Test antiprolifératif de la plaque pour le criblage in vitro des molécules bioactives contre les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii

Résumé

Ce travail vise à décrire une méthode simple d’analyse de plaque pour aider au criblage de nouvelles molécules bioactives face au stade tachyzoïte du protozoaire Toxoplasma gondii.

Résumé

La toxoplasmose est une infection parasitaire généralement associée à des lésions oculaires et des malformations néonatales. Depuis le début des années 1950, le traitement de première ligne de cette maladie repose sur la combinaison de sulfadiazine, pyriméthamine et acide folinique. Au fil des années, seuls quelques protocoles alternatifs ont été introduits. Cela souligne la nécessité de découvrir de nouvelles molécules bioactives contre Toxoplasma gondii. Étant donné que ce pathogène est un parasite intracellulaire obligatoire, le dépistage médicamenteux traditionnel en laboratoire nécessite généralement des matériaux et équipements coûteux, tels que des tests utilisant des protéines fluorescentes ou des parasites exprimant β-galactosidase. De plus, des méthodes comme la quantification par microscopie optique peuvent être chronophages. Le test de plaque est une méthode qui évalue l’intensité de la prolifération intracellulaire des pathogènes en mesurant le nombre de régions et la zone de destruction dans une monocouche cellulaire endommagée par le cycle lytique du parasite. Ce travail décrit un protocole optimisé de test de plaque conçu pour le dépistage des molécules actives contre les tachyzoïtes intracellulaires de T. gondii in vitro. Ce protocole utilise des matériaux peu coûteux et un laboratoire simple, produisant des résultats rapides et reproductibles facilitant l’identification de nouvelles molécules actives contre ce parasite par divers groupes de recherche.

Introduction

La toxoplasmose est une maladie zoonotique à répartition hétérogène dans le monde, affectant environ un tiers de la population^{mondiale 1,2}. Les symptômes de cette maladie sont associés au degré d’immunité de l’hôte et à la réplication du^{parasite 3,4}. La phase aiguë de la maladie, caractérisée par la réplication du stade tachyzoïte, est généralement asymptomatique chez les individus^{immunocompétents 5,6}. En revanche, les personnes immunodéprimées présentent des symptômes plus fréquents, incluant des symptômes non spécifiques tels que malaise général, fièvre, ainsi que l’encéphalite et la rétinochoroïdite ^6,7,8. Malgré son importance clinique, le traitement actuellement disponible est inefficace contre le stade de la bradyzoïte Toxoplasma gondii (en phase chronique) et ne conduit pas à une guérison parasitologique. Les effets indésirables des médicaments actuels réduisent également l’adhésion au^{traitement 9,10,11.} Il est donc nécessaire de trouver de nouveaux traitements, plus sûrs et plus efficaces pour la toxoplasmose.

Le développement de nouveaux médicaments nécessite une longue période, des milliards de dollars d’investissements et plusieurs étapes de recherche. Comme le coût du développement des médicaments est élevé, l’industrie pharmaceutique doit sélectionner le meilleur candidat à l’avance^{12, 13, 14, 15}. Pour le dépistage de drogues, plusieurs approches peuvent être employées, notamment les méthodes in silico, l’utilisation de l’intelligence artificielle, et l’approche la plus courante, les méthodes^{biologiques 16, 17, 18, 19}. Le dépistage biologique in vitro implique l’utilisation de bibliothèques de molécules (chimiobibliothèques) pour rendre les molécules disponibles pour l’identification de l’activité^{biologique 20,21,22.} Comme ces chimiobibliothèques contiennent une diversité de molécules, il est nécessaire d’optimiser les ressources et le temps. Par conséquent, le test de plaque peut servir de méthode pour aider à filtrer rapidement de nouvelles molécules bioactives contre divers agents pathogènes, tels que T. gondii.

Le test de plaque est une méthode in vitro qui utilise le cycle lytique des agents pathogènes intracellulaires pour quantifier la concentration de pathogènes dans une monocouche cellulaire, entraînant la formation de plaques nécrotiques au fil du^{temps 23}. La première étude utilisant la technique du test de plaque remonte au début de la seconde moitié du XXe siècle, lorsque l’équipe de Renato Dulbecco a utilisé des monocouches de fibroblastes de poulet infectés par le virus de l’encéphalomyélite équine occidentale pour démontrer la proportionnalité entre le nombre de plaques nécrotiques formées et la concentration du virus¹⁶. L’utilisation de cette technique chez T. gondii a également été bien décrite, comme l’ont déjà expliqué Ufermann et ses^{collaborateurs 23}.

L’une des premières études utilisant le test de plaque pour observer une réponse dans l’inhibition de T. gondii face à différentes concentrations de molécules a été réalisée par Roberts et al. en 1976¹⁷. Bien que le test de plaque soit largement utilisé pour la titrage^{virale 16,24}, cette méthode n’a été employée que par quelques groupes de recherche pour évaluer l’activité anti-T. gondii des molécules 21,22,25,26,27. À la recherche d’un test permettant de tester des bibliothèques de composés à haut débit, utilisant des matériaux peu coûteux et un laboratoire simple, le test de plaque a été exploré comme alternative au dépistage de drogues en laboratoire de routine. Cela a conduit à l’établissement d’un protocole optimisé permettant l’évaluation simultanée de l’activité de différentes molécules à l’aide de matériaux simples et d’un système d’acquisition d’images, produisant des résultats rapides et reproductibles. Ainsi, nous décrivons ici le protocole détaillé, validé dans notre laboratoire, pour aider d’autres groupes à dépister de nouvelles molécules bioactives contre les tachyzoïtes de T. gondii.

Protocole

La manipulation des parasites et des cultures cellulaires, ainsi que l’élimination et la destination des déchets, ont été réalisées conformément à la législation brésilienne, comme l’exige l’Agence nationale de surveillance sanitaire (ANVISA) RDC n° 222/2018. Toutes les procédures étaient supervisées par le Comité interne de biosécurité (CIBio) de l’ICB-UFMG. Cette étude n’implique pas l’utilisation d’animaux, d’humains ou d’organismes génétiquement modifiés. Des subventions du CNPq, du CAPES et du FAPEMIG ont soutenu ce travail. ESMD (CNPq 308082/2023-0) et RWAV (CNPq 305574/2021-3) sont des boursiers CNPq en productivité. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation du support RPMI-1640 renforcé

REMARQUE : Le milieu RPMI-1640 a été initialement développé pour la culture des cellules leucémiques humaines en suspension et en monocouche. Cependant, des études ultérieures ont démontré son adéquation à diverses cultures cellulaires de mammifères.

1. À la bouteille contenant 250 mL de RPMI-1640, ajoutez 2,5 mL de 200 mM de L-glutamine (100x).
2. Ajoutez 2,5 mL d’antibiotique-antimycotique (100x) au substrat.
3. Ensuite, ajoutez 5,0 mL ou 25 mL de sérum bovin fœtal (FBS) dans la bouteille avec RPMI-1640 (FBS à 2 % ou 10 %).
4. Conserver au réfrigérateur (2-8 °C).

2. Préparation du PBS (1x)

REMARQUE : Pour préparer 1 L de solution saline tamponnée phosphate (PBS) à pH 7,2 et 25 °C, suivez les étapes ci-dessous.

1. Mesurez séparément les quantités suivantes de sels : 1,4 g de Na_{2HPO 4}, 0,24 g de_{KH 2}PO₄, et 8,5 g de NaCl.
2. Ajoutez les sels lestés séparément dans un bécher de 1 L contenant 800 mL d’eau déionisée. Remuez la solution jusqu’à ce que tous les sels soient complètement dissous.
3. Mesurez le pH de la solution à l’aide d’un pHömètre. Ça devrait être 7,2. Si nécessaire, utilisez 6 M d’acide chlorhydrique ou 3 M d’hydroxyde de sodium pour amener le pH à 7,2.
4. À l’aide d’une tige en verre, transférez quantitativement la solution ci-dessus dans une fiole volumétrique de 1 L.
5. Ajoutez de l’eau déionisée à la fiole volumétrique jusqu’à ce que le volume total atteigne 1 L, en veillant à ce que le ménisque soit au bon repère.
6. Mélangez la solution dans la fiole volumétrique, en la renversant doucement.
7. Divisez la solution finale PBS en petites bouteilles en verre (100-250 mL).
8. Autoclave les bouteilles à 121 °C, 1,1 kg/^{cm 2} pendant 15 minutes.
9. Conservez la solution PBS au réfrigérateur (2-8 °C).
   REMARQUE 1 : Utilisez PBS à 37 °C pour toutes les expériences.

3. Préparation d’une solution de formaldéhyde à 4 %

1. Mélangez 35,68 mL de 1x PBS et 4,32 mL de formaldéhyde P.A. à 37 %.
2. Conservez la solution dans une fiole en plastique à température ambiante (25 °C).

4. Préparation de la solution d’origine des molécules actives

REMARQUE : Vérifiez la solubilité des molécules contenues dans le DMSO, le DMF, l’éthanol ou l’eau, et sélectionnez le solvant le plus adapté. Pour minimiser les effets potentiels de toxicité des diluants sur les parasites, la solution d’étape doit être au moins 1000 fois plus concentrée que la concentration la plus élevée du composé à tester. Par exemple, si la concentration la plus élevée à tester est de 1 μM, la solution d’origine doit être d’au moins 1 mM. Pour préparer une solution d’origine de 10 mM, suivez les étapes ci-dessous :

1. Peser le composé à tester à l’aide d’une balance analytique avec une précision de 0,0001 g.
2. Déterminez le volume du diluant nécessaire pour obtenir une solution de 10 mM en utilisant la formule suivante :
   V (mL) = (Y MM) x 100
   Où :
   Y : masse du composé en milligrammes (mg)
   MM : masse molaire du composé
   V (mL) : volume du solvant
3. Ajoutez le diluant au récepteur contenant le composé pondéré.
4. Homogénéisez à l’aide d’un mélangeur vortex.
5. Divisez la solution en petites aliquotes et conservez-les au congélateur à -20 °C.
6. Avant utilisation, laissez la solution aliquote dégeler complètement et homogénéiser à nouveau à l’aide d’un mélangeur vortex.
   REMARQUE : Pour préparer des solutions sous-stock avec d’autres concentrations, utilisez la formule suivante
   V (μL) = x mM × y μL/10 mM
   V (μL) ∶ volume de la solution d’origine nécessaire pour préparer la nouvelle solution
   x mM : concentration désirée de la nouvelle solution.
   y (μL) : volume désiré de la nouvelle solution.

5. Culture cellulaire

1. Utilisez des cellules NHDF en faisant doucement tourner le flacon dans le bain-marie à 37 °C.
   REMARQUE : Les cellules NHDF peuvent être remplacées par des fibroblastes du prépuce humain (HFF) ou d’autres lignées cellulaires formant une monocouche stable. Le test de plaque ne fonctionne qu’avec les lignées cellulaires formant une monocouche stable, c’est-à-dire les cellules dont la croissance s’arrête par contact. Les lignées cellulaires qui ne présentent pas d’inhibition de la prolifération, comme les lignées tumorales, ne peuvent pas être utilisées, car les cellules rivalisent avec les parasites pour les nutriments du milieu de culture et reconstituent la zone de plaque formée par les parasites.
2. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de milieu RPMI-1640 supplémenté (voir étape 1).
3. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Une fois le cycle de centrifugation terminé, une pastille de cellule doit être visible au fond du tube.
4. Jetez soigneusement le surnageant pour préserver la pellete cellulaire.
5. Resuspendez la granule cellulaire avec un milieu RPMI-1640 complété de 12 mL contenant 10 % de FBS et semez trois flasques de^culture de 25 cm ou une fiole² de 75 cm. Après 2 à 3 jours, examinez le(s) flacon(s) de culture à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé pour déterminer la récupération de la prolifération cellulaire (les cellules devraient présenter une confluence d’au moins 40 % à 50 %).
6. Lorsque les cellules atteignent une monocouche complète (confluence à 100 %), retirer le milieu de la fiole à l’aide d’une pipette Pasteur. Jetez le médium et la pipette.
7. Ajoutez 1 à 2 mL de PBS 1x dans la fiole, attendez 1 minute, puis retirez le PBS.
8. Ajoutez 1 mL de solution de trypsine-versène à 0,05 % dans la fiole et placez-la dans l’incubateur avec 5 % de CO₂, d’humidité et une température de 37 °C pendant 2 minutes.
9. Après 2 minutes, observez les cellules au microscope inversé pour confirmer qu’elles se sont détachées.
10. Resuspendez les cellules détachées avec un milieu RPMI-1640 complété de 24 mL avec un FBS de 10 % à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL et d’un distributeur automatique de pipettes.
    REMARQUE : Chaque flacon de culture de 25 ou 75 cm² avec une monocouche confluente peut se répliquer dans 5 ou 15 autres flacons de culture de 25 cm², respectivement.
11. Après avoir ajouté le volume nécessaire de milieu (24 mL), homogénéisez la suspension cellulaire avec la pipette sérologique.
12. Transférez 4 mL de la suspension cellulaire en milieu à chaque 25 cm de 2 flasques ou de 12 mL à^{75 cm 2} flasques. N’oubliez pas de laisser 4 mL de suspension cellulaire dans la fiole initiale.
13. Placez les flasques dans un incubateur contenant 5 % de_CO2, de l’humidité et une température de 37 °C.
14. Attendez qu’une monocouche complète de cellules soit obtenue (100 % de la confluence).
    REMARQUE : Identifiez chaque flasque avec la date et le numéro de passage.

6. Préparation des plaques de culture

1. Inspectez l’intégrité de la monocouche cellulaire (confluence à 100 %) dans la fiole de culture à l’aide d’un microscope inversé.
2. Suivez la procédure de trypsinisation décrite ci-dessus (étapes 5.7-5.9).
3. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, resuspendez les cellules détachées avec un milieu RPMI de 4 mL et transférez-les dans un tube conique de 15 mL.
4. Centrifugez à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante pendant 5 minutes.
5. Jetez soigneusement le surnageant.
6. Résuspendez la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu RPMI-1640 frais.
7. Homogénéisez à l’aide d’un mélangeur vortex.
8. Transférer 10 μL dans un tube de 1,5 mL contenant 490 μL d’une solution de formaldéhyde à 4 % (dilution 1:50) à l’aide d’une micropipette à pointe stérile.
   REMARQUE : Facteur de dilution = (Volume total (μL)) / (Volume d’échantillon (μL))
9. Installez une chambre Neubauer.
10. Homogénéisez la solution fixative avec les parasites (préparée à l’article 6.8) à l’aide d’un mélangeur vortex.
11. Ajoutez 10 μL de la solution avec les parasites fixés dans la chambre de Neubauer.
12. Comptez les quatre quadrants de la chambre de Neubauer, chacun composé de 16 cases.
13. Déterminez le nombre de cellules par mL :
    Nombre de cellules (par mL) = [(n° cellules par carré)/4] x Fd x 10⁴
    Où :
    Fd (facteur de dilution) = 50
14. Semez chaque puits d’une plaque de culture à 12 ou 6 puits, avec respectivement 5 × 10^{cellules de 4} ou 10 x¹⁰ cellules de 5, resuspendues dans 1 ou 2 mL de milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de FBS.
15. Placez les plaques dans un incubateur contenant 5 % de_CO2, une atmosphère humide et une température de 37 °C.
16. Attendez que la monocouche cellulaire atteigne 100 % de confluence.

7. Culture in vitro de la tachyzoïte

REMARQUE : Pour le test de plaque, nous recommandons la souche RH de T. gondii.

1. Éliminez l’ancien milieu d’une fiole² de 25 cm contenant une monocouche complète (confluence à 100 %) de cellules NHDF à l’aide d’une pipette Pasteur. Ensuite, ajoutez 4 mL de nouveau média complet RPMI-1640 dans la fiole.
2. Transférer 5 μL d’un surnageant contenant des tachyzoïtes fraîchement sortis d’une flasque précédente avec une culture infectée lysée. Le volume de 5 μL permet un cycle lytique de 6 à 7 jours par flasque de 25 cm².
3. Placez la nouvelle fiole infectée dans un incubateur contenant 5 % de_CO2, une atmosphère humide et une température de 37 °C.

8. Quantification de la tachyzoïte

1. Retirez le milieu de la fiole de culture contenant les parasites nouvellement sortis à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez dans un tube conique de 15 mL.
2. Centrifugez le tube à 760 x g à température ambiante pendant 2 minutes. Lorsque le cycle d’essorage se termine, une pastille visible est visible au fond du tube.
3. Jetez soigneusement le surnageant.
4. Résuspendez la pellete parasite avec 1 mL de milieu RPMI-1640 frais avec 2 % de FBS.
5. Homogénéisez la suspension parasite à l’aide d’un mélangeur vortex.
6. Transférez 10 μL de la suspension parasite dans un tube de 1,5 mL contenant 490 μL de solution de formaldéhyde à 4 % (dilution 1:50) à l’aide d’une pipette à pointe stérile.
7. Suivez les étapes décrites dans les paragraphes 6.10 à 6.12.
8. Déterminez le nombre de tachyzoïtes par 1 mL.
   REMARQUE : Nombre de tachyzoïtes (par mL) = [(n° tachyzoïtes de carré)/4] x Fd x 10⁴
   Où :
   Fd (facteur de dilution) = 50

9. Préparation du test de plaque pour les molécules actives de créacement, à partir d’une chimiobibliothèque

REMARQUE : Ce test vise à identifier les molécules qui réduisent la prolifération de T. gondii de plus de 50 % à une concentration de 1 μM. Avant d’initier ce test, un test de cytotoxicité (par exemple, méthode MTS ou méthode MTT) doit être réalisé afin de s’assurer que les concentrations de composé utilisées dans le test de plaque ne sont pas toxiques pour les cellules hôtes.

1. Confirmez que les cultures cellulaires ont atteint une confluence de 100 % dans les plaques à 12 ou 6 puits.
2. Jetez l’ancien substrat et ajoutez 1 ou 2 mL de medium RPMI-1640 frais complété, avec 2 % de FBS, dans chaque puits des plaques à 12 et 6 puits, respectivement.
3. Ajoutez les composés à tester dans chaque puits à la concentration souhaitée. Pour le dépistage initial, une concentration de 1 μM est recommandée.
   REMARQUE : Utilisez la formule suivante pour calculer le volume à ajouter à chaque puits.
   V (μL) = (Concentration finale dans le puits (μM) x Volume à l’intérieur du puits (μL))/(Solution stock (μM))
4. Ajoutez 600 tachyzoïtes (pour la plaque à 12 puits) ou 1 000 tachyzoïtes (pour la plaque à 6 puits) de la déformation RH à chaque puits.
   REMARQUE : Des variations dans la prolifération parasitaire peuvent survenir en raison de différences dans les fournisseurs de milieu de culture ou FBS, ou des lignées cellulaires utilisées. Il est donc recommandé de mener une expérience pilote pour déterminer le nombre optimal de parasites pour chaque condition de laboratoire. Ajustez la quantité de parasite utilisée pour cette expérience, si nécessaire.
5. Placez les plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de_CO2 et une atmosphère humide pendant 7 jours sans aucune perturbation.
   ATTENTION : Les plaques ne doivent pas être déplacées ou touchées pendant la période d’incubation de 7 jours. Si cela se produit, l’expérience sera ruinée.

10. Coloration de plaques au violet cristal et acquisition d’images

1. Après 7 jours, retirez le substrat de chaque puits.
2. Lavez chaque puits soigneusement avec 1x PBS à température ambiante.
3. Jetez le PBS et ajoutez soigneusement 1 mL d’alcool à 70 % dans chaque puits. Laissez à température ambiante pendant 15 minutes, puis jetez.
4. Ajoutez la solution aqueuse de violet cristal à 0,5 % et laissez reposer 30 minutes à température ambiante.
5. Retirez la solution de violet cristallin.
6. Lavez chaque puits soigneusement une fois avec de l’eau déionisée.
   ATTENTION : Lorsque vous retirez le médium ou le PBS lors des étapes de lavage, ne touchez pas le fond du puits avec la pointe de la pipette, car cela pourrait endommager l’intégrité de la monocouche. Lors des étapes de lavage, ne jetez pas un jet de PBS ou d’alcool directement sur les cellules. Ajoutez-les avec attention le long du bord du puits.
7. Placez l’assiette face contre le bas sur du papier absorbant pour évacuer l’excès d’eau et laissez-la sécher à température ambiante pendant 24 heures.
8. Photographiez les plaques à l’aide d’un scanner à plateau haute^{définition 28,29} ou d’un système de documentation d’imagerie configuré pour l’option gel bleu Coomassie^21,22,30.

11. Essai de réversibilité

REMARQUE : L’objectif principal du test de réversibilité avec les tachyzoïtes de T. gondii est de déterminer si la capacité de prolifération des parasites traités est complètement abolie ou réduite après le retrait des composés du milieu^{de culture 31}.

1. Semez une plaque à 6 puits avec des cellules NHDF comme décrit à l’étape 6. Pour chaque puits, ajoutez 1 x 10^{cellules de 5} cellules remises dans 2 mL de RPMI-1640 complétée avec 10 % de FBS.
   REMARQUE : Une fois que la monocouche cellulaire atteint 100 % de confluence dans chaque puits, la plaque est prête pour l’analyse de la plaque.
2. Jetez le substrat et ajoutez 1 x 10⁴ tachyzoiteses resuspendus dans 2 mL de milieu frais avec 2 % de FBS dans chaque puits.
3. Après avoir laissé les tachyzoïtes interagir avec les cellules NHDF pendant 1 heure, ajoutez les composés sélectionnés à une concentration finale proche de la valeur inhibitrice de 90 % (IC₉₀). Un puits contenant uniquement le diluant du médicament est utilisé comme témoin positif.
4. Traitez les tachyzoïtes pendant 4 jours dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de_CO2 et une atmosphère humide.
5. Après la période de traitement de 4 jours, lavez la plaque trois fois avec 1 PBS à 37 °C pour garantir l’élimination complète des composés.
6. Ajoutez à chaque puits 2 mL de milieu frais sans les composés et maintenez la plaque dans l’incubateur pendant 7 jours supplémentaires.
7. Teindre la plaque avec un colorant violet cristal et photographiez-la comme décrit à l’étape 10.

12. Analyse d’image utilisant le logiciel ImageJ

1. Ouvrez les images avec le logiciel^{ImageJ 32}.
2. Sélectionnez la zone correspondant à un puits à l’aide de l’outil de sélection ovale (Figure 1A,B).
   REMARQUE : Lors de la sélection, ignorez les régions aux bordures du puits présentant des défauts. Celles-ci sont couramment présentes aux bords du puits.
3. Copiez et créez une nouvelle image : copiez la zone sélectionnée en appuyant sur Ctrl + C ; créer un nouveau fichier image en appuyant sur Ctrl + N ; coller l’image copiée dans la nouvelle fenêtre noire en utilisant Ctrl + V.
   REMARQUE : Lors de la création de la nouvelle image, utilisez les réglages par défaut : 8 bits, remplir en noir, 512 x 512 pixels, et une tranche (Figure 1C).
4. Naviguer vers : Image > Ajuster > seuil, ou appuyer sur Ctrl + Shift + T (Figure 1D).
5. Dans la fenêtre Seuil, sélectionnez les options Huang et Red , puis cliquez sur Auto (Figure 1E).
6. Cliquez sur Analyser, puis sélectionnez Analyser les particules (Figure 1F). Gardez les options par défaut dans la fenêtre qui apparaît et cliquez sur OK (Figure 1G).
7. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Copiez la valeur affichée en %Surface (surlignée par un rectangle rouge à la Figure 1H) pour calculer le pourcentage de prolifération ou d’inhibition du parasite.
8. Répétez ces étapes pour chaque puits sur la plaque.
9. Pour calculer le pourcentage de prolifération, utilisez la formule suivante :
   % de la prolifération = ( % Puits de zone traitée/ % Puits de contrôle de surface) × 100
10. Pour calculer le pourcentage d’inhibition, utilisez la formule suivante :
    % d’inhibition = [1- ( % Zone traitée/ %Puits contrôlé de zone)] × 100

Figure 1 : Analyse étape par étape des résultats dans le logiciel ImageJ. (A) Sélection de l’outil « ovale ». (B) Sélection de la zone d’intérêt de l’image. (C) Nouvelle fenêtre d’image (Ctrl + N) avec les réglages recommandés. (D) Étapes pour « Analyse de seuil après avoir collé la zone d’intérêt dans la nouvelle fenêtre d’image. (E) Huang et sélection des options rouges dans la fenêtre Seuil, ce qui fait que toutes les zones blanches sont remplies en rouge. (F) Séquence des étapes utilisées pour « Analyser les particules ». (G) Le réglage utilisé pour analyser les particules. (H) Le résultat du pourcentage de la superficie totale détruite est affiché dans la fenêtre de résumé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

13. Analyse statistique

1. Organisez les données dans un tableau Excel au sein du logiciel Office après avoir calculé le pourcentage d’inhibition de la prolifération.
2. Ouvrez le logiciel GraphPad Prism 5.0, et cliquez sur XY (Ci-dessous Nouveau tableau & graphe).
3. Dans la section Y (sous « barre X :erreur »), saisissez le nombre de répétitions de données (généralement trois répliques biologiques). Ce nombre peut varier selon le nombre de répétitions effectuées.
4. Sélectionnez Moyenne uniquement à côté du graphique et NE SÉLECTIONNEZ PAS « Entrer et tracer les valeurs d’erreur déjà calculées ailleurs », puis cliquez sur Créer.
5. Placez les données de concentration sur l’axe X et les données sur le pourcentage d’inhibition de la prolifération dans les colonnes A, A :Y1, A :Y2, A :Y3, A :Y4, A :Y5.
6. Cliquez sur = Analyser puis cliquez sur Transformer, puis OK. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Dans cette nouvelle fenêtre, cliquez sur Transformer les valeurs X en utilisant X = Log(X), puis cliquez sur Créer un nouveau graphique des résultats, et enfin OK.
7. Cliquez sur = Analyser puis sur Normaliser. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Dans la section Comment est-il défini 0 % ?, cliquez et définissez Y = 0,0. Dans la section Comment est-il défini à 100 % ?, cliquez et définissez Y = 100 ; sélectionnez Pourcentages et cliquez sur Créer un nouveau graphique des résultats.
8. Cliquez sur le symbole : Ajustez une courbe avec une régression non linéaire située ci-dessus = Analyser. Cliquez sur Dose-réponse - Inhibition, puis sur logaritmte (inhibiteur) vs. réponse normalisée - Pente variable, puis cliquez sur OK.
   REMARQUE : Une fenêtre s’ouvrira affichant les résultats suivants : l’IC₅₀ (concentration inhibitrice de 50 %), l’intervalle de confiance à 95 % et la valeur R2. Ces valeurs sont cruciales et doivent être incluses dans un tableau des résultats de l’article.
9. Pour estimer d’autres concentrations inhibitrices, telles que IC₂₅, IC₉₀ ou IC₉₅, utilisez le lien (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad ; CE : concentration efficace. Rapportez l’IC₅₀ et le HillSlope obtenus par le logiciel Prism pour chaque drogue testée.

Résultats

Pour évaluer le test de plaque après traitement, les contrôles positifs (cellules infectées par les tachyzoïtes et non traitées) et négatifs (cellules non infectées avec 0,1 % de DMSO) sont essentiels. À la fin de l’expérience, le puits témoin positif doit présenter des espaces vides bien définis avec des restes de cellules adhérées (Figure 2). En revanche, le puits de contrôle négatif doit afficher une monocouche intacte sans espaces vides. Le contrôle négatif est crucial pour confirmer l’i...

Discussion

La standardisation de nouveaux protocoles pour les tests antiprolifératifs constitue une étape fondamentale pour faire progresser la recherche scientifique sur l’identification des futurs médicaments. Le protocole présenté ici propose une approche alternative à l’évaluation in vitro de l’activité des molécules bioactives contre les tachyzoïtes de T. gondii. Étant donné que T. gondii est un parasite intracellulaire obligatoire qui locomote par motilité glissante...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % de trypsine-EDTA	Technologies de vie	25300-062
Pipette sérologique de 10 mL	Olen	K17-110
Centrifugeuse à tube Falcon de 15 mL	Fanem	Modèle : 206
Pipette sérologique de 5 mL	Olen	K17-115
Plaque de culture à 6 puits	Sarstedt	833920
Bilan analytique	Mettler Toledo  ;	Modèle : AB204 Numéro de série : 1116473813
Antibiotique-Antimycotique (100X)	Technologies de vie	15240-062
Pipette automatique	Kasvi	K1-AID
Centrifugeuse	Eppendorf	Modèle 5415 R numéro de série : 0023591
Incubateur CO2	PHC Corporation	Modèle n° : MCO-230AICUVL-PA Numéro de série : 210360090
Bouteille de culture 25 cm2	Sarstedt	833910
Diméthylsulfoxyde (DMSO) P.A.	Merck  ;	1,02,95,21,000
Ethanol P.A	Merck	1,00,98,31,000
Sérum fœtal bovin (FBS)	Technologies de vie	12657-029
Formaldéhyde 37-38 %	Panreac	131328
GraphPad Prism  ;	Logiciel GraphPad	-	Version 8.0.1
ImageJ  ; logiciels  ;	-	-	Version 1.52e
Systèmes de documentation d’imagerie	Bio-Rad	Modèle :   ; ChemiDoc MP Imaging System Numéro de série : 734BR2249
Hotte à écoulement laminaire	Veco do Brasil	Modèle : VLFS-09
L-glutamine 200 mM (100X)	Technologies de vie	25030-081
Micro-tube 0,5 mL	Sarstedt	72,699
Fibroblaste dermique humain normal néonatal (NHDF)	Lonza	CC-3132	Généreusement fourni par la Dre Sheila Nardelli, de Fiocruz Paraná, Brésil
Chambre de Neubauer 0,100 mm 0,0025 mm2	Nouvelle optique	7301-1
Compteur	Micronal	Modèle : B374 Numéro de série : 30/37
Pipette 20-200 & micro ; L	Kasvi basic	22032893
Pipette 2-20 & micro ; L	Labmate Pro	656630226
Pipette  ; 0.2-2 & micro ; L	Labmate Pro	556610114
Pipette  ; 1000-5 000 & micro ; L	Uniscience	YM4A021482
Pipette  ; 100-1000 & micro ; L	Eppendorf Research plus	Q34354C
Phosphate de potassium monobasique   ; (KH2PO4) P.A  ;	Synthé	01F2002.01.AF
RPMI-1640 moyen	Sigma-Aldrich & nbsp ;	R0883
Chlorure de sodium (NaCl) P.A.  ;	Cromoline Quí ; mica Fina  ;	-
Dibase phosphate de sodium (Na2HPO4) P.A.	CRQ Produtos Quimicos Eireli	R2715920500
Conseil 1.000 & micro ; L	Sarstedt	7,01,186
Conseil 10 & micro ; L	Sarstedt	7,03,010
Pourboire 5 000 & micro ; L	Sarstedt	70,11,83,001
Tip  ; 200 & micro ; L	Sarstedt	7,03,030
Pipette de transfert   ; (3,5 mL)  ;	Sarstedt	86,11,71,001
Tube 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Cristal violet	Merck	101408
Mélangeur vortex	Phoenix	Modèle : AP56 Numéro de série : 6633
Bain d’eau	Hemoquimica do Brasil	Modèle : HM1003 Numéro de série : 700001556