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Article de méthode

Isolement et purification des vésicules extracellulaires végétales provenant des feuilles d’Arabidopsis à l’aide d’une méthode optimisée de collecte par lavage apoplastique

1.1K vues

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DOI :

10.3791/69715

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24 mars 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour isoler les vésicules extracellulaires (EV) des feuilles d’Arabidopsis thaliana afin de soutenir des analyses moléculaires et fonctionnelles en aval.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (EV) sont des nanoparticules membraneuses sécrétées par divers organismes et types cellulaires et sont de plus en plus reconnues comme des médiateurs importants de la communication intercellulaire et inter-règne. Bien que la biologie des VE soit bien établie dans les systèmes mammifères, la recherche sur les VE végétales est relativement récente et en rapide expansion, portée en partie par des preuves que les VE végétales peuvent livrer de petits ARN, ARNm, protéines et autres cargaisons impliquées dans l’immunité et les interactions plante-microbe. Cependant, l’isolement des VE à haute pureté reste techniquement difficile en raison de la rigidité des parois cellulaires, de l’abondance de métabolites secondaires et du risque de contamination cytosolique lors de la collecte du liquide apoplasique. Ce protocole décrit un flux de travail rationalisé pour l’isolement et la purification des VE végétales à partir du tissu foliaire d’Arabidopsis thaliana . Une étape d’infiltration douce à base de seringue est utilisée pour minimiser les dommages cellulaires et les fuites cytosoliques, tandis que l’utilisation de lames individuelles (sans pétioles/tissu vasculaire) aide à réduire la contamination par les contenus vasculaires et intracellulaires. Les EV sont initialement enrichis par centrifugation différentielle et peuvent être purifiés davantage par fractionnement par gradient de densité de saccharose ou chromatographie par exclusion de taille (SEC). Ce protocole permet de produire des EV avec une intégrité structurelle préservée et une contamination cellulaire réduite en minimisant les dommages cellulaires et les fuites cytoplasmiques lors de la collecte du fluide apoplasique, selon l’évaluation par analyse de suivi des nanoparticules et microscopie électronique de transmission. Ces échantillons de VE conviennent aux applications en aval, notamment le profilage ARN, la protéomique et les essais fonctionnels pour les études d’interaction plante-microbe. Dans l’ensemble, cette méthode offre une approche reproductible et adaptable pour obtenir des véhicules électriques de haute qualité.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (EV) sont des particules membranaires lipidiques à deux couches sécrétées par un large éventail d’organismes, des bactéries auxhumains 1,2. Dans les systèmes animaux, les EV sont couramment classés en exosomes, microvésicules et corps apoptotiques en fonction de leurs voies de biogenèse et de leur taille3. Les exosomes (~30-150 nm de diamètre) proviennent de la fusion de corps multivésiculaires (MVB) avec la membrane plasmique, ce qui permet la libération de vésiculesintraluminales 4, tandis que les microvésicules (~100-1000 nm de diamètre) bourgeonnent directement de la membraneplasmique 5. En plus des exosomes et microvésicules, les cellules de mammifères produisent également des corps apoptotiques, qui sont libérés lors de la mort cellulaireprogrammée 6. Ces vésicules ont été impliquées dans la modulation immunitaire, la progression tumorale et la délivrance thérapeutique, ce qui en fait un sujet de recherche biomédicale intense 7,8. Chez les plantes, la classification des VE est moins bien définie que chez les animaux. Des études sur Arabidopsis thaliana ont identifié plusieurs sous-types de VE végétale basés sur des différences de marqueurs protéiques, de taille et de voies de biogenèse présumées. Cela inclut les EV tétraspanine (TET) positives, considérées comme des vésicules exosomiques dérivées de corps multivésiculaires 9,10, les EVs 11 positifs à la protéine syntaxine Penetration 1(PEN1), les EVs dérivés des organites exocystespositifs (EXPO) 12,13, ainsi que d’autres populations de EV telles que les EVs14 liés à l’autophagie et les pollensomes15.

De plus en plus de preuves suggèrent que les plantes sécrètent des VE dans le cadre de leur stratégie de défense contre les agents pathogènes. Les VE végétaux transportent diverses cargaisons moléculaires, y compris de petits ARN, des ARNm et d’autres molécules régulatrices, qui suppriment la virulence des agents pathogènes fongiques etoomycètes 10,16,17,18,19. Ces résultats mettent en lumière les VE comme des véhicules de « guerre à ARN », permettant aux plantes de supprimer directement l’expression génique des agents pathogènes, un mécanisme aux implications profondes pour la protection descultures 20. Au-delà de l’immunité, les VE végétaux peuvent également contribuer au remodelage de la paroi cellulaire, aux réponses au stress et à la signalisationdéveloppementale 21. Contrairement à la recherche sur les VE animales, où les protocoles standardisés d’isolement et de caractérisation sont largementétablis, le domaine des VE des plantes en est encore à ses stades de formation. Cela limite la reproductibilité et la comparabilité entre les études, créant un besoin urgent de méthodologies robustes et standardisées pour isoler et étudier ces vésicules.

Isoler les VE végétaux des plantes présente des défis techniques uniques qui ne sont pas rencontrés dans les systèmes animaux. Les tissus végétaux endommagés contiennent de nombreux métabolites secondaires, des débris de paroi cellulaire et des fragments organitaux qui peuvent co-purifier avec les EV, compliquant la caractérisation enaval 23. De plus, le liquide de lavage apoplasique (AWF), couramment utilisé comme matériau de départ pour l’isolement et la purification des VE des plantes, donne souvent un mélange hétérogène de vésicules et decontaminants 24. Bien que la centrifugation différentielle reste une approche fondamentale largement utilisée, elle ne peut pas résoudre entièrement des sous-populations distinctes de VE ni séparer les EV des complexes macromoléculaires co-isolés25,26. Des revues récentes et des études méthodologiques ont fourni des orientations importantes et des considérations de bonnes pratiques pour l’isolement et la caractérisation des VEdes plantes 27,28,29,30,31. Néanmoins, la mise en œuvre pratique et l’intégration de ces approches restent difficiles, et des étapes de purification supplémentaires telles que la centrifugation par gradient de densité et la chromatographie par exclusion de taille sont souvent nécessaires pour améliorer la pureté et la reproductibilité des EV à travers les études.

Ici, nous présentons un protocole simplifié pour isoler les VE du liquide de lavage apoplastique Arabidopsis en utilisant une stratégie de purification en plusieurs étapes. Contrairement aux approches d’isolation des VE des plantes couramment utilisées, qui reposent sur l’infiltration totale de la plante avec des pompesà vide 11, ce protocole évite l’inclusion de pétioles et de tissus vasculaires, ce qui peut augmenter la contamination par les structures vasculaires. À la place, des lames isolées et une méthode d’infiltration douce à base de seringue sont utilisées pour améliorer la collecte des apoplastes tout en minimisant la perturbation tissulaire. Une manipulation soignée des feuilles, une orientation et des conditions de centrifugation réduisent encore la contamination par les composants intracellulaires, offrant un matériau de départ plus propre pour l’isolation des véhicules électriques. Après centrifugation différentielle, les EV peuvent être purifiés davantage soit par fractionnement par gradient de densité de saccharose, soit par chromatographie par exclusion de taille afin d’obtenir une pureté et une résolution vésiculaires supérieures. Les préparations EV résultantes sont bien adaptées aux applications en aval, notamment le séquençage d’ARN, le profilage protéomique et les tests fonctionnels tels que les interactions pathogènes et les études d’absorption des EV, améliorant ainsi la reproductibilité et l’interprétabilité dans la recherche sur les VE en plante.

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Protocole

REMARQUE : Effectuez des étapes de centrifugation dans une centrifugeuse réfrigérée à 4 °C pour préserver l’intégrité des véhicules électriques. Il faut utiliser des tubes stériles. Toutes les étapes de manipulation des échantillons doivent être effectuées rapidement et efficacement, idéalement par plusieurs personnes travaillant en parallèle, afin de minimiser les dommages tissulaires et d’éviter toute contamination susceptible de compromettre la qualité des VE.

1. Préparation et infiltration des feuilles

  1. Préparez 1 L tampon d’isolation vésiculaire (VIB) composé de 20 mM d’hydrate de MES, 2 mM deCaCl 2, 0,1 M de NaCl, pH 6.
  2. Récoltez les zones distales des feuilles en coupant à la base pour retirer le pétiole.
    REMARQUE : Au moins 100 plantes âgées de quatre semaines par traitement ou génotype sont recommandées pour garantir un rendement suffisant en EV. Les plants d’Arabidopsis ont été cultivés sous des cycles de 8 h de lumière / 16 h d’obscurité. N’utilisez pas les feuilles présentant des signes visibles de stress, comme le blanchiment ou le flétrissement des feuilles.
  3. Lavez les feuilles trois fois avec de l’eau à osmose inverse (RO). Placez-les sur du papier essuie-tout et séchez-les doucement.
  4. Chargez environ 50 mL de feuilles dans une seringue de 120 mL. Tapotez légèrement la seringue pour calmer les feuilles.
  5. Ajoutez environ 60 mL de VIB dans la seringue jusqu’à ce que les feuilles soient complètement immergées. Expulsez l’air piégé en appuyant doucement sur le ventour. Appuyez quatre fois sur la pointe de la seringue un morceau de parafilm plié pour éviter toute fuite.
    REMARQUE : Lors d’une infiltration sous vide à base de seringue, assurez-vous que la seringue et le ventoleur sont bien assemblés avant d’appliquer le vide. Appliquez progressivement la force et maintenez une prise ferme sur la seringue pour éviter un mouvement brusque de la ventouse ou une perte de contrôle.
  6. Infiltrez les feuilles en tirant lentement le ventouse vers l’extérieur pour créer un vide. Maintenez le plongeur en position étendue pendant 5 secondes, puis relâchez lentement. Répétez ce cycle d’infiltration 2 à 3 fois jusqu’à ce que les feuilles paraissent plus foncées et translucides, indiquant une infiltration réussie.
  7. REMARQUE : Tirer le plongeur nécessite une force modérée due à la résistance au vide. La seringue doit être tenue fermement pendant que le piston est retiré lentement pour maintenir une infiltration contrôlée.
  8. Une fois les feuilles infiltrées, retirez la ventouse. Verse l’excès de tampon dans l’évier.
  9. Répétez les étapes 1.4-1.7 jusqu’à ce que toutes les feuilles récoltées soient infiltrées (Figure 1A).

2. Collecte de liquide de lavage apoplastique (AWF)

  1. Coupez une bande de ruban adhésif de ~12 pouces et placez-la collante vers le haut. Fixez une extrémité du ruban en l’enroulant autour d’une seringue vide et inutile de 1 mL juste en dessous de l’extrémité plus large. Disposez soigneusement environ 50 à 70 feuilles infiltrées en couches superposées le long de la surface collante, en les positionnant de manière à ce que la base de chaque lame fasse face à la seringue inférieure et que les pointes pointent vers le haut pour la collecte (Figure 1B).
    REMARQUE : Superposer plusieurs feuilles sur une même bande de ruban aide à prévenir les dommages. Alignez toutes les feuilles avec la pale orientée vers une extrémité et orientée vers le bas du tube de collecte afin de permettre une récupération efficace du fluide apoplasique lors de la centrifugation.
  2. Enroulez fermement les feuilles scotchées autour de la seringue, puis fixez le dessus du paquet avec deux bandes de ruban adhésif. Insérez la seringue enveloppée dans un tube de 50 mL avec l’extrémité coupée des feuilles et la base de la seringue orientées vers le bas du tube. Assurez-vous que les feuilles sont bien scotchées, car un emballage lâche peut endommager les feuilles et libérer des cellules cassées contaminant le liquide de lavage à apoplaste (Figure 1B).
  3. Centrifugez la seringue enveloppée contenant les feuilles infiltrées à 900 × g pendant 10 minutes à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée équipée d’un rotor à angle fixe. Prélever le liquide de lavage apoplastique dans un nouveau tube conique de 15 mL et conserver l’échantillon sur la glace. Répétez les étapes 2.1-2.3 jusqu’à ce que toutes les feuilles aient été utilisées pour collecter AWF.
    REMARQUE : L’AWF doit être transparente, pas vert ni même vert clair. Un AWF vert indique la présence de chloroplastes/chlorophylles et peut également indiquer une contamination cellulaire. Pour minimiser les dommages aux feuilles, utilisez un rotor à angle fixe.

3. Isolation EV par Arabidopsis depuis AWF via centrifugation différentielle

  1. Centrifugez le liquide de lavage apoplastique collecté à 2 000 g pendant 20 minutes à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée équipée d’un rotor à seau oscillant, avec des réglages standards d’accélération et de décélération. Après centrifugation, utilisez un filtre à cellules nylon de 0,45 μm pour éliminer les gros débris cellulaires du surnageant. Jetez la pastille. Transférer le surnageant filtré dans de nouveaux tubes centrifugeuses (Figure 2).
  2. Centrifugez le surnageant filtré à 10 000 × g pendant 30 minutes à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse réfrigérée équipée d’un rotor à angle fixe, avec des réglages standards d’accélération et de décélération. Jetez la pastille et conservez le surnageant pour l’ultracentrifugation. Cette étape élimine davantage les gros débris cellulaires et les grandes vésicules (Figure 2).
  3. Transférez le surnageant dans des ultracentrifugeuses de 17 mL et l’ultracentrifugeuse à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse équipée d’un rotor à seau oscillant, avec des réglages standards d’accélération et de décélération. Après centrifugation, jeter le surnageant et resuspendre la pellete dans environ 16 mL de tampon VIB pour le lavage. Répétez le tour d’ultracentrifugation pour collecter les VE (Figure 2).
    REMARQUE : La centrifugation à 100 000 x g est effectuée pour la sédimentation de petites vésicules telles que les exosomes. Les étapes suivantes de lavage aident à éliminer les protéines non EV en resuspendant la pellete en tampon. Les tubes ultracentrifugateurs doivent être soigneusement équilibrés selon la masse selon les spécifications du fabricant avant centrifugation. Inspectez les tubes et les rotors pour détecter des défauts avant l’utilisation et assurez-vous que le rotor est bien fixé avant de commencer la course.
  4. Jetez le surnageant et resuspendez la boule dans VIB. Utilisez une pointe de pipette pour gratter doucement le fond du tube afin de faciliter la récupération complète du projectile EV (Figure 2).
    REMARQUE : Le plomb EV est souvent translucide et peut ne pas être détectable visuellement une fois resuspendu. Gratter doucement le bas du tube facilite le processus de resuspension des véhicules électriques. Ajustez le volume de resuspension pour atteindre la concentration VE souhaitée, car des volumes de resuspension plus petits entraînent généralement des préparatifs EV plus concentrés. Typiquement, la resuspension des EV à 50 μL donne des concentrations de protéines d’environ 1 à 1,5 μg/μL et des concentrations de particules proches de 109-10 10 particules/mL.
  5. Stockez les VE resuspendus à 4 °C pour une utilisation immédiate ou à -80 °C pour un stockage à long terme sans gel éclair dans de l’azote liquide.
    REMARQUE : Le stockage à long terme peut réduire l’intégrité des VE. Utilisez des véhicules électriques fraîchement préparés dès que possible.

4. Utilisation du fractionnement du gradient de densité de saccharose pour la purification des EV

REMARQUE : L’ultracentrifugation seule co-sédimente plusieurs types de vésicules. Pour obtenir une résolution plus fine, on peut utiliser un fractionnement par gradient de densité, séparant les vésicules selon leur densité de flottabilité et leurs propriétés de flottaison. Dans cette approche, les gradients de saccharose sont utilisés pour enrichir des sous-populations définies de VE. Sinon, des gradients d’iodixanol peuvent être utilisés.

  1. Séparation du gradient de saccharose en charge supérieure des VE
    1. Préparez des stocks de gradient de saccharose à 10 à 90 % comprenant les concentrations suivantes : 10 %, 16 %, 22 %, 28 %, 34 %, 40 %, 46 %. 52 %, 58 %, 64 %, 70 % et 90 % en utilisant le VIB. Utilisez un bain-marie à 60 °C pour aider à dissoudre les stocks à 70 % et 90 %.
    2. Préparez un gradient discontinu en superposant 1 mL de chaque solution de saccharose dans un ultratube centrifuge de 17 mL, en commençant par la solution la plus concentrée au fond et en avançant séquentiellement jusqu’à la plus concentrée. Excluez la couche de saccharose à 10 % lors de l’assemblage du dégradé.
      REMARQUE : Distribuez soigneusement chaque couche dense le long de la paroi interne du tube afin de minimiser le mélange entre les couches adjacentes. Une pipette automatique réglée à une vitesse de distribution lente est recommandée pour assurer un débit continu et contrôlé et améliorer la stabilité du gradient. Si une pipette manuelle classique est utilisée, la distribution doit être effectuée lentement et sûrement, avec la pointe de la pipette positionnée juste au-dessus de l’interface de la couche précédente, et avec précaution pour éviter la formation de bulles d’air.
    3. Mélangez le pellet EV en suspension (~100 μg de protéine EV) avec 1 mL de solution de saccharose à 10 %. Ensuite, superposez ce mélange comme dernière couche de la couche discontinue. Le volume total sera de ~12,1 mL.
    4. Centrifugeuse à 100 000 g pendant 16 heures à 4 °C.
      REMARQUE : Pour des prolongations d’ultracentrifugation, vérifiez que les tubes, capuchons et rotors sont homologués pour un fonctionnement prolongé à grande vitesse et que les procédures d’équilibrage recommandées par le fabricant sont respectées.
    5. Collectez six fractions de 2 mL par échantillon en pipettant depuis le dessus. Transférez chaque fraction dans un nouveau tube ultracentrifuge de 17 mL.
    6. Resuspendez les fractions collectées dans un tampon VIB de ~16 mL et centrifugez à 100 000 g pendant 1 h à 4 °C.
    7. Jetez le surnageant, puis resuspendez chaque boule à 50 μL de VIB.
      REMARQUE : La pellete EV n’est pas visible. Grattez doucement le fond du tube avec la pointe de la pipette pour le resuspendre. Ajustez le volume du tampon selon les besoins (par exemple, 10 μL pour une concentration plus élevée).
  2. Séparation du gradient de saccharose à chargement inférieur des VE
    1. Préparez des stocks de gradient de saccharose à 10 à 90 % comprenant les concentrations suivantes : 10 %, 16 %, 22 %, 28 %, 34 %, 40 %, 46 %, 52 %, 58 %, 64 %, 70 % et 90 % en utilisant le tampon VIB. Utilisez un bain-marie à 60 °C pour aider à dissoudre les stocks à 70 % et 90 %.
    2. Mélangez la pellete EV en suspension (~100 μg de protéine EV) avec 1 mL de solution de saccharose à 90 %. Ensuite, superposez ce mélange comme première couche d’une couche discontinue.
    3. Préparez le gradient discontinu restant de saccharose en superposant séquentiellement 1 mL de chaque solution de saccharose sur le mélange EV-90 % de saccharose, en partant de 70 % de saccharose et en procédant progressivement à des concentrations plus basses (64 %, 58 %, 52 %, 46 %, 40 %, 34 %, 28 %, 22 %, 16 % et 10 %). Distribuez soigneusement chaque couche le long de la paroi du tube à l’aide d’une pipette pour minimiser le mélange entre les couches adjacentes. Le volume total sera de ~12,1 mL.
    4. Centrifugeuse à 100 000 g pendant 72 h à 4 °C.
      REMARQUE : Pour des prolongations d’ultracentrifugation, vérifiez que les tubes, capuchons et rotors sont homologués pour un fonctionnement prolongé à grande vitesse et que les procédures d’équilibrage recommandées par le fabricant sont respectées.
    5. Collectez six fractions de 2 mL par échantillon en pipettant depuis le dessus. Transférez chaque fraction dans un nouveau tube ultracentrifuge de 17 mL.
    6. Résuspendez les fractions collectées dans un tampon VIB de ~16 mL et centrifugez à 100 000 g pendant 1 h à 4 °C.
    7. Jetez le surnageant, puis resuspendez chaque boule dans 50 μL de tampon VIB.
      REMARQUE : La pellete EV n’est pas visible. Grattez doucement le fond du tube avec la pointe de la pipette pour le resuspendre. Ajustez le volume du tampon selon les besoins (par exemple, 10 μL pour une concentration plus élevée).

5. Utilisation de chromatographie à exclusion de taille (colonne 35 nm) pour purifier les EV

  1. Préparation des tampons et équilibrage de colonne
    1. Préparez le VIB et tous les tampons supplémentaires à frais. Filtrez tous les tampons à travers une membrane de 0,22 μm et dégazez sous vide avant utilisation afin d’éviter la formation de bulles d’air et l’obstruction des pores.
      REMARQUE : Un dégazage incomplet ou l’utilisation de tampons non filtrés peuvent introduire des bulles d’air ou des particules dans le lit de résine, entraînant un flux perturbé et une réduction de l’efficacité de séparation des EV. Si des bulles sont observées dans la colonne, la course doit être arrêtée et la colonne rééquilibrée.
    2. Laissez la colonne et les tampons s’équilibrer à la température ambiante (18-24 °C) avant de retirer les capuchons des colonnes.
      REMARQUE : La colonne et les tampons doivent être complètement équilibrés à température ambiante avant le retrait du bouchon. L’application d’un tampon à température ambiante sur une colonne froide peut provoquer la formation de bulles dans la résine, ce qui déforme les profils d’élution et réduit la reproductibilité.
    3. Placez la colonne en position verticale et retirez soigneusement le capuchon supérieur de la colonne.
    4. Retirez le bouchon inférieur et laissez le tampon s’écouler complètement hors de la colonne.
      REMARQUE : Assurez-vous que le tampon de stockage a complètement été vidé de la colonne avant l’équilibre.
    5. Équilibrez la colonne en rinçant avec trois volumes de colonne (25,5 mL) de tampon VIB dégazé de 0,22 μm.
  2. Chargement des VE et collecte d’échantillons
    1. Utilisez 100 μg de protéine EV totale pour chaque purification SEC. Avant de charger sur la colonne SEC, ajustez les échantillons EV à un volume final de 500 μL avec le VIB.
    2. Appliquez la suspension EV de 500 μL directement sur le frit de chargement en haut de la colonne.
    3. Laissez l’échantillon entrer complètement dans le lit de résine avant d’ajouter le tampon VIB. Maintenir un écoulement continu de colonnes tout au long de la séparation afin d’assurer une élution précise basée sur la taille.
      REMARQUE : Le flux de colonnes doit rester continu tout au long de la séparation. Laisser la colonne s’assécher ou interrompre l’écoulement pendant de longues périodes perturbe la séparation basée sur la taille et peut entraîner un chevauchement des fractions et une réduction de l’enrichissement des EV.
    4. Après que l’échantillon de VE (500 μL) est complètement entré dans le lit de résine, ajoutez 2 mL de VIB et laissez-le s’éluer complètement. Cet éluat correspond au volume mort de la colonne et doit être écarté. Les fractions de VE ont ensuite été collectées en ajoutant séquentiellement 400 μL de VIB et en collectant l’éluat, répétant ce processus pour obtenir les fractions 1 à 6 dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL.
      REMARQUE : Le volume mort ne doit pas contenir de véhicules électriques. Sur la base de la validation utilisant la colonne de 35 nm, les EV sont généralement récupérés en fractions 1 à 3. Si nécessaire, le volume mort peut être évalué par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) ou immunoblotting pour détecter les marqueurs EV afin de confirmer l’absence de EV.
  3. Nettoyage et stockage des colonnes
    1. Immédiatement après la collecte fractionnée, rinçez la colonne avec un volume de colonne (8,5 mL) de 0,5 M NaOH pour désinfecter la résine. Ensuite, rinçez la colonne avec 17 mL de VIB pour rétablir le pH neutre. La colonne est alors prête pour le chargement du prochain échantillon.
      REMARQUE : Rincer la colonne uniquement avec du tampon est insuffisant pour éliminer les protéines ou vésicules résiduelles. L’étape de nettoyage par NaOH est essentielle pour éviter le transfert entre échantillons, en particulier pour les analyses en aval d’acides nucléiques ou d’ARN.
    2. Pour un stockage à long terme, rincez la colonne avec deux volumes d’eau déionisée après le nettoyage, suivis de deux volumes de colonnes à 20 % d’éthanol pour le stockage. Recouvre la colonne et range-la à la verticale.
      REMARQUE : Rincer la colonne avec de l’eau déionisée avant le stockage de l’éthanol empêche la cristallisation du sel dans le lit de résine, ce qui préserve la performance de la colonne.

6. Validation, quantification et évaluation de la taille/morphologie des EV

  1. Analyse du suivi des nanoparticules (NTA)
    1. Mesurez la distribution de la taille des EV et la concentration des particules par NTA.
    2. Diluez les échantillons EV à 1:100 en VIB stérile, filtré à 0,2 μm pour obtenir une concentration de particules dans la plage de détection optimale (environ 10⁷-10⁹ particules/mL).
    3. Mélangez délicatement les échantillons dilués pour éviter la formation de bulles et chargez-les dans l’instrument équipé d’un laser 532 nm et d’une caméra sCMOS haute sensibilité.
    4. Effectuer l’acquisition et l’analyse des données à l’aide du logiciel NS Xplorer avec un seuil de détection de 10 nm (jusqu’à 1 000 nm), en appliquant un algorithme dynamique de concentration basé sur le volume d’observation.
  2. Analyse Western blot des marqueurs EV
    1. Pour l’analyse Western blot, laver et resuspendre les fractions EV obtenues après séparation du gradient de saccharose dans 50 μL de VIB. Mélangez une aliquote de 10 μL de chaque fraction avec un tampon de charge SDS, dénaturée, et résolue sur un gel de trisglycine à 12 % avant l’immunoblotting avec les anticorps TET8 des marqueurs EV.
    2. Pour les fractions EV dérivées de la SEC, concentrez d’abord 400 μL de chaque fraction à 50 μL à l’aide d’un filtre centrifuge de coupure de 100 kDa à masse moléculaire. Ensuite, utilisez 10 μL de l’échantillon concentré pour l’analyse Western blot comme décrit ci-dessus.
  3. Microscopie électronique en transmission (TEM)
    1. Déposez 5 μL de VE suspendus dans le VIB sur des grilles carbone-formvar à 300 mailles déchargées par phosphorescence. Ensuite, évacuez l’excès d’échantillon avec du papier filtrant.
    2. Ensuite, colorez négativement la grille avec 3 μL de coloration microscopique électronique, écartez avec du papier filtre, et laissez-la sécher à l’air avant d’imager avec un MET 300 kV.

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Résultats

Pour évaluer si le protocole de collecte optimisée de l’AWF réduit les dommages tissulaires et la contamination cytoplasmique, l’AWF obtenu via notre méthode (Méthode 1) a été directement comparé à une méthode alternative (Méthode 2) basée sur l’infiltration totale de la pompe à vide11. Les lésions cellulaires après infiltration ont été évaluées par coloration Trypan Blue, qui a révélé une nette réduction de la coloration dans les feuilles traitées selon la méthod...

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Discussion

Les VE végétaux sont devenus des acteurs clés de l’immunité des plantes, notamment dans la médiation de la communication inter-règnes avec les agents pathogènesfongiques 32. De plus en plus de preuves montrent que les plantes sécrètent des EV dans l’apoplaste, où elles servent à délivrer de petits ARN (ARNs), des ARNm et des protéines capables de supprimer la virulence chez les agents pathogènes envahissants, tels que Botrytis cinerea, Rhizoctonia sol...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne révèlent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Le B.D. est soutenu par la bourse Pathways to the Doctorate de l’Université Texas A&M. B.H. est soutenu par des fonds de démarrage de l’Université Texas A&M et du Département de l’Agriculture des États-Unis HATCH 7009138 numéro de projet : TEX08074.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,45 & micro ; Filtres en nylon MVWR76479-032
1 ml de seringue inutileBD Biosciences309659
Filtre ultra centrifuge de 100 kDaAmiconUFC 910008
100 ml de seringue inutileBD Biosciences551721050
Tubes coniques de 15 mlVWR89039-664
Tubes coniques de 50 mlVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Lignes entretenues par le laboratoireNon applicable
Grilles carbone-formvar à 300 maillesTED PELLA01753-F
Bande transparenteRuban magique écossaisS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Tampon PBSFabriqué en interneNon applicable
qEV colonne originale Gen2 35 nmIZON ScienceICO-35
Centrifugeuse réfrigéréeEppendorf5810R
Rotor à angle fixe à centrifuge réfrigéréeEppendorfF-34-6-38
Rotor à seau pivotant réfrigéréEppendorfA-4-62
SaccharoseVWR470302-810
UltracentrifugeBeckman CoulterXPN-100
Tubes ultracentrifugesBeckman Coulter337986
Coloration UranyLessSciences de la microscopie électronique250218-01

Références

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