Ce protocole décrit la fabrication de patchs micro-aiguilles dissolvables incorporant des nanomicelles de α-lactalbumine chargées de capsaïcine. La méthode propose une approche reproductible et mini-invasive pour une livraison ciblée transdermique de bioactifs hydrophobes au tissu adipeux, facilitant une réduction locale efficace des graisses et élargissant potentiellement les applications dans la gestion de l’obésité.
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Article de méthode
Fabrication de patchs microaiguilles dissolvables chargés de nanomicelles α-lactalbumine pour l’administration transdermique de capsaïcine et la réduction du tissu adipeux
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Résumé
Résumé
Ce protocole décrit la fabrication et l’application de patchs micro-aiguilles dissolvables (MN) contenant des nanomicelles de α-lactalbumine pour l’administration transdermique ciblée de capsaïcine au tissu adipeux. Le processus commence par l’hydrolyse enzymatique partielle de la α-lactalbumine, aboutissant à des peptides amphiphiles qui s’auto-assemblent en nanomicelles encapsulant le composé hydrophobe capsaïcine. Les nanomicelles chargées de capsaïcine sont mélangées à une matrice d’acide hyaluronique (HA) et d’alcool polyvinylique (PVA), coulées dans des moules de polydiméthylsiloxane (PDMS), puis centrifugées pour produire des réseaux de 10 × 10 MN. Après séchage sous vide, les MN présentent une résistance mécanique suffisante pour la pénétration cutanée et se dissolvent en environ 30 minutes après application. Les résultats représentatifs incluent la microscopie électronique à balayage, qui confirme la morphologie uniforme des MN, la microscopie confocale, qui vérifie la pénétration cutanée et la libération du médicament, ainsi que des expériences in vivo chez des souris à régime riche en graisses (HFD) montrant une réduction de la masse graisseuse, une activité métabolique accrue et l’induction du brunissement adipos. Ce protocole offre une méthode reproductible et mini-invasive pour la délivrance transdermique de bioactifs hydrophobes, offrant une approche thérapeutique prometteuse pour la gestion de l’obésité. Ce protocole est optimisé pour la reproductibilité et adapté à d’autres bioactifs hydrophobes.
Introduction
L’obésité est devenue l’un des défis sanitaires mondiaux les plus urgents, la prévalence augmentant régulièrement tant dans les pays développés que dans les pays en développement. Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus de 650 millions d’adultes étaient classés obèses en 2016, et en 2022, environ 43 % des adultes âgés de ≥18 ans étaient en surpoids, et 16 % vivaient avecl’obésité 1. L’obésité est étroitement associée au syndrome métabolique, aux maladies cardiovasculaires, au diabète de type 2 et à plusieurs cancers, imposant d’importants fardeaux socio-économiques et de soinsde santé 2,3. Les stratégies thérapeutiques actuelles, incluant la restriction alimentaire, l’exercice, la pharmacothérapie et la chirurgie bariatrique, n’apportent que des bénéfices partiels et souvent transitoires. Ces approches souffrent fréquemment d’une mauvaise adhésion du patient, d’une efficacité limitée à long terme, d’une forte invasivité et d’effets indésirablesindésirables 4,5. Par conséquent, il est urgent de bénéficier de thérapies locales sûres, efficaces et conformes aux patients pour la gestion de l’obésité.
Les composés bioactifs naturels ont suscité un intérêt croissant en tant qu’agents anti-obésité en raison de leurs actions multi-ciblées et de leurs profils de sécurité généralement favorables. Par exemple, la rutine, un flavonoïde glycoside, présente des effets anti-lipogéniques et régulateurs métaboliques en supprimant les facteurs de transcription adipogénique et en favorisant la biogenèsemitochondriale 6. La capsaïcine, la composante âcre des piments, a été rapportée comme augmentant la dépense énergétique, induisant le brunissement du tissu adipeux blanc et inhibant l’accumulation lipidique via l’activation du potentiel transitoire du récepteur vanilloïde 1 (TRPV1)signalant 7,8. Cependant, la traduction clinique de ces composés est entravée par une mauvaise solubilité aqueuse, une faible biodisponibilité orale, un métabolisme rapide et, dans le cas de la capsaïcine, une irritation gastro-intestinale lors del’ingestion.
Les systèmes de délivrance de médicaments basés sur la nanotechnologie offrent des solutions prometteuses à ces limites. Les liposomes, nanoparticules polymériques et nanoporteurs à base de protéines peuvent considérablement améliorer la solubilité, la stabilité et l’absorption cellulairedes médicaments 10. En particulier, la α-lactalbumine, une protéine laitière d’origine alimentaire, peut être partiellement hydrolysée en peptides amphiphiles qui s’auto-assemblent en nanomicelles capables d’encapsuler des molécules hydrophobes telles que lacapsaïcine 11. Ces nanostructures de α-lactalbumine ont démontré qu’elles améliorent la solubilité, la stabilité et la biodisponibilité de divers bioactifs hydrophobes dans les matrices alimentaires etpharmaceutiques 12,13. Néanmoins, l’administration systémique de nanoporteurs peut encore entraîner une distribution tissulaire hors cible et une toxicité systémiquepotentielle 14.
La technologie des microaiguilles (MN) s’est imposée comme une plateforme minimalement invasive et conviviale pour les patients pour la délivrance transdermique de médicaments. Les MN dissolvables préparés à partir de polymères biocompatibles tels que l’acide hyaluronique (HA) et l’alcool polyvinylique (PVA) peuvent pénétrer sans douleur la cornée de la strate, se dissoudre après insertion et permettre un dépôt local précis de médicaments dans les tissusciblés 15,16. La combinaison de nanoporteurs avec les NM augmente encore l’accumulation de médicaments dans le tissu adipeux sous-cutané tout en réduisant l’exposition systémique et les effetssecondaires 17. Il est important de noter que les patchs MN à base d’HA et PVA dissoudus sont en cours de développement vers un usage clinique pour la délivrance transdermique de vaccins et de biopharmaceutiques, démontrant une sécurité favorable, une acceptation par les patients et une fabricabilité à l’échelle18.
S’appuyant sur ces avancées, la présente étude décrit la fabrication de patchs de MN dissolvables chargés de nanomicelles de α-lactalbumine encapsulant la capsaïcine. Dans ce protocole, la α-lactalbumine est dissoute à 6 mg/mL et hydrolysée enzymatiquement pour générer des peptides amphiphiles qui s’auto-assemblent en nanomicelles chargées de capsaïcine. Les nanomicelles sont incorporées dans une matrice HA/PVA (5 % de pou/v chacune) et coulées dans des moules de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour former des réseaux de 10 × 10 MN avec une hauteur d’aiguille de 600 μm, une configuration compatible avec les procédés de micro-moulage standard et facilement évolutive sur des patchs plus grands de taille humaine. Cette conception intégrée devrait améliorer la solubilité et la stabilité de la capsaïcine, permettre une libération à pH réactive dans le tissu adipeux, et renforcer l’efficacité locale anti-obésité in vivo en favorisant le brunissement des tissus adipeux, la suppression de la lipogenèse et l’amélioration des paramètres métaboliques systémiques. En exploitant α-lactalbumine de qualité alimentaire et des matériaux dissolvants de NM avancés cliniquement, cette plateforme propose une stratégie de transition et peu invasive, pouvant être adaptée aux patchs à échelle humaine pour une thérapie locale et auto-administrée contre l’obésité.
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux expérimentaux à Pékin. Le numéro d’approbation attribué au laboratoire/chercheur est AW03019102-3. Les réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation de nanomicelles de α-lactalbumine encapsulant la capsaïcine 12
- Dissoudre α-lactalbumine dans de l’eau déionisée à une concentration de 6 mg/mL et ajuster le pH à 7,4. Remuez la solution à l’aide d’un agitateur magnétique à 8-28 × g jusqu’à ce que la α-lactalbumine soit complètement dissoute (généralement 20-30 minutes).
- Ajoutez la protéase Bacillus licheniformis (BLP) à un ratio enzyme/substrat de 1:100 (p/p).
- Incubez le mélange à 50 °C pendant 30 minutes pour générer des peptides amphiphiliques.
- Terminez la réaction en chauffant la solution à 95 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez à température ambiante et filtrez à travers une membrane de 0,22 μm.
- Dissoudre la capsaïcine dans l’éthanol jusqu’à une concentration de 1 mg/mL. Ajoutez la solution de capsaïcine goutte en goutte dans la solution peptidique sous un remuage délicat.
- Continuez à remuer pendant 2 h pour permettre l’auto-assemblage des nanomicelles.
- Retirez la capsaïcine libre en dialysant le mélange (MWCO 3,5 kDa) contre l’eau déionisée pendant 12 heures, en remplaçant l’eau toutes les 4 heures.
- Lyophiliser (lyophiliser) les nanomicelles de α-lactalbumine préparées.
- Caractérisez les nanomicelles à l’aide de l’analyse TEM, DLS et du potentiel zeta.
2. Fabrication de patchs micro-aiguilles dissolvables 11
- Préparez la solution polymère en dissolvant l’HA (5 % en poire/v) et le PVA (5 % en poids / v) dans de l’eau déionisée à 60 °C et en remuant jusqu’à ce que la solution devienne claire.
- Refroidissez la solution polymère à température ambiante et mélangez-la avec les nanomicelles chargées en capsaïcine (M(Cap)) dans un ratio 4:1.
- Dégazez le mélange sous vide dans un dessiccateur relié à une pompe à vide (environ −80 kPa) pendant 10 minutes pour éliminer les bulles d’air avant de couler dans des moules PDMS.
- Chargez 200 μL du mélange dans des moules PDMS (10 × 10 aiguilles, hauteur de 600 μm).
- Centrifugez les moules à 1800 × g en RT pendant 10 minutes pour assurer un remplissage complet des cavités de la microaiguille.
- Répétez le remplissage une fois, suivi d’une seconde centrifugation dans les mêmes conditions que à l’étape 2.5, puis séchez les moules sous vide (environ −80 kPa) à température ambiante pendant 12 heures.
- Retirez soigneusement les patchs micro-aiguilles des moules.
- Examinez la morphologie des microaiguilles par MEB.
3. Essais mécaniques des microaiguilles 19
- Placez le patch à microaiguilles sur la plateforme d’un analyseur de texture avec les aiguilles orientées vers le haut.
- Compressez le patch à l’aide d’une sonde à une vitesse de 20 μm/s jusqu’à atteindre un déplacement de 0,7 mm.
- Notez la force de fracture et confirmez qu’elle est de ≥0,15 N par aiguille afin d’assurer la pénétration de la peau.
4. Test d’insertion et de dissolution in vitro 11
- Raser la peau abdominale des souris et exciser la peau pour des tests ex vivo .
- Placez la peau excisée sur un support en gel d’agarose.
- Appuyez fermement le patch à microaiguille sur la peau pendant 30 secondes.
- Maintenez le contact entre le patch et la peau pendant 30 minutes.
- Observez la dissolution par aiguille.
- Teindre la peau avec une coloration H&E et visualiser les sites d’insertion sous CLSM.
5. Étude de libération in vitro 11
- Immergez les patchs micro-aiguilles dans un tampon PBS (pH 6,5 ou 7,4) à 37 °C.
- À des intervalles définis, prélève des échantillons de tampon et reconstitue immédiatement avec un volume équivalent de tampon frais.
- Déterminez la concentration de capsaïcine dans les échantillons collectés à l’aide de HPLC.
- Comparez les profils de libération à différentes conditions de pH à l’aide du HPLC.
6. Application in vivo chez des souris obèses induites par le HFD 11
- Induire l’obésité chez les souris C57BL/6N en leur donnant un régime riche en graisses (HCD, 60 % kcal issu des graisses) pendant 8 semaines.
- Divisez aléatoirement les souris en cinq groupes : groupe contrôle normal, contrôle HFD, patch micro-aiguille micellaire vierge (MP-M), injection nanomicelle chargée en capsaïcine (InJ-M(Cap)), et groupe micro-aiguilles nano-aiguilles chargé en capsaïcine (MP-M(Cap)).
- Dépilez la région inguinale de chaque souris.
- Appliquez un patch microneedle sur la zone dépilée tous les 2 jours pendant 28 jours et maintenez le patch en place pendant 30 minutes.
- Notez le poids corporel et la consommation alimentaire tous les deux jours pendant la période de traitement.
- Analysez la composition des graisses et des tissus maigres par IRM à la fin du traitement.
- Évaluer l’activité physique, la consommation d’oxygène, la production de CO₂ et le quotient respiratoire (QR) dans les cages métaboliques conformément aux instructions du fabricant.
- Collecter l’iWAT, le sBAT et les organes majeurs, fixer, intégrer, sectionner et colorer les tissus avec H&E, et évaluer les modifications histologiques par microscopie optique.
- Effectuer un Western blot pour TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1 et Cyt C selon des procédures standard.
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Résultats
Morphologie et caractérisation des nanomicelles
La microscopie électronique en transmission (TEM) a montré que les nanomicelles de α-lactalbumine étaient des particules sphériques uniformément dispersées avec une distribution de taille étroite (Figure 1). Après l’encapsulation de capsaïcine, le diamètre moyen de la particule est passé de ~22 nm à ~30 nm, indiquant un chargement réussi du médicament dans le noyau micellaire. De manière con...
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Discussion
Cette étude démontre que les patchs micro-aiguilles (MN) dissolvables chargés de nanomicelles de α-lactalbumine encapsulant la capsaïcine (M(Cap)) peuvent produire des effets anti-obésité localisés et peu invasifs. Les nanomicelles de α-lactalbumine ont efficacement encapsulé la capsaïcine hydrophobe, amélioré sa dispersabilité aqueuse et renforcé l’absorption cellulaire, conduisant à une inhibition plus forte de l’adipogenèse et à une biogenèse mitochondriale plus prononcée dans les adi...
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Déclarations de divulgation
Il n’y a aucune divulgation.
Remerciements
Ce projet a été soutenu par le Fonds des Jeunes Scientifiques de la Fondation Nationale des Sciences Naturelles de Chine (n° 32202024), le Fonds des Jeunes Scientifiques de la Fondation provinciale des sciences naturelles du Shandong (n° ZR2024QC103), le Plan clé de recherche et développement de la province du Shandong (2025CXGC010803, 2022CXPT022), le Système technologique de l’industrie avicole de la province du Shandong (SDAIT-11-10), ainsi que le Programme de collaboration universités-industrie financé par le Bureau de l’éducation de la ville de Yantai, Chine (Développement de la plateforme de vaccins de nouvelle génération pour animaux de compagnie).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Préadipocytes 3T3-L1 | ATCC | CL-173 | Lignée cellulaire pour les études d’adipogenèse |
| Protéase Bacillus licheniformis (BLP) | Sigma-Aldrich | P5380 | Hydrolyse enzymatique de la &alpha ;-lactalbumine |
| Capsaïcine (&ge ; 98%) | Sigma-Aldrich | M2028 | Composé actif à encapsuler |
| Centrifugeuse (&ge ; 4000 tr/min) | Eppendorf | 5810R | Pour remplir les moules |
| Microscope laser confocal à balayage (CLSM) | Zeiss | LSM 900 | Visualiser la distribution et la pénétration des micelles |
| Colorant fluorescent Cy3 | GE Healthcare | PA23001 | Pour le marquage des nanomicelles |
| Colorants fluorescents Cy5 ou Cy7 | Fanbo Biochemical, Pékin, Chine | N/A | Pour l’imagerie de biodistribution |
| Dulbecco » s Modified Eagle s Medium (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Pour la culture cellulaire |
| Éthanol (&ge ; 99.7%) | Réactif chimique Sinopharm | 100092683 | Solvant pour la capsaïcine |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 16000-044 | Pour la culture cellulaire |
| Régime riche en graisses (60 % kcal de graisses, D12492) | Research Diets, USA | D12492 | Induire l’obésité chez la souris |
| Acide hyaluronique (HA, Mw 100&ndash ; 300 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., Chine | H108124 | Polymère pour la fabrication de microaiguilles |
| Isoflurane | RWD, Chine | R510-22-10 | Anesthésique |
| Système métabolique de la cage | Panlab, États-Unis | N/A | Évaluer l’activité, la consommation d’oxygène et le QR |
| Eau déionisée Milli-Q | Millipore | N/A | Solvant |
| Système IRM | NiuMag, Chine | MesoQMR23-060H-I | Mesurer la composition corporelle des graisses/maigres |
| Moules à microaiguilles PDMS (10 et fois 10 600 et mu ; m hauteur) | Technologie Blueacre ou personnalisé | N/A | Fabrication par microaiguilles |
| Pénicilline & ndash ; Streptycine | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Pour la culture cellulaire |
| Solution saline tamponnée phosphate ; (PBS, pH 7,4) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Tampon pour les études in vitro et in vivo |
| Alcool polyvinylique (PVA, Mw 30&ndash ; 70 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., Chine | P109389 | Polymère pour la fabrication de microaiguilles |
| Microscope électronique à balayage (MEB) | FEI Tecnai | G2 F30 | Caractériser la morphologie des microaiguilles |
| Analyseur de texture | BosinTech, Shanghai, Chine | MERCI. XTC-20 | Pour tester la résistance des microaiguilles |
| Solution bleue de Trypan (0,4 %) | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Visualiser les sites d’insertion de microaiguilles |
| UV&ndash ; Spectrophotomètre à vis | PerkinElmer | Lambda 35 | Pour les tests de libération de médicaments |
| Four à vide/dessiccateur | Thermo Fisher Scientific | N/A | Pour sécher les microaiguilles |
| Appareil de buvard occidental | Bio-Rad | Tétra mini-PROTEAN | Analyse des protéines |
| &alpha ;-Lactalbumine (&ge ; 95%) | Sigma-Aldrich | L6010 | Source de protéine pour la formation des nanomicelles |
Références
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Réimpressions et autorisations
