Analyse de l’ADN microbien sur le terrain à l’aide d’un kit d’extraction biologique et d’une unité qPCR de terrain

Summary

Des formes fiables et précises d’analyse ADN déployable sur le terrain sont cruciales pour de nombreux secteurs. Cet article propose deux méthodes d’analyse microbienne environnementale sur le terrain : 1) l’isolement de l’ADN microbien à partir d’échantillons environnementaux à l’aide d’un kit d’extraction biologique sur le terrain, et 2) l’analyse de l’ADN via l’unité qPCR de champ.

Abstract

À mesure que la PCR quantitative (qPCR) est adoptée plus largement dans les industries, la capacité d’extraire et d’analyser l’ADN en milieu isolé sans obstacles logistiques devient essentielle. Un exemple clair est la nécessité d’outils simples pour quantifier les bactéries dégradant les contaminants dans les sites isolés affectés par des déraillements de trains ou des rejets de pétrole, permettant une évaluation rapide des risques et de l’impact environnemental. Pour y parvenir de manière fiable, les procédés doivent être portables et légers, conviviaux pour les non-scientifiques, résistants à la contamination et capables d’obtenir des résultats rapides tout en maintenant un contrôle qualité rigoureux. Bien que des options pour l’extraction des acides nucléiques et l’analyse qPCR en dehors du laboratoire existent depuis des années, ce n’est que récemment que les avancées technologiques ont permis le développement de systèmes déployables sur le terrain capables de performances fiables et précises. Dans cette étude, nous démontrons l’utilisation d’un kit d’extraction d’ADN de terrain associé à des instruments qPCR portables dans des conditions environnementales réalistes. Des essais sur le terrain menés à des températures extérieures ambiantes d’environ 30 °C ont démontré des rendements d’ADN et des efficacités d’amplification comparables à ceux obtenus en laboratoire contrôlé. Il est important de noter que les résultats obtenus sur le terrain ont démontré une sensibilité et une reproductibilité équivalentes, confirmant que les flux de travail portables peuvent fournir des données de haute qualité sans avoir besoin d’infrastructures de laboratoire conventionnelles. Ces résultats mettent en lumière le potentiel d’analyses moléculaires décentralisées qui étendent la portée de la qPCR à des environnements éloignés et limités en ressources, tout en maintenant la précision et la fiabilité requises pour la prise de décision.

Introduction

Lorsqu’on considère les analyses de biologie moléculaire, comme la qPCR, il existe plusieurs limites à la gestion des échantillons. Un exemple clair est la demande d’outils simples et fiables pour quantifier les bactéries dégradant les contaminants sur des sites isolés touchés par des déraillements de trains ou des rejets de pétrole, en soutenant une évaluation rapide des risques et impacts environnementaux 1,2,3,4,5. La principale limitation est que, peu importe à quel point vous gardez l’échantillon froid, les communautés microbiennes peuvent (et vont) évoluer au^{fil du temps 6,7}. Pour garantir que les données reflètent fidèlement l’environnement d’origine d’où les échantillons ont été prélevés, il est recommandé d’extraire l’ADN de ces échantillons dans un délai de^24h8. Pour un ingénieur collectant des échantillons microbiens sur une plateforme pétrolière offshore, ou un scientifique au cœur d’une forêt tropicale, cette chronologie n’est pas réalisable. Obtenir un échantillon d’eau ou de sol de l’un de ces endroits isolés à une compagnie maritime dans la même journée, puis l’envoyer en laboratoire avec nuit (tout en maintenant la réfrigération), où l’ADN peut ensuite être extrait avant analyse, est tout simplement impossible.

Une fois l’ADN extrait, l’horloge s’arrête, et l’intégralité de l’information génétique de l’échantillon est préservée indéfiniment grâce à des techniques de stockage^{appropriées 9}. Cela rend l’ADN extrait incroyablement unique comparé à la grande majorité des échantillons chimiques, métallurgiques et biologiques – dont la plupart ont une durée de conservation limitée. L’ADN archivé peut être récupéré des années ou des décennies plus tard et analysé pour de nouvelles cibles sur de nouvelles plateformes. Pour cette raison, il est crucial que l’ADN extrait représente véritablement la communauté microbienne d’origine, et non celle modifiée par un transit retardé.

De plus, l’exigence d’un laboratoire pour extraire et analyser les échantillons limite fortement la flexibilité et la cohérence des programmes d’échantillonnage. Le coût logistique seul peut être prohibitif pour certains^{projets 10}. La capacité d’analyser des échantillons, de quantifier avec précision des cibles génétiques d’intérêt en quelques heures, voire quelques minutes après l’échantillonnage, ouvre de nombreuses portes à des projets environnementaux à travers le monde.

Protocol

REMARQUE : Le protocole suivant a été réalisé à l’aide d’un kit Bio-Extract (kit d’extraction biologique sur le champ) et du FieldQuant qPCR (qPCR basé sur le champ).

1. Prélèvement de biomasse à partir des eaux souterraines et protocole d’isolement de l’ADN utilisant un filtre encapsulé et un kit de terrain d’extraction biologique

1. Portez des gants et des lunettes de sécurité pour toutes les étapes de l’étape 1.
2. Préparez la pompe péristaltique et la tubulure et purgez le puits en utilisant une purge en volume standard, en suivant les directives¹¹ d’échantillonnage des eaux souterraines de l’Agence de protection de l’environnement (EPA).
3. Retirez le filtre encapsulé, l’adaptateur, la pince et les bouchons du tube centrifugeuse fourni (Figure 1).
4. Faites passer le tube (1/4-5/16 de diamètre intérieur [I.D.]) à travers la pince fournie et serrez la pince pour fixer le tuyau à l’adaptateur de verrouillage (Figure 2).
5. Fixez l’entrée du filtre à l’adaptateur Luer-Lock installé à l’étape précédente.
6. Placez le filtre dans un récipient récepteur afin que la quantité d’eau filtrée puisse être mesurée avec précision.
7. Filtrez jusqu’à 1 L d’eau à faible débit (<0,5 L/min). La quantité d’eau filtrée varie selon la turbidité de l’eau.
   1. Si le filtre se bouche avant que 1 L ne soit filtré, arrêtez-vous et continuez à l’étape suivante.
      REMARQUE : L’analyse ADN est sensible et peut être réalisée avec aussi peu que 10 mL, selon la biomasse du système.
8. Enregistrez manuellement le volume qui a traversé le filtre en millilitres (mL). Jetez l’eau filtrée.
9. Bouchez le filtre aux deux extrémités. Assurez-vous que l’extrémité la plus fine est fermée avec le bouchon rouge et que l’extrémité la plus épaisse est fermée avec le bouchon Luer-Lock blanc.
10. Remettez le filtre dans le tube en plastique fourni.
11. Apposez l’étiquette sur le tube de centrifugeuse et notez la quantité d’eau qui a traversé le filtre, l’emplacement, la date de prélèvement et les analyses demandées. Conserver à 1-4 °C jusqu’à l’extraction.
    REMARQUE : Les filtres doivent être extraits dans les 24 heures suivant l’échantillonnage.
12. En utilisant les lingettes de préparation à alcool fournies, nettoyez une surface plane qui peut servir à l’extraction (par exemple, une planche en bois, un hayon de camion, etc.)
13. Pour extraire l’ADN, disposez tous les composants du kit de champ d’extraction biologique sur la surface plane et propre (Figure 3).
    1. Débouchez les deux extrémités du filtre et mettez les condensateurs de côté pour les utiliser plus tard. Trouvez et ouvrez l’une des seringues de 3 mL incluses dans le kit. Aspirez de l’air dans la seringue de 3 mL et connectez-la au filtre via la connexion de verrouillage du luer.
    2. Poussez l’air hors de la seringue pour évacuer l’eau restante du filtre. Déconnectez la seringue et aspirez plus d’air avant de répéter.
    3. Répétez plusieurs fois, en veillant à ce que le plus d’eau possible soit expulsée du filtre. Rebouchez le bouchon rouge de la sortie.
14. Inversez la seringue Solution A fermée plusieurs fois pour vous assurer qu’elle est bien mélangée. Retirez le bouchon de la seringue à verrouillage de luer.
15. Connectez la seringue Solution A à l’entrée du filtre encapsulée de 0,2 μm via la pointe à verrouillage du luer et ajoutez lentement toute la Solution A en appuyant sur le plunger. Pousser trop vite peut provoquer une pression arrière, alors veillez à baisser lentement la ventouse. Si le bouchon du filtre empêche l’ajout de la solution A, retirez le bouchon rouge de sortie du filtre et réessayez. Rechargez le filtre.
16. Secouez vigoureusement le filtre fermé pendant 5 minutes.
    REMARQUE : Pour éviter la fatigue, plusieurs échantillons peuvent être préparés à cette étape, et tous peuvent être serrés à la main en même temps. Si disponible, un mélangeur vortex rechargeable peut être utilisé pour effectuer cette étape plutôt que de faire la poignée de main.
17. Inversez la seringue de solution B fermée plusieurs fois pour vous assurer qu’elle est bien mélangée. Retirez le bouchon de verrouillage de la seringue.
18. Retirez le bouchon d’entrée du filtre encapsulé. Connectez la seringue de la Solution B à l’entrée du filtre encapsulé via la pointe de verrouillage du luer et ajoutez lentement toute la Solution B en appuyant sur le plunger. Pousser trop vite peut provoquer une pression arrière, alors veillez à baisser lentement la ventouse. Rebouchez le bouchon d’entrée du filtre.
19. Secouez vigoureusement le filtre fermé pendant 5 minutes.
    REMARQUE : Pour éviter la fatigue, plusieurs échantillons peuvent être préparés à cette étape et tous serrés à la main en même temps. Si disponible, un mélangeur vortex rechargeable peut être utilisé pour effectuer cette étape plutôt que de faire la poignée de main.
20. Retirez le bouchon d’entrée.
21. Avec le filtre inversé, poussez 1 mL d’air dans le filtre à l’aide d’une seringue de 3 mL fixée à l’unité de filtration encapsulée, puis tirez sur le piston pour retirer autant que possible le lysat (liquide).
    REMARQUE : Si le lysat est particulièrement visqueux, il peut être nécessaire de pousser et tirer plusieurs fois sur le ventouse pour retirer la solution du filtre.
22. Ajoutez le lysat à un tube de billes de 5 mL. Bouchez le tube et scellez-le avec du parafilm sur le dessus.
23. Secouez vigoureusement le tube pendant 5 minutes. Placez le tube droit tout en continuant les marches.
    REMARQUE : Pour éviter la fatigue, plusieurs échantillons peuvent être préparés à cette étape, et tous peuvent être serrés à la main en même temps. Si disponible, un mélangeur vortex rechargeable peut être utilisé pour effectuer cette étape plutôt que de faire la poignée de main.
24. Tout en évitant la contamination du dessus du papier aluminium, placez la cartouche de préparation de l’échantillon sur une surface plane.
25. Retirez la seringue de 1 mL de son emballage et vissez la colonne verrouillable par luer à l’extrémité de la seringue. Utilisez la pointe pointue de la colonne pour percer deux trous dans la première section de la cartouche de préparation de l’échantillon.
    ATTENTION : Certaines parties de la cartouche contiennent des sels chaotropes et/ou de l’éthanol. Portez des gants et des lunettes de sécurité.
26. À l’aide d’une pipette volumétrique en plastique, transférez 1 mL de lysat (liquide uniquement, évitez autant que possible de transférer les billes) du tube à billes vers le trou fraîchement perforé de la première section de la cartouche de préparation de l’échantillon. Pour de meilleurs résultats, ajoutez lentement le lysat légèrement incliné lors de la pipetation dans le trou du papier aluminium.
27. Insérez la colonne de seringues dans la section rouge de la cartouche. Aspirez complètement le liquide dans la seringue puis poussez-le vers l’extérieur. Effectuez cette action de pompe 10 fois.
28. Poussez tout le liquide hors de la seringue et remettez-le dans la section rouge de la cartouche avant de passer à l’étape suivante. Aucun liquide ne doit être transféré d’une section à une autre – cela s’applique à chaque étape restante du protocole d’isolement de l’ADN de l’échantillon.
29. Positionnez la pointe pointue de la colonne de seringues au-dessus de la section rouge-orangée et percez deux trous à travers la barrière en aluminium. Utilisez le ventouse pour tirer le volume complet de la seringue jusqu’à tout le haut de la seringue et pompez complètement vers l’extérieur. Répétez cette étape une fois pour un total de 2 pompes, en poussant tout le liquide vers l’extérieur. Ne transférez aucun liquide à l’étape suivante.
30. Placez la pointe pointue de la colonne de seringues au-dessus de la section orange et percez deux trous à travers la barrière en aluminium. Utilisez le plongeur pour aspirer tout le volume de fluide de la seringue dans la seringue et pomper complètement vers l’extérieur. Ne transférez aucun liquide à l’étape suivante.
31. Positionnez la pointe de la colonne de seringues au-dessus de la section jaune et perforez deux fois à travers la barrière en aluminium. Utilisez le plongeur pour aspirer tout le volume de fluide de la seringue dans la seringue et pomper complètement vers l’extérieur. Ne transférez aucun liquide à l’étape suivante.
32. Positionnez la pointe de la colonne de seringue au-dessus de la section bleue à sécher à l’air et ne percez la barrière en aluminium qu’une seule fois. Utilisez le piston pour aspirer tout le volume d’air de la seringue dans la seringue et pompez rapidement à nouveau. Répétez rapidement cette action de pompage au moins 20 fois jusqu’à ce que la colonne semble sèche.
33. Positionnez la pointe de la colonne de seringues au-dessus de la dernière section verte et percez deux fois la barrière en aluminium. Utilisez le plongeur pour aspirer tout le volume de fluide de la seringue dans la seringue et pomper complètement vers l’extérieur. Répétez cette étape pour un total de 5 pompes.
34. À l’aide de la seringue de 1 mL et de la colonne de préparation de l’échantillon, transférez toute la solution de la section verte dans un microtube de 1 mL bien marqué – c’est l’échantillon d’ADN extrait sur le terrain. Conservez à 1 à 10 °C (par exemple, dans une glacière avec des poches de glace, ou au réfrigérateur, etc.) pendant une semaine, ou jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Pour un stockage à long terme, les échantillons d’ADN peuvent être conservés à -20 °C indéfiniment.

2. Protocole d’analyse qPCR basé sur le champ utilisant une unité qPCR de terrain

REMARQUE : L’instrument qPCR basé sur le terrain et le téléphone qui contrôle l’instrument reposent sur des piles rechargeables. Assurez-vous que les deux sont bien chargés avant de vous rendre sur le terrain.

1. Placez jusqu’à trois échantillons d’ADN extraits sur le terrain dans les emplacements purs du plateau. Assurez-vous qu’il y ait un échantillon par section : un échantillon aux emplacements 1, 2 ou 3, un échantillon aux emplacements 4, 5 ou 6, et un échantillon aux emplacements 7, 8 ou 9.
2. Placez les bandes de test pour chaque échantillon dans les emplacements correspondants A, B ou C sur le plateau. Alignez le premier puits sur la bande avec la première fente sur le plateau.
3. Déverrouillez le téléphone et ouvrez l’application nommée d’après l’instrument qPCR déposé. Le téléphone et l’unité qPCR de terrain sont connectés via un sans-fil intégré à courte portée. Lorsque l’application s’ouvre, appuyez sur le bouton Démarrer Exécuter .
   REMARQUE : L’application est préchargée sur le téléphone inclus et ne peut être téléchargée ailleurs.
4. À l’écran suivant, appuyez sur le bouton Générer des IDs .
5. Cet écran suivant est l’endroit où les informations d’échantillon pour chaque échantillon sont saisies ; tapez sous Sample ID et tapez le nom de l’échantillon.
   1. Tapotez les unités d’échantillon et sélectionnez l’unité de volume appropriée pour le type d’échantillon utilisé lors de l’extraction (grammes [g], millilitres [mL], ou écouvillons).
   2. Ensuite, tapoter sous la quantité et le type de l’échantillon en quantité utilisée lors de l’extraction sur le terrain ci-dessus (par exemple, des millilitres d’eau filtrés). Répétez ce processus pour les deux échantillons restants.
   3. Lorsque la saisie des informations d’échantillon pour tous les échantillons est terminée, appuyez sur le bouton continuer .
      REMARQUE : Si vous utilisez moins de 3 échantillons, laissez l’identifiant de l’échantillon par défaut, sélectionnez n’importe quelle unité, et tapez un 1 dans la ligne de quantité d’échantillon pour que les échantillons inutilisés puissent avancer.
6. À l’écran suivant, tapez sur le dossier. Passez à l’écran suivant et appuyez sur enregistrer dans le dossier actuel.
7. À l’écran suivant, tapez un nom de course et appuyez sur confirmer.
8. Allumez l’instrument en maintenant le bouton d’alimentation , situé en haut à gauche de l’instrument, jusqu’à ce que toutes les lumières à l’avant de l’instrument soient allumées (~5 s). Ensuite, appuyez sur confirmer dans l’application pour continuer.
9. Sur l’écran suivant, appuyez sur connecter via le sans fil intégré à courte portée. Appuyez sur le bouton sans fil intégré à courte portée (un symbole connu et déposé) sur le dessus de l’instrument jusqu’à ce que la lumière bleue commence à clignoter. Appuyez sur confirmer et attendez que l’application et l’instrument se synchronisent ensemble. Une fois synchronisées, appuyez sur le nom de l’instrument dans l’application pour le sélectionner, puis appuyez sur le bouton de connexion pour charger les bandes d’essai.
   REMARQUE : Si l’instrument et l’application ne se synchronisent pas la première fois, assurez-vous que la lumière sans fil intégrée à courte portée de l’instrument clignote toujours et appuyez à nouveau sur scanner.
10. Avant de retirer les bouchons des bandes d’essai, vérifiez que les granulés lyophilisés ne sont pas en haut des puits de test. Si c’est le cas, faites doucement un petit coup sur le fond du puits pour faire tomber le granule plus bas dans le puits.
11. Retirez les bouchons des tubes de bande de sortie pour le premier échantillon. Ajoutez 18 μL d’eau stérile au premier puits de la bande de test et pipetez doucement de haut en bas pour dissoudre la pellete. Répétez pour les deux puits restants.
12. Ajoutez 2 μL de l’échantillon à chaque puits et scellez les tubes en insérant un ensemble de bouchons de bande de test en caoutchouc dans les tubes, les encoches entre les bouchons faisant face à l’arrière du plateau. Répétez les étapes 2.10-2.12 pour les échantillons restants si nécessaire. Une fois que toutes les bandes d’essai ont été remplies et scellées avec des bouchons à bandes, appuyez sur confirmer dans l’application.
13. Retirez chaque bande de test une à une et vérifiez la présence de bulles au fond des puits. S’il y a des bulles au fond de l’un des puits, balancez doucement la bande d’avant en arrière jusqu’à ce que les bulles remontent vers le sommet du puits. Une fois tous les puits vérifiés, appuyez sur confirmer dans l’application et commencez à charger les bandes dans l’instrument.
14. Ouvrez le couvercle de l’instrument et placez les bandes d’essai dans l’instrument qPCR de champ dans le même ordre et orientation qu’elles sont sur le plateau, de sorte que les charnières du puits et les encoches entre les condensateurs soient orientées vers l’arrière de l’instrument. Une fois toutes les bandes ajoutées, poussez doucement le couvercle vers le bas jusqu’à ce qu’il se verrouille et appuyez sur confirmer.
15. Appuyez sur le bouton start-run dans l’application.
    REMARQUE : La course commencera et prendra ~45 minutes à compléter en utilisant des conditions de course prédéfinies. Ces conditions ne sont pas modifiables.
16. Lorsque la course se termine, tapez sur les résultats de l’email. Une fois le téléphone connecté au Wi-Fi, les résultats seront envoyés pour analyse et report ; Jusqu’à ce moment-là, les résultats sont stockés sur l’instrument.
    1. Une fois connecté au Wifi, l’utilisateur devra appuyer à nouveau sur le bouton d’envoi pour envoyer les résultats.
17. Nettoyez le plateau entre les passages pour éviter la contamination entre les échantillons.
    REMARQUE : La sortie est un fichier Excel contenant les valeurs de seuil de cycle (Ct) pour chaque puits. Ces résultats sont envoyés au laboratoire, qui vérifie la qualité de l’amplification et convertit les valeurs de Ct en abondances à l’aide de courbes standard validées spécifiques à chaque cible qPCR et basées sur le volume et la matrice de l’échantillon original. Ces résultats sont envoyés à l’utilisateur sous forme de livrable électronique ainsi qu’en PDF.

Results

L’extraction d’ADN à partir d’échantillons environnementaux représentatifs a été réalisée à la fois à l’aide du kit de terrain d’extraction biologique et d’une méthode de laboratoire hautement validée précédemment^{décrite 4}. Comme montré à la Figure 4, la réussite de l’isolement de l’ADN à l’aide du kit de terrain a été confirmée lors de la comparaison des résultats de qPCR à une méthode d’extraction en laboratoire hautement validée. Cette cohérence confirme que la méthode a préservé l’intégrité de l’ADN des échantillons environnementaux sur le terrain.

Les composants du kit qPCR de champ sont présentés à la Figure 5. L’analyse d’une dilution en culture standard de Dehalococcoides (DHC) à l’aide de l’unité qPCR de champ a été réalisée à la fois en intérieur (21 °C) et en extérieur (30 °C) afin d’illustrer la robustesse de l’instrument dans des conditions réelles de terrain. Les résultats, visibles à la Figure 6, mettent en évidence la faible écartation pour 10 répétitions différentes de chaque. Pour contexte complet, le DHC est un organisme capable de dégrader les solvants chlorés et est couramment quantifié via qPCR dans l’industrie de la réhabilitation^{environnementale 4}.

Pour valider la précision des instruments, le DHC a été analysé à trois concentrations différentes à l’aide de dix instruments qPCR de champ réalisés en duplication (Figure 7). Même à faibles abondances, l’écart type relatif est resté faible (inférieur à 5 %) sur toutes les courses. Notez que, comparé à l’écart-type, l’écart type relatif est important pour les données logarithmiques car il normalise les résultats via l’équation suivante :

Où RSD est l’écart-type relatif, σ est l’écart-type de l’ensemble de données, et μ est la moyenne de l’ensemble de données.

Ensemble, les deux méthodes de cet article fournissent des résultats reproductibles à travers des extractions de champs réplicés et des tests qPCR. L’accord entre les extractions de terrain et de laboratoire et l’analyse qPCR démontre que des données fiables et de haute qualité peuvent être obtenues sans dépendre de l’infrastructure du laboratoire, permettant ainsi de réaliser des analyses microbiennes dans des environnements éloignés ou aux ressources limitées.

Figure 1 : Composants du kit de filtres encapsulés. Le filtre encapsulé est utilisé pour filtrer la biomasse à partir de l’échantillon d’eau. En se connectant à une pompe péristaltique par un tuyau, l’eau est poussée à travers le filtre. Après avoir noté le volume total d’eau, l’eau est rejetée et la biomasse collectée sur le filtre est prête à être extraite par ADN. Composants : a. tube stérile qui maintient le filtre et les composants avant et après utilisation, b. bouchon d’entrée, c. collier de tuyau, d. adaptateur de connexion de tubes à verrouillage de leur, e. filtre encapsulé, f. bouchon de sortie en caoutchouc. Image utilisée avec la permission de Microbial Insights, ^Inc.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Connexion filtre et tuyau. Le tube est poussé sur l’adaptateur de connexion de tubage à verrouillage Luer et maintenu en place à l’aide du collier de tuyau. L’autre extrémité du tuyau est reliée à une pompe péristaltique (cette connexion et le fonctionnement de la pompe ne sont pas dans le cadre de ce protocole). Image utilisée avec la permission de Microbial Insights, ^Inc.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Composants du kit d’isolation ADN. Tous les composants sont stériles avant utilisation. Les composants comprennent : (1) kit de filtrage encapsulé (voir Figure 1 pour plus de détails), (2) seringue de 3 mL, (3) seringue de 1 mL préchargée avec la solution A, bouchonnée, (4) 1 mL de seringue préchargée de solution B, bouchonnée, (5) seringue de 3 mL, (6) tube à billes en silicone, (7) seringue de 1 mL équipée de colonne d’isolement, (8) pipette de transfert jetable de 1 mL, (9) cartouche de préparation d’échantillons d’isolation ADN, (10) tube microcentrifuge de 1,5 mL. Non illustré : des carrés de parafilm pour sceller lors du secouage, et des lingettes de préparation à l’alcool utilisées pour nettoyer la surface utilisées lors de l’extraction. Image utilisée avec la permission de Microbial Insights, ^Inc.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Comparaison d’extraction sur le champ à partir d’échantillons réels. Résultats comparatifs de qPCR d’ADN isolé à partir de deux échantillons représentatifs à l’aide d’une méthode de laboratoire (barres rouges) par rapport au kit d’extraction biologique (barres bleues). Ces analyses n’ont pas été analysées en réplication, comme on pourrait s’y attendre dans une analyse qPCR standard. Les cibles génétiques (axe x) montrent une abondance (axe y) dans un ordre de grandeur pour les deux méthodes. Les informations sur chaque cible génique spécifique ne sont pas incluses car elles ne relèvent pas du champ de cet article. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Instrument et composants qPCR basés sur le terrain. Les composantes comprennent : A. L’instrument qPCR basé sur le terrain, le plateau de préparation des échantillons B., la bande de test C. contenant des réactifs lyophilisés, le téléphone D. préchargé avec l’application utilisée pour exécuter l’instrument. Image utilisée avec la permission de Microbial Insights, ^Inc.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Démonstration de la robustesse de la qPCR sur le terrain. La norme Dehalococcoides (DHC) a été analysée en dix répliques sous des conditions de température extérieure (30 °C, barres rouges) et intérieure (21 °C, barres bleues), mettant en lumière la fiabilité de l’instrument sur le terrain. Le numéro de la série de réplique est indiqué le long de l’axe des x et l’abondance calculée des DHC est indiquée selon l’axe des y. La moyenne intérieure (20 °C) était calculée à 4,92 × 10² cellule/mL, écart = 1,14 × 10² cellules/mL (n = 10), et la moyenne extérieure (30 °C) était calculée à 5,89 × 10² cellules/mL, écarté = 1,80 × 10² cellule/mL (n = 10). Les mesures obtenues à 20 °C et 30 °C n’ont pas différé de manière significative (test t de Welch, p = 0,17). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Démonstration de la précision qPCR de champ. Performance de précision entre 10 instruments différents, exécutés en double à trois concentrations standard différentes. La vraie valeur et le nombre de réplication (n = 2 pour 10 instruments à chaque concentration standard) sont indiqués le long de l’axe des x, avec des barres colorées spécifiques à l’unité de champ. L’axe des y montre l’abondance calculée pour chaque exécution. Le pourcentage d’écart-type relatif pour chaque concentration standard est indiqué dans les lignes pointillées au-dessus des barres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Une caractéristique essentielle de ce protocole est qu’il permet l’extraction d’ADN microbien et l’analyse qPCR dans des conditions de terrain sans nécessiter d’infrastructures de laboratoire ni d’électricité¹². La méthode a été optimisée pour équilibrer portabilité et fiabilité, offrant des résultats reproductibles cohérents avec les flux de travail en laboratoire même lorsqu’elle est réalisée en extérieur dans une plage de températures^{ambiantes 12}. La plage d’utilisation suggérée est de 4 °C à 95 °C (39 °F à 104 °F), et la comparaison côte à côte à des températures extérieures standard (30 °C, 86 °F) pour une équipe de terrain montre une cohérence fiable (Figure 6). Cette cohérence est essentielle pour garantir que les résultats de terrain soient interprétables en parallèle avec les ensembles de données de laboratoire.

Plusieurs étapes sont cruciales pour le succès du protocole. Lors du processus d’extraction, l’élimination complète du liquide des filtres et un mélange approfondi des réactifs sont essentiels pour assurer une lyse efficace et une récupération de l’ADN. De même, un transfert soigneux du lysat dans la cartouche de préparation de l’échantillon tout en minimisant le transfert de billes est essentiel pour éviter l’obstruction ou la défaillance de la colonne. Les stratégies de dépannage incluent le ralentissement de la dépression des pistons pour réduire la contre-pression et le pompage répété de la seringue si des lysats visqueux entravent le mouvement du fluide. Pour la qPCR, éviter les bulles dans les puits d’essai et assurer une resuspension complète des granulés sont essentiels pour une amplification précise.

Malgré ses avantages, la méthode présente des limites. Les rendements d’ADN peuvent être inférieurs à ceux obtenus avec des kits de centrifugation de laboratoire sur établi, et des échantillons très turbides ou riches en organique peuvent mettre en difficulté les performances en colonne. Bien que les kits d’isolement soient simples et faciles à utiliser pour tous – y compris pour les utilisateurs sans expérience préalable en laboratoire – il existe un risque d’erreur supplémentaire lorsqu’on compare une personne inexpérimentée sur le terrain. De plus, bien que l’unité qPCR de champ fournisse des résultats rapides, elle est limitée à un nombre limité de réactions simultanées (actuellement limitées à 9 cibles géniques par exécution) comparé aux thermocycleurs standards. Ces limitations sont cependant compensées par la rapidité d’analyse et la capacité à capturer les profils des communautés microbiennes sur le terrain. Il n’y a pas de limitation inhérente aux cibles qPCR pouvant être analysées, à part le catalogue du laboratoire qui propose l’unité.

L’importance de cette méthode réside dans sa capacité à mobiliser des analyses moléculaires, permettant la surveillance en temps réel des populations microbiennes dans des environnements tels que les champs pétrolifères, les sites agricoles ou les écosystèmes isolés. En préservant l’intégrité de l’ADN au moment de l’échantillonnage et en générant des résultats sur place, cette approche réduit les barrières logistiques, améliore la qualité des données et permet une prise de décision rapide. Les applications futures peuvent inclure la surveillance des agents pathogènes en santé publique, le suivi des progrès de la bioremédiation ou l’évaluation des risques microbiens dans les systèmes aquatiques. Avec des modifications mineures, la plateforme peut être continuellement adaptée pour des cibles moléculaires supplémentaires et des tests qPCR émergents.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes en silicium 5/16"	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Des modèles alternatifs peuvent être acceptables
Refroidisseurs	Agrafes (www.staples.com)	24299978	Des modèles alternatifs peuvent être acceptables
Kit de terrain d’isolation de l’ADN	Microbial Insights, Inc.  ;	https://microbe.com/bio-extract/	Propriétaire
Unité qPCR de terrain avec accessoires	Microbial Insights, Inc.  ;	https://microbe.com/fieldquant/	Propriétaire
Gants	Amazon (www.amazon.com)	Cela dépend de la taille	Des modèles alternatifs peuvent être acceptables
Filtres d’eaux souterraines	Microbial Insights, Inc.  ;	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Glace	Épicerie locale	NA
Pompe péristaltique Kamoer DIP1500 24 V 1500 mL/min de haut	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Des modèles alternatifs peuvent être acceptables
Pinces à bec aigu	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Des modèles alternatifs peuvent être acceptables
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