Méthodes pour la quantification in situ de la morphologie mitochondriale dans les cellules musculaires et terminales de Schwann de souris

Résumé

Injections locales d’une cellule de Schwann terminale marquante mitochondriale in vivo pour microscopie confocale. Cette méthode utilise des preuves de concept démontrées dans le tissu musculaire squelettique de souris avec un muscle sain ou malade pour fournir une visualisation mitochondriale à haute résolution.

Résumé

La morphologie des réseaux mitochondriaux est largement utilisée comme indicateur de la santé cellulaire ; cependant, quantifier l’architecture mitochondriale au sein de tissus intacts reste techniquement complexe. Les cellules terminales de Schwann (tSC), essentielles au maintien et à la régénération des jonctions neuromusculaires, sont particulièrement difficiles à analyser in situ en raison de leur localisation anatomique et de leur sensibilité aux perturbations tissulaires. Ce protocole décrit une approche reproductible pour marquer et quantifier la morphologie des réseaux mitochondriaux tridimensionnels dans le muscle squelettique monté entier et dans les tSC chez la souris à l’aide de la microscopie confocale standard. La méthode utilise l’administration in vivo d’un colorant mitochondrial sensible au potentiel membranaire, suivi d’un traitement tissulaire rapide et d’une imagerie confocale à haute résolution. Les piles d’images sont analysées pour quantifier la connectivité, la surface et la fragmentation des réseaux mitochondriaux. Le protocole est d’abord validé dans le muscle dystrophique et squelettique sain afin de confirmer les différences attendues de morphologie mitochondriale, puis adapté pour visualiser et quantifier les réseaux mitochondriaux chez les tSC identifiées à l’aide de souris rapporteures S100β. Cette approche permet d’analyser la morphologie mitochondriale au sein de tissus neuromusculaires intacts sans nécessiter de rapporteurs mitochondriaux transgéniques ni de plateformes d’imagerie spécialisées. Le protocole ne requiert que des équipements couramment disponibles dans les installations centrales universitaires et peut être adapté à d’autres tissus fins ou accessibles en surface.

Introduction

Les mitochondries sont remarquablement des organites plastiques qui agissent comme les poumons de la cellule, consommant de l’oxygène lors de la respiration cellulaire pour soutenir la production d’adénosine triphosphate (ATP) en réponse à la demande^{métabolique 1}. Bien qu’autrefois considérés comme des organites discrets, il est désormais compris que les mitochondries sont fortement^{intégrées 2,3,4}, partageant un substrat énergétique dans tout leur réseau en accord avec les besoins locaux. L’intégration offre un avantage distinct par rapport à l’isolement : les mitochondries connectées soutiennent des déficits énergétiques, maintenant des gradients électrochimiques pour la phosphorylation oxydative lors d’une demande métabolique élevée. En effet, la distribution, le volume et la morphologie des mitochondries correspondent aux besoins énergétiques dans leur^{environnement, 5}. En santé, le renouvellement régulier des réseaux mitochondriaux est maintenu par la biogenèse mitochondriale, les événements de fusion et de fission, ainsi que la mitophagie ^2,3. La biogenèse mitochondriale est nécessaire pour maintenir et étendre des mitochondries saines. La demande métabolique, telle que l’exercice physique, augmente l’expression du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysome γ co-activateur 1α (PGC-1α)⁵. Ce processus se produit via des signaux d’endurance primaires, en particulier l’élévation induite par l’exercice de la kinase protéine activée par l’AMP (AMPK), du calcium et des espèces réactives de l’oxygène ^6,7. La fusion élargit les réseaux, favorisant la survie et complétant les déficits, tandis que la fission atténue les dommages mitochondriaux supplémentaires par l’exclusion préférentielle de la région ^{dysfonctionnelle 2,3,8}. Une fois retirées, les régions exclues doivent subir une mitophagie, empêchant ainsi l’accumulation d’organites et de protéines^{dysfonctionnels 6,9}.

Le muscle squelettique représente environ 40 % de la masse corporelle et dépend des mitochondries pour le métabolisme aérobie et la signalisation cellulaire afin de maintenir l’homéostasie¹⁰. Collectivement, dans les troubles du muscle squelettique, les mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale sont^{altérés 10}. Les études sur la dysfonction musculaire mesurent généralement la respiration mitochondriale, le volume, la morphologie et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) afin d’évaluer la qualité mitochondriale ^3,10. À cet égard, lors d’une dysfonction musculaire prolongée, la respiration mitochondriale est réduite, tandis que les OR sont augmentés et les réseaux sont^{fragmentés 3,10}. Les perturbations de la morphologie mitochondriale proviennent principalement de l’activation des protéines de fission mitochondriale, de la protéine liée à la dynamine 1 (DRP1) et de la fission mitochondriale 1 (FIS1)^2,8,11. En réponse à l’atrophie musculaire, FIS1, résidant à la surface de la membrane mitochondriale externe, recrute DRP1 pour oligomériser avec plusieurs dimères DRP1 afin de créer un filament autour des mitochondries, diminuant de taille jusqu’à ce qu’une section donnée soit « pincée », favorisant la^{fragmentation 3,11}. Ensemble, la suractivité de la fission mitochondriale, la réduction de la fusion des mitochondries nouvellement formées et la dysfonction mitophagesie sont responsables de l’apparence fragmentée des réseaux mitochondriaux dysfonctionnels, comme ceux décrits dans les muscles inactifs^{ou malades 2,12}.

La jonction neuromusculaire (NMJ) est le site de l’excitation musculaire. Les potentiels d’action initiés dans le soma se propagent le long des axones, enveloppés par des cellules de Schwann myélinisantes (SC), et se terminent aux NMJ, qui sont encapsulés par des cellules de Schwann terminales (tSC). Les NMJ peuvent se régénérer après une blessure. Cependant, la probabilité et la rapidité de régénération diminuent à mesure que la distance entre le site de la blessure et le NMJ^{augmente de 13,14}. Après une lésion nerveuse par section, écrasement ou étirement, les cellules de césure se dédifférencient en un état progéniteur démyélininé^15,16. Les SC démyélinisées prolifèrent et agissent de concert avec les macrophages pour remodeler l’environnement local afin de la régénération en éliminant les débris entre le site de la blessure et la souche axonale proximale à travers la dégénérescence^{wallérienne 17,18}. Les SC migrateurs signalent une réponse inflammatoire qui remodele l’environnement pour une régénération nerveuse^{réussie 18}. La régénération nerveuse se produit à l’intérieur de la gaine neurale formée par les SC progénitrices, qui forment des bandes de Bunger, à travers lesquelles les axones refont^{pousser 19}. Le moignon axonal étend alors les filopodies pour initier la^{réinnervation 14}. Après réinnervation, la présynapse peut se régénérer complètement, à condition que les tSC réinvestissent au niveau du^{NMJ 20}.

La morphologie mitochondriale varie fortement selon les types cellulaires, en se conformant à la fonction^{tissulaire 21}. Les rapports des tissus hépatiques suggèrent que les mitochondries sont plus compactes et sphériques, tandis que celles de la substance blanche du cerveau sont plus allongées et^{tubulaires 22}. Lors d’un défi, comme dans des conditions de vieillissement et de stress oxydatif, les mitochondries présentent un phénotype semblable à un donut. Cependant, chez les ostéoblastes, la formation et la fragmentation des beignets mitochondriaux étaient associées à une sécrétion accrue des mitochondries et des vésicules dérivées des mitochondriales, ainsi qu’à la maturation des^{ostéoblastes 23}. Bien que les réseaux mitochondriaux des muscles squelettiques aient été largement examinés chez plusieurs espèces, des limites subsistent dans l’imagerie des réseaux mitochondriaux issus des tSC du système nerveux périphérique. Ces tissus sont difficiles à capturer dans leur environnement naturel, car l’ultrastructure cellulaire est significativement modifiée après l’isolement, et ces tissus sont difficiles à cibler avec un colorant in vivo sans charger également le muscle squelettique associé.

Les techniques d’imagerie utilisées pour capturer la morphologie mitochondriale dans les systèmes vivants peuvent être classées en microscopie optique ou^{électronique 5}. Avec la microscopie traditionnelle à capture de lumière, les colorants peuvent marquer les cellules vivantes, les cellules fixes peuvent être immunomarquées, et les mitochondries peuvent être marquées^{génétiquement 5,24}. L’imagerie des cellules vivantes nécessite généralement d’incuber les cellules pendant 20 à 60 minutes avant l’analyse de fluorescence. Les colorants sont dirigés vers les mitochondries via le potentiel membranaire et, par conséquent, peuvent être modifiés dans des conditions de potentiel membranaire^{modifié 5}. La capture de la morphologie mitochondriale des tSC au sein du muscle squelettique via la charge de colorants est théoriquement possible ; cependant, cela nécessiterait l’imagerie des tissus entiers et des techniques d’affichage détaillées. En particulier, il capture les mitochondries à l’intérieur de structures intactes, sans interférence du marquage musculaire squelettique. Pour surmonter ces limitations, la coloration fluorescente mitochondriale a été utilisée pour marquer le muscle squelettique vivant chez des souris saines et dystrophiques, suivie du marquage des mitochondries tSC pour l’imagerie in vivo et in situ. Le muscle tibial antérieur (TA) a été sélectionné pour optimiser l’imagerie musculaire squelettique en raison de sa localisation anatomique superficielle, de son volume d’injection bien caractérisé et de sa dispersion^myofasciale 25,26,27, ainsi que de son adéquation à des mesures fonctionnelles simultanées. Le muscle fessier grand (GM) a été sélectionné pour l’imagerie des tSC sur la base de sa procédure d’injection^{établie 28,29}, de son architecture mince qui minimise la fluorescence de fond, et du positionnement ventral superficiel des jonctions neuromusculaires entre le GM et le moyen fessier, permettant un marquage préférentiel des TSC avant les fibres musculaires squelettiques.

Protocole

Un mâle adulte DBA/2J de six mois (n=3) [Wild-type (WT)] (RRID : IMSR_JAX :000671) et D2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID : IMSR_JAX :013141), tandis que des adultes de trois à cinq mois (n=8) mâle et femelle B6 ; D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B) (RRID : IMSR_JAX :005621) [également regroupé avec WT en raison de l’absence de différences avec DBA] a été utilisé à partir d’une colonie en cours de souris maintenue par l’enquêteur. Le flux de travail expérimental global pour les injections TA et GM, le traitement tissulaire et l’imagerie est résumé à la Figure 1. Un D2 supplémentaire. La souris mdx a été donnée par l’investigateur pour l’imagerie des TC dans le mdx (n=1). Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation institutionnelles des animaux de l’Université Texas A&M (AUP 2022-0215) et ont été menées conformément au Guide du Conseil national de la recherche pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (8e édition⁾³⁰. L’euthanasie a été réalisée par une luxation cervicale sous une surdose anesthésique d’isoflurane.

1. Préparation d’une solution de travail de coloration mitochondriale fluorescente de 2 μM

1. Suspendre la coloration mitochondriale (50 μg) dans 322 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) selon les instructions du fabricant pour préparer une solution de type 200 μM.
2. Pour préparer 30 mL de solution de travail à 2 μM, transférez 300 μL de solution de type 200 μM dans 29,7 mL de solution stérile. Mélangez soigneusement.
3. Aliquote 250 μL de la solution de travail de 2 μM dans des tubes de microcentrifuge et conserve à -80 °C jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : Aucune dégradation détectable du signal n’a été observée après 3 ans de stockage à -80 °C.

2. Teinture et préparation animale

1. Décongelez une aliquote congelée 15 minutes avant l’expérimentation. Aspirez la solution dans une seringue d’insuline de 30 G, 1 cc.
2. Anesthésiez l’animal avec de l’isoflurane. Appliquez une pommade ophtalmique, rasez le site d’injection et maintenez la température corporelle à l’aide d’une lampe chauffante avec une sonde de température placée entre l’animal et la source de chaleur.
3. Nettoyez le site d’injection rasé avec de l’alcool isopropylique à 70 %.

3. Administration et fonction du colorant mitochondrial musculaire tibial antérieur (TA)

1. Administration des colorants TA
   1. Injecter 50 μL de coloration mitochondriale 2 μM dans le muscle TA droit de souris anesthésiées WT et D2.mdx.
   2. Insérez l’aiguille au niveau du tendon distal vers le genou et appuyez sur le piston tout en retirant l’aiguille le long du trajet d’injection.
   3. Incubez le colorant in vivo pendant 1 heure avant la dissection.
2. Mesures de la fonction musculaire TA
   1. Après 45 minutes d’incubation du colorant, anesthésiez la souris avec de l’isoflurane (induction 2 % à 3 %, 1,5 % à 2 % d’entretien en oxygène).
   2. Exposez chirurgicalement le muscle TA gauche tout en préservant les tissus environnants. Attachez le tendon distal à la poutre de charge du système de test musculaire.
   3. Bandez le muscle exposé avec une lingette de laboratoire et irriguez à 3 mL min⁻¹ avec une solution saline stérile à 0,9 % chauffée à 40 °C. Maintenez la température musculaire à 32 °C à l’aide d’une lampe chauffante.
   4. Placez des électrodes en fil de platine/iridium sur le ventre musculaire pour une stimulation directe.
   5. Fixez le faisceau de charge à un micromètre et ajustez la longueur optimale (L₀) en utilisant des contractions à contrecarreaux (T_w) à 1 Hz. Enregistrez L₀ avec un étrier numérique.
   6. Induire trois contractions tétaniques maximales (P₀) à 140 Hz avec 60 secondes de repos entre les contractions. Notez la valeur de force la plus élevée (g). Recueillez des données en utilisant le système de fonction musculaire avec un logiciel d’analyse.
3. Traitement des tissus TA
   1. Après l’incubation, isoler et disséquer le muscle TA avant l’euthanasie.
   2. Placez des faisceaux isolés de fibres musculaires dans du paraformodéhyde à 4 % à température ambiante pendant 15 minutes tout en taquinant doucement les fibres sous un stéréomicroscope.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique et doit être manipulé dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire).
   3. Ajoutez la coloration de l’acide nucléique permanent aux cellules à une concentration finale de 5 à 10 μg/mL pour marquer les noyaux.
   4. Lavez les échantillons trois fois dans du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) pendant 5 minutes chacun pour éliminer l’excès de colorant.
   5. Déshydratez séquentiellement des échantillons à 50 %, 75 % et 100 % d’éthanol pendant 5 minutes chacun.
   6. Incubez les échantillons séquentiellement dans des solutions de déblaiement tissulaire I et II pendant 30 minutes chacune à température ambiante, en utilisant un volume suffisant pour immerger complètement le tissu.
   7. Placez les faisceaux de TA dégagés sur une tobe de couverture et aplatissez-les doucement à l’aide d’un bloc de verre (2,5 cm × 2 cm × 1 cm ; masse 7,8 g)²⁶.

4. Imagerie des échantillons de muscle TA

1. Imagez des échantillons musculaires avec un microscope confocal pour obtenir des sections optiques tridimensionnelles (3D) à haute résolution.
2. Acquérez des images Z-stack à une profondeur d’environ 100 μm pour le muscle à l’aide d’un objectif à grossissement 63x (N.A. 1,40).
3. Utilisez le logiciel confocal du système d’imagerie avec une longueur d’onde d’excitation de 646 nm pour offrir la plus grande clarté avec le moins de fond possible.
4. Acquérir des images en mode déconvolution, en employant des paramètres « System Optimized » avec des pas de 1 μm.
   REMARQUE : Pour lutter contre la déshydratation et le photoblanchiment, transférez les tissus dans la solution dégageante II et placez-les sur une gaine de protection. Placez deux gouttes de solution de dégagement 2 directement sur le tissu avant l’imagerie.

5. Charge de colorant et imagerie musculaire GM

1. Utilisez des souris S100β pour l’identification spécifique des tSC par fluorescence.
2. Réalisez une petite incision cutanée au-dessus du muscle GM. Injectez 75 μL d’une teinture mitochondriale fluorescente rouge lointain de 2 μM sous le GM, avant la fermeture de la^{plaie 25}.
3. Fermez la plaie et laissez le colorant incuber pendant 45 minutes pour étiqueter sélectivement les tSCs sans marquer significativement les fibres musculaires sous-jacentes.
4. Disséquez les muscles MG et placez-les immédiatement dans une solution stérile froide à 0,9 %. Coupez rapidement l’excès de graisse et de tissu conjonctif.
5. Transférez les GM disséqués sur une enveloppe pour imagerie.
6. Seulement si vous utilisez des souris D2.mdx, ajoutez un colorant fluorescent du récepteur de l’acétylcholine (AChR) à une dilution 1:500 dans le bain de microdissection. Incubez le tissu pendant 30 minutes pour visualiser les composantes postsynaptiques de la jonction neuromusculaire (NMJ).
7. Utilisez cette approche de double marquage pour différencier les mitochondries postsynaptiques des mitochondries spécifiques aux tSC.
   ATTENTION : Limitez la dissection et le nettoyage du GM à un maximum de 10 minutes avant de le placer sur une gâchette pour imagerie afin de minimiser les changements morphologiques après la dissection. Cette limite de temps est cruciale pour minimiser les changements morphologiques post-dissection et la dégradation mitochondriale.
8. Effectuer une microscopie confocale pour obtenir des sections optiques tridimensionnelles (3D) à haute résolution.
9. Acquérir des images Z-stack à une profondeur d’environ 16 μm pour les tSC à l’aide d’un objectif à grossissement 20x (N.A. 0,75). Obtenez des images représentatives haute résolution de tSC individuels à l’aide d’un objectif à grossissement 63x.
10. Mettez en place des procédures de montage pour minimiser la déshydratation tissulaire et le photoblanchiment pendant la séance d’imagerie.
    ATTENTION : Transférez les tissus en solution saline sur une couche de protection, en veillant à ce que le côté ventral soit orienté vers le bas pour la microscopie inversée.
11. Appliquez 2 μL de substrat de montage général sur la surface dorsale du GM.
12. Aplatir doucement le tissu à l’aide d’un bloc de verre calibré (2,5 cm × 2 cm × 1 cm ; masse 7,8 g) pour assurer un plan d’imagerie uniforme.

6. Microscopie à faisceau ionique focalisé

1. Effectuer la microscopie électronique à faisceau d’ions focalisé (FIB-SEM) selon les protocoles²⁶ établis précédemment.
   1. Appliquer la FIB-SEM spécifiquement pour confirmer et visualiser les nouvelles caractéristiques morphologiques identifiées lors de l’imagerie confocale.

7. Analyse d’images

1. Échantillons de muscle TA
   1. Réaliser une analyse quantitative des sections optiques confocales (1 μm) des scans TA (environ 75–112 μm d’épaisseur) à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image piloté par l’IA.
      REMARQUE : Effectuez plusieurs sessions de formation supervisées avant la segmentation automatisée afin d’améliorer l’adaptation de l’algorithme.
   2. Importez des sections optiques uniques (tranches Z) pour apprendre au logiciel à conserver des informations pixelisées représentant le colorant mitochondrial blanc tout en excluant le fond noir.
   3. Développer des masques d’image pour la revue par l’enquêteur afin d’assurer une analyse et une précision de haute qualité.
   4. Séparez les empilements d’images 3D en sections optiques uniques après optimisation de l’algorithme.
   5. Sélectionnez chaque cinq tranche Z de chaque image 3D pour analyse, chaque point de données représentant la moyenne de ces sections individuelles par échantillon.
   6. Quantifiez la morphologie mitochondriale pour dériver la distribution spatiale et les métriques de connectivité réseau.
   7. Standardiser les seuils d’intensité, les réglages de détection des contours et la calibration de la taille des voxels sur tous les échantillons afin de minimiser la variabilité expérimentale.
2. TSCs sur les échantillons GM
   1. Assemblez des sections optiques de 1 μm en piles Z (environ 6 à 25 μm d’épaisseur) et séparez les images en canaux de couleur individuels à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image 2D.
   2. Calibrez le logiciel à l’aide de barres d’échelle et appliquez un seuil pour optimiser la visualisation des mitochondries tSC avec un minimum d’interférences de fond.
   3. Effectuer la binarisation et supprimer le bruit de fond pour isoler les mitochondries tSC ou les tSC afin de mesurer la surface et le nombre de particules.
   4. Sauvegardez les images binaires pour garantir un traitement cohérent et réalisez toutes les expériences d’imagerie dans des conditions identiques afin d’assurer la reproductibilité entre réplications biologiques.

8. Immunohistochimie

1. Insérer des échantillons de muscle TA gauche dans un composé optimal à température de coupe (OCT) pour évaluer la surface de la section transversale (CSA).
   1. Échantillons en coupe à une épaisseur de 10 μm à l’aide d’un cryostat réglé à -17°C et collectés sur des lames de microscope.
   2. Les coupes transversales musculaires de la tache pour la laminine permettent d’identifier les bordures de myofibres en utilisant l’anticorps primaire anti-laminine du lapin (1:400) et l’anticorps secondaire anti-lapin-Rhodamine de chèvre (1:400).
   3. Montez les lames avec un support de montage approprié avant l’imagerie.
2. Imager les lames à l’aide d’un microscope confocal en sélectionnant aléatoirement 2 à 3 régions d’intérêt (580 x 580 μm) par échantillon avec un objectif de 20x (N.A. 0,75).
3. Valeurs moyennes par muscle dans les régions et analyse d’environ 400 myofibres par section musculaire TA.
4. Utilisez un logiciel semi-automatique de segmentation musculaire pour déterminer la CSA (μm²) en masquant les myofibres.

9. Analyse statistique

1. Rapportez les données résumées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (S.E.M.).
2. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique dédié, en utilisant des tests t d’Étudiant paramétriques et non appariés pour déterminer la signification entre les différences moyennes de groupes.
3. Effectuer des régressions linéaires simples sur la CSA et la force musculaire des muscles TA, en les utilisant comme marqueurs de la pathologie de la DMD pour comparer la morphologie mitochondriale du muscle TA et des TSC GM.
4. Évaluer les coefficients de corrélation Pearson-r afin de déterminer la corrélation entre la pathologie de la DMD et la pathologie mitochondriale. Définissez la signification statistique comme P ≤ 0,05.

Résultats

Les réseaux mitochondriaux ont montré des réductions attendues de connectivité
Des images fluorescentes 3D représentatives des scans confocaux musculaires TA répartis en deux groupes, WT et mdx, sont présentées (Figure 2). Comparé au groupe WT, la connectivité mitochondriale semble réduite chez les souris mdx par rapport aux WT (Figure 2A–D). Un plus grand nombre de petits fragments mitochond...

Discussion

La localisation des mitochondries dans les structures cellulaires, ainsi que leur morphologie, sont corrélées à la santé mitochondriale et à la demande^{métabolique 21}. Compte tenu de la pertinence clinique de la santé mitochondriale, associée à la cinétique respiratoire divergente et aux morphologies de différents types cellulaires, une méthode facilement appliquée, basée sur la microscopie confocale, pour l’évaluation des morphologies mitochondriales dans les tSC,...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	Système de fonction musculaire avec logiciel d'analyse
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	Logiciel d'analyse d'image piloté par l'IA
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	Étiquette de bordure de myofibrille
Souche de souris B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostat Cryostar NX50	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	Cryostat
Souche de souris D2.B10-DMDD2.mdx/J	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
Souche de souris DBA/2J	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	Réactif de reconstitution pour coloration mitochondriale
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Colorant d'acides nucléiques perméant les cellules
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	Logiciel d'analyse 2D
Réactif anti-décoloration Invitrogen ProLong Gold avec DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	Milieu de montage
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	Essuie-laboratoire
Logiciel Leica LAS_X	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	Logiciel confocal
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	Colorant mitochondrial fluorescent rouge lointain
Logiciel NIS-Elements Advanced Research	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	Logiciel d'analyse de la surface de section transversale
Milieu de montage Permount	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	Milieu de montage général
Logiciel Prism 9	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	Logiciel d'analyse statistique
Rhodamine (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	Anticorps secondaire
Microscope confocal Stellaris 5 à lumière blanche et logiciel de déconvolution correspondant	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	Microscope confocal
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	Microscope stéréo
Composé Tissue-Plus O.C.T.	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	Composé à température de coupe optimale
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	Solution de clarification tissulaire 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	Solution de clarification tissulaire 2
α-bungarotoxine 552	Biotrend, Koln, Germany	00014	Colorant pour les récepteurs de l'acétylcholine