanol I pendant 1 minute, et 100 % d’éthanol II pendant 1 minute.
3. Pour un nettoyage complet et une fixation, immergez dans le xylène I pendant 2 minutes, puis transférez dans le xylène II pendant 2 minutes. Ajoutez un montage en résine neutre en position verticale, couvrez avec un cache-cache, et laissez sécher dans un four à 60 °C pendant 30 minutes.
Quantification des résultats
1. Une couleur brune indique une réaction positive ; les signaux positifs (brun-jaunâtre) doivent être contrastés avec le fond négatif.
2. Utilisez le logiciel Image-Pro Plus pour calculer le pourcentage de cellules positives sur au moins 5 champs de vision.

13. Détection du Western blotting

Préparation de la lyse tissulaire
1. Introduire du tissu cutané liquide gelé à l’azote dans un mortier en acier inoxydable pré-refroidi à -80 °C ; ajouter progressivement de l’azote liquide par trois incréments pour réduire la vaporisation ; meuler verticalement jusqu’à ce que toutes les particules ne soient plus visibles ; transférer la poudre résultante dans un tube EP contenant un tampon de lyse.
2. Incorporer un inhibiteur de protéase (1:100) et un inhibiteur de phosphatase (1:50) ; vortex sur la glace pendant 30 secondes ; conduire la perturbation ultrasonore ; incuber à 4 °C dans un incubateur secoué pendant 2 heures ; centrifugeuse à 4 °C, 14 000 × g pendant 20 minutes ; aspirez soigneusement le surnageant.
Quantification et traitement des protéines
1. Distribuer 5 μL du surnageant dans une plaque à 96 puits ; ajouter 200 μL de solution de travail BCA ; incuber à 37 °C dans le noir pendant 30 minutes ; mesurer l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques ; Déterminer la concentration selon la courbe standard.
2. Combiner le tampon de 5× Réduction de la Charge Protéique avec la solution protéique à un ratio 4:1 ; dénature en le plaçant dans un bain-marie bouillante pendant 15 minutes ; Conserver à -20 °C pour une utilisation future.
Électrophorèse SDS-PAGE
1. Préparez un gel dénouant l’acrylamide à 12 % ; versez le gel jusqu’à ce qu’il atteigne 1 cm sous les dents du peigne ; couvrez d’isopropanol pour éviter l’exposition à l’air ; après la solidification, retirer l’isopropanol ; Verser un gel concentré à 4 % ; insérer un peigne à 15 puits ; laisser la solidification à température ambiante pendant 30 minutes ; ajouter 5 μL de marqueur protéique pré-coloré au puits de chargement 1 ; ajouter 20 μL de lysat blanc au puits 2 ; ajouter 10 μL d’échantillon contenant 40 μg de protéines dans chaque puits de 3 à 14.
2. Initier l’électrophorèse à 80 V ; passer à 120 V lorsque le bleu de bromophénol migre dans le gel séparateur ; maintenir une température de 10 à 15 °C avec une circulation d’eau glacée ; Faites courir jusqu’à ce que le bleu de bromophénol atteigne 0,5 cm du fond du gel.
Procédure de buvage humide
1. Préparer un tampon de transfert contenant 20 % de méthanol ; pré-refroidissement à 4 °C. Activez la membrane PVDF en l’immergeant dans le méthanol pendant 1 minute ; équilibrer la membrane NC en tampon. Montez la colle-filtre de transfert dans cet ordre : « Plaque cathodique - Tampon éponge - Papier filtre - Gel - Membrane - Papier filtre - Tampon éponge - Plaque d’anode » ; enlever soigneusement toute bulle avec un rouleau ; définir les paramètres selon le poids moléculaire de la protéine cible : pour les protéines < 50 kDa, utiliser un transfert de tension constante à 100 V pendant 60 minutes ; pour des protéines de 50 à 100 kDa, appliquer un transfert de courant constant à 250 mA pendant 90 minutes ; pour les protéines > 100 kDa, effectuer un transfert de courant constant à 300 mA pendant 120 minutes ; se connecte à un bain-marie circulant de 4 °C.
Procédure d’immunodétection
1. Après le transfert, immergez la membrane PVDF dans le méthanol pendant 1 minute ; laver trois fois avec TBST pendant 5 minutes chacun ; recouvrir la surface de la membrane avec 3 % de H₂O₂/TBST ; incuber à température ambiante dans le noir pendant 15 minutes ; aspirer le liquide ; ajouter une solution de blocage à 5 % de BSA/TBST ; bloquer pendant 1 h dans un incubateur à secouage à 37 °C ; Lavez la membrane trois fois avec TBST pendant 5 minutes chacune.
2. Ajouter la solution principale d’activité des anticorps (comme P53, Bax, Bcl-2, VEGF et bFGF) ; incuber toute la nuit à 4 °C dans un incubateur secouant ; laver la membrane quatre fois avec TBST pendant 10 minutes chacune ; ajouter un anticorps secondaire marqué par HRP ; incuber sur un incubateur secouant à température ambiante pendant 90 minutes ; Laver la membrane six fois avec TBST + 0,5 % SDS pendant 8 minutes chacune.
Imagerie chimiluminescence
1. Mélanger des volumes égaux de solutions ECL A et B ; recouvrir uniformément la surface de la membrane ; laisser la réaction se produire dans l’obscurité pendant 60 secondes ; aspirer tout excès de liquide ; fixer un temps d’exposition unique entre 1 et 5 s pour les protéines signal fortes ; effectuer une exposition cumulative en cinq segments (10/30/60/120/300 s) pour les protéines faibles du signal ; Capturez des images à l’aide d’un imageur chimiluminescence.
Flux de travail d’analyse de données
1. Quantifier les protéines à l’aide du logiciel ImageJ ; établir un seuil uniforme de soustraction de fond ; calculer le rapport en niveaux de gris entre la protéine cible et la protéine de référence (β-actine ou GAPDH)
2. Importez les données dans GraphPad Prism pour analyse.

14. Analyse statistique

Présenter les données par moyenne ± erreur standard de moyenne. Utiliser des échantillons indépendants des tests t pour comparer entre deux groupes, et utiliser l’ANOVA unidirectionnelle pour les comparaisons entre plusieurs groupes.
Analysez les données en utilisant SPSS 26.0 et GraphPad Prism 8.0.2.
Considérons P < 0,05 comme indicateur de différences statistiquement significatives.

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Résultats

Effet thérapeutique d’Acorus calamus L. sur les lésions cutanées induites par les radiations
15 jours après l’irradiation, tous les groupes de rats présentaient une pelure sèche, une rougeur localisée, un gonflement, des ulcères et des croûtes. À 30 jours après l’irradiation, le groupe modèle a montré les lésions cutanées les plus sévères, avec des croûtes et des ulcères au site irradié atteignant leur pic. À 45 jours, le groupe de modèles a montré une chute minimale de croûtes, et la plaie a montré u...

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Discussion

Les lésions cutanées induites par les radiations restent l’une des complications les plus courantes et les plus complexes en radiothérapie clinique contre le cancer. En tant que plus grand organe et première cible des radiations, la peau est sensible aux dommages causés par les radicaux libres et les espèces réactives de l’oxygène produites par les radiations, ce qui peut altuer les fonctions cellulaires, notamment la division cellulaire, la migration et la différenciation, entraînant fi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Plan conjoint du Plan scientifique et technologique de la province du Liaoning (projet de mise à l’eau technique) (2024JH2/102600273) et par le projet de recherche indépendant de l’hôpital général du théâtre du Nord (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de fixation au paraformaldéhyde à 4 %	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), Chine	P0099
Extrait d’Acorus calamus L.	Préparé en interne	N/A ;	; Le protocole de préparation détaillé est décrit à la section 4 du protocole.
Anticorps anti-Bax & nbsp ; ;	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine)	GB11690
Anticorps anti-Bcl-2	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine)	GB113375
Anticorps anti-bFGF	Proteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, Chine)	11234-1-AP
Anticorps anti-P53 & nbsp ;	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine)	GB111740
Anticorps anti-VEGF ;	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine)	GB111971
Kit de test protéique BCA & nbsp ;	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine)	G2026-200T
Crème de la bététamésone	; United Pharmaceutical Co., Ltd. (Chine)	N/A ;	Concentration : 0,1 % en v/ Approbation nationale du médicament n° : H19994057
Éthanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	E111991	Utilisé comme solvant d’extraction pour l’extrait d’Acorus calamus L.
Système d’imagerie en gel et blot	Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, États-Unis)	ChemiDoc MP
Kit de coloration à l’hématoxyline-éosine	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pékin, Chine) & nbsp ; ;	G1120
HRP conjugué IgG anti-lapin de chèvre (H+L)	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine)	GB23303
Microscope à fluorescence inversée	Olympus Corporation (Tokyo, Japon)	IX83 ; ;
Masson' s Kit de teinture trichrome	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pékin, Chine) & nbsp ; ;	G1340
Lecteur de microplaques (pour la détection d’absorbance, de fluorescence et de luminescence)	Dispositifs moléculaires (San Jose, CA, États-Unis)	SpectraMax iD3
pétrolatum	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Chine)	N/A ;	; Pétrolatum blanc de qualité pharmaceutique ; Point de fusion : 45-60 degrés ; C ; Approbation nationale du médicament n° : H31022350
Rat IL-1 & bêta ; ELISA Kit & nbsp ; ;	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), Chine	PI303
Rat IL-6 ELISA Kit & nbsp ; ;	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), Chine	PI328
Rat TNF-& alpha ; ELISA Kit & nbsp ; ;	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), Chine	PT516
Kit de détection d’apoptose à cellules TUNEL (DAB)	Beyotime Biotech Inc (Beyotime), Chine	C1091

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