Article de méthode

Un modèle préclinique de la synovite utilisant un tissu synovial humain ex vivo avec fonction et architecture préservées

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DOI :

10.3791/69734

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20 mars 2026

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1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un système transwell ex vivo humain capable d’évaluer les modifications inflammatoires aiguës, infectieuses et structurelles du synovium.

Résumé

L’arthrite est un état inflammatoire au sein des articulations entraînant des lésions du cartilage, de la douleur et une perte de mobilité. Les avancées récentes en recherche sur l’arthrite démontrent spécifiquement que la capsule articulaire (par exemple, la synovium) est une source importante de cette inflammation, mais il n’existe aucun modèle humain reproduisant l’architecture synoviale essentielle. Pour y remédier, le Joint Space Analysis System, ou JSAS, a été créé. Un synovium antérieur a été obtenu en perpétuation chirurgicale chez des patients subissant une arthroplastie totale du genou (ATG). Le synovium a été disséqué et sectionné en cœurs de biopsie de 3 mm. Les carottes étaient placées dans le puits supérieur d’un puits de 5 μm ou 0,4 μm avec 300 μl de DMEM et 10 % de FBS. Dans le puits du fond, 600 μL de média ont été ajoutés, et échangés tous les 2 à 3 jours. La viabilité a été évaluée jusqu’à 7 jours dans les conditions d’incubation hyperoxyque (50 %), atmosphériques/standard (~21 %) et physiologiques (5 %). Les stimuli dans le puits du fond comprenaient la protéine chimioattractive monocytaire 1 (MCP-1/CCL2), le lipopolysaccharide (LPS), la N-acétylcystéine, S. aureus et B. burgdorferi. Un milieu était stocké pour l’ELISA, et le tissu était stocké pour l’analyse de la paraffine fixe au formol (FFPE). Dans des conditions normales, la synovium est restée pleinement viable pendant 3 jours. Le stimulus a modifié la structure et la fonction des cellules synoviales intimes et sous-couchantes, incluant la perte de la bordure macrophage résidente, l’expansion de la sous-membrane, la régulation à la hausse des fibroblastes pathogènes, ainsi que la production des cytokines IL-1β et TNFα. Les cellules immunitaires et les fibroblastes ont migré vers la chambre inférieure (pores de 5 μm) par analyse de cytométrie en flux. Les B. burgdorferi mobiles ont migré dans les tissus à la taille des pores de 0,4 μm tandis que S. aureus non mobile ne l’a pas fait. Les cytokines pertinentes ont été exprimées en quantité suffisante pour ELISA. JSAS est un système modulaire capable d’étudier les altations aiguës du synovium humain, permettant la complexité des structures 3D dans un modèle préclinique tout en maintenant une structure et une fonction biologiquement pertinentes.

Introduction

L’arthrite touche plus de 20 % de tous les adultes américains et 50 % des personnes de plus de 65 ans atteintes de maladieschroniques 1. C’est aussi une cause majeure de handicap dans lemonde 2. L’arthrite inclut non seulement des lésions cartilagineuses, mais aussi l’inflammation de la capsule articulaire ou du synovium (par exemple, la synovite). La synobine chronique est probablement une source majeure de cytokines pro-inflammatoires qui potentialisent les dommages osseux et cartilagineux dans l’arthrose et la polyarthriterhumatoïde 3,4. Par conséquent, comprendre les changements médiés par le système immunitaire dans le synovium est probablement essentiel pour développer de nouvelles options thérapeutiques et éventuellement préventives pour les patients atteints d’arthrite.

Le synovium est une structure organisée composée de deux couches principales : la muqueuse intime cellulaire (IntL) et la sous-membrane (SubL). L’IntL interagit avec le liquide synovial (SF), et le SubL produit des composants SF et contient des structures vasculaires5. Au sein de l’IntL, on trouve à la fois des macrophages et des synoviocytes de type fibroblaste (FLS). Les macrophages de l’IntL sont des cellules résidentes, renouvelées localement par des macrophages interstitiels au sein du SubL6. Ces macrophages synoviaux résidents (RSM) sont biaisés vers M2 par l’expression de CD206 et TREM2, épithélialisés, et expriment des marqueurs de jonction serrée. Cette sous-structure de l’IntL pourrait être essentielle pour le maintien fonctionnel et physique de l’homéostasie de l’espacearticulaire 5,6. Cela a été observé dans la polyarthrite rhumatoïde (PR). Par exemple, lorsque l’IntL tombe en panne, les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde présentent des symptômes de poussée, qui disparaissent lorsque la muqueuse se reconstruit 6,7. La rémission spontanée de la PR est spécifiquement associée à MerTK +CD206+ macrophagessynoviaux 7. Les MRR ont également été identifiées chez les SF de patients souffrant de douleurs articulaires aiguës, constatant que la gravité des maladies infectieuses ou inflammatoires était corrélée à la quantité de MRS et de cytokinesinflammatoires 8. Malheureusement, la relation entre les structures IntL et SubL, les altérations fonctionnelles des RSM et FLS, et la production de médiateurs inflammatoires pouvant endommager le cartilage et/ou l’os est difficile à interroger, surtout chez l’humain.

Pour interroger les mécanismes sous-jacents de la synovite dans plusieurs contextes cliniquement pertinents, un modèle humain ex vivo appelé Joint Space Analysis System (JSAS) a été développé. Ce système produit des résultats reproductibles avec des éléments modulaires permettant une évaluation large de l’arthrite inflammatoire et infectieuse. Cet article décrit les processus d’acquisition tissulaire issus des chirurgies articulaires ouvertes courantes, telles que le remplacement total de l’articulation, la conception JSAS, l’histomorphométrie nécessaire pour quantifier les altérations structurelles aiguës dans la synovium, ainsi que les réponses fonctionnelles du tissu, notamment par immunofluorescence (FI), ARNoscope et immunosorbent enzymatique lié (ELISA). Le JSAS se distingue des modèles humains in vitro courants en maintenant les structures IntL et SubL, permettant ainsi des analyses quasi in vivo sur la synovite aiguë ou aiguë sur la maladie chronique qui entraîne des lésions du cartilage. En maintenant la structure native du synovium, il est possible de disséquer les capacités intrinsèques du RSM et du FLS pour atténuer ou perpétuer l’inflammation. En tant que modèle ex vivo , il ne nécessite ni la différenciation des cellules immunitaires périphériques en macrophages synoviaux ni une simplification excessive du synovium à seulement 1 ou 2 types cellulaires distincts. Elle se distingue des modèles animaux tels que l’arthrite induite par le collagène (ACI) en utilisant des tissus humains naturellement malades, permettant une évaluation spécifique au pathogène et pertinente pour l’humain. Enfin, plusieurs infections peuvent être simulées, permettant d’obtenir un modèle d’arthrite septique en plus de l’arthrose et de l’arthrite inflammatoire. La principale limitation est la culture pendant 3 jours dans des conditions normales avant l’apparition de l’apoptose.

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Protocole

Le consentement du patient et le protocole de traitement des tissus ont été approuvés par le comité d’examen institutionnel local (IRB). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Acquisition tissulaire et biopsie

  1. Identifier les patients préopératoires en fonction des plannings du chirurgien. Recrutez des patients âgés de 18 à 65 ans qui subissent une chirurgie articulaire ouverte, telle qu’une arthroplastie totale du genou (ATG) ou une ostéotomie du tubercule tibial (TTO, également appelée Fulkerson), et qui ne prennent pas de traitement immunomodulateur systémique.
    REMARQUE : Idéalement, excluez les patients ayant subi plus d’une arthroscopie ou plus d’une injection de glucocorticoïdes, car ces patients présentaient une insuffisance d’acquisition tissulaire intraopératoire plus élevée que d’autres populations due à la fibrose. Compte tenu du risque de transmission d’infection, il faut différer le recrutement de patients ayant des antécédents d’hépatite C ou de virus de l’immunodéficience humaine (VIH), sauf si cela est pertinent pour les résultats. Adoptez en permanence des pratiques de manipulation sûre avec des tissus humains frais, quel que soit le statut de maladie infectieuse.
  2. Les chirurgiens orthopédistes réalisent l’arthrotomie et la dissection dans le cadre de la procédure opératoire standard. Identifiez la synovium antérieure immédiatement proximale au sillon trochléaire et utilisez l’électrocautérité pour exciser la synovium en bloc tout en évitant la dissection du muscle articulaire du genre ou près des épicondyles médiaux et latéraux. La synocectomie est relativement neutre pour les résultats de la TKA et, dans des conditions inflammatoires, peut être bénéfique 9,10. Passez le synovium stérilement au membre de l’équipe de recherche et placez-le dans un contenant stérile à échantillons avec de la solution de sérum sulfurisée au phosphate (DPBS) froide de Dulbecco sur glace.
    REMARQUE : Interrompre l’acquisition tissulaire si des anomalies sont observées par l’équipe chirurgicale, ou si la synovectomie pourrait altuer la fermeture ou le résultat chirurgical. Cette dernière option est particulièrement rare dans la TKA, car l’excision synoviaire peut être utilisée comme procédée extensile pour desserrer les articulations serrées. La quantité d’excision dépend de la taille de l’expérience. Il est possible d’obtenir environ quatre carottes de biopsie de 3 mm par1 cm 2 de tissu. Dans de nombreux cas, il est possible d’obtenir 24cm 2 ou plus de tissu. Le poids tissulaire dépend fortement de la dissection chirurgicale, il n’est donc pas aussi fiable que la surface pour déterminer l’adéquation de l’expérience. La figure 1 illustre les étapes 1.2-1.7.
  3. Retournez la synovium au laboratoire et lavez-la deux fois dans un DPBS froid pendant 10 minutes sur un bascule à plaques.
  4. Transférez la synovium dans une boîte de Petri stérile de 10 cm ou plus dans des conditions stériles dans un cabinet certifié biosécurité niveau 2 (BSL2). Ajoutez des médias froids, stériles et à faible taux de glucose, le milieu Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, contenant du pyruvate de sodium et de la L-glutamine, suffisamment pour remplir la plaque à moitié. Identifiez la muqueuse synoviale par la couche nacrée IntL (Figure 2A), par opposition au côté cautérisé (Figure 2B).
    REMARQUE : L’IntL est fragile. Attention à ne pas la décoller, sinon elle se dissociera de la sous-membrane (Figure 2A, saisie par l’hémostat). La nacréescence peut être modifiée par des antécédents d’hémarthrose (apparaissant jaune-orangé à cause de l’héosidérine), un IMC élevé (couvert d’adipeus) ou une inflammation (rouge, friable et villose). Il est absolument essentiel d’identifier correctement l’IntL avant de procéder. Examinez attentivement les signes d’excision chirurgicale, de cautérage, de saignement et de coagulation afin de déterminer que les étapes suivantes ne sont pas en cours sur l’IntL.
  5. On dissèque les tissus adipeux et stromes extrinsèques du côté cautérisé pour isoler le synovium, en maintenant environ 4 à 5 mm de profondeur tissulaire dans toutes les zones. Des ciseaux à iris ou des scalpels peuvent être utilisés selon les préférences personnelles. Changez le support de la boîte de Petri si nécessaire pour maintenir le champ de vision.
    REMARQUE : Le tissu stromal postérieur ou adipeux est facilement excisé. Cependant, la difficulté à la dissection ou la sensation d’une grande résistance sont indicatrices de ligaments retenus, de métaplasie tissulaire comme un dépôt cartilagineux inapproprié, ou de coupes à travers l’IntL.
  6. Une fois disséqués à la profondeur appropriée, obtenir des carottes de biopsie de 3 mm selon les besoins pour un minimum de 2 réplications techniques par condition testée. Jouez avec la muqueuse synoviale tournée vers l’outil de carottage plutôt que contre la surface de la boîte de Pétri. Un punch de biopsie de qualité peut être utilisé environ 10 à 15 fois avant d’avoir besoin d’être remplacé en raison d’un émoussement, car un punch de biopsie émoussé peut endommager la structure de la muqueuse intime.
    1. Effectuez le carottage avec une charge perpendiculaire forte et une torsion douce. Si cela tord le tissu, l’outil de biopsie est devenu émoussé et doit être remplacé. Stabilisez avec la main non dominante à l’aide de pinces ou d’hémostats.
      REMARQUE : Des carottes de 3 mm ont été utilisées pour maximiser la perfusion tissulaire ainsi que le nombre de carottes par patient et garantir suffisamment de répliques techniques pour ces expériences. Des noyaux de tailles alternatives peuvent être utilisés, mais seuls 3 mm ont été testés pour ce protocole.
      REMARQUE : Un excès d’adipeux retenu dû à une dissection insuffisante peut provoquer un flottement du noyau dans le JSAS, ce qui est sous-optimal. Si les carottes flottent vers la surface plutôt que de rester submergées, revenez à la dissection ou choisissez un carottage submergé.
  7. Ouvrez une deuxième boîte de Petri et remplissez de 5 à 10 mL de milieux chauds (37 °C) contenant 10 % de FBS. Avec des pinces plates ou non dentées, transférez les noyaux vers cette boîte pour laver les débris avec 1 à 2 secondes d’agitation mécanique douce. Ne pincez pas les noyaux de façon ferme, sinon cela pourrait endommager la doublure intime.
    REMARQUE : Je peux faire une pause ici de ≤24 h en plaçant des carottes tissulaires dans l’incubateur à un réglage standard de 37 °C et 5 % deCO2.

2. Mise en place du Joint Space Analysis System (JSAS)

  1. Préparez le puits de fond du JSAS avec 600 μL de DMEM à faible glucose chauffé (37 °C) avec 10 % de FBS. Bien que la pénicilline-streptomycine à 1 % ait été testée sans effet négatif notable dans ce système, les antibiotiques ne sont généralement pas ajoutés au milieu si la stérilité a été suffisamment maintenue.
    REMARQUE : Si vous co-cultivez avec des bactéries ou une lignée cellulaire nécessitant un milieu différent, le puits de fond peut être un milieu différent. Évitez les milieux antibiotiques si vous co-cultivez avec des bactéries.
  2. Au fond, ajoutez le traitement de votre choix. Par exemple, le lipopolysaccharide (LPS). Pour éviter les différences d’osmolarité, il est recommandé que le volume du traitement ne dépasse pas 2,5 % du volume total (par exemple, ≤15 μL pour 600 μL). Amortissez les éventuels changements de pH issus des traitements pour maintenir un pH de 7,0 à 7,4. Sinon, utilisez les commandes du véhicule.
  3. Choisissez la taille des pores du transwell en fonction du résultat expérimental souhaité (Figure 3).
  4. Ajoutez 300 μL de DMEM à faible taux de glucose avec 10 % de FBS dans le puits trans.
  5. Transférez doucement les carottes individuelles avec des pinces stériles dans le milieu du transwell. L’orientation du tissu ne peut pas être contrôlée ; Cependant, l’adiposité et la flottabilité naturelle du tissu stromal font naturellement que la muqueuse intimale est orientée vers le bas pour la majorité des carottes tissulaires.
    1. Visualisez soigneusement les carottes car le processus de carottage peut perturber la membrane intime, et évitez d’utiliser des carottes qui semblent effilochées au début de l’expérience. Si le carottage flotte, améliorez la dissection et choisissez un noyau alternatif.
      REMARQUE : Considérez une matrice de collagène si l’orientation tissulaire est importante ; cependant, cela influencera le temps nécessaire pour développer un gradient chimique avec le puits de fond.
  6. Placez en incubateur à 37 °C et 5 % deCO2 pendant la durée souhaitée.
    REMARQUE : Le délai le plus précoce recommandé pour les changements biologiques est de 8 heures. Le dernier délai validé pour l’activité biologique est de 3 jours.

3. Démontage et analyse expérimentaux

  1. Pour l’histologie, utilisez des pinces stériles et non dentées pour transférer le tissu sur 3 à 5 mL de formol tamponné neutre à 10 % (NBF) pour une analyse fixée au formol, enrichie en paraffine (FFPE). Conserver en NBF pendant 3 à 7 jours avant l’intégration et la sectionnement.
    1. Ne laissez pas le tissu reposer longtemps, car cela aggrave l’autofluorescence. Effectuer une analyse histologique, incluant la coloration par hématoxyline et éosine (H&E)11 pour l’histomorphométrie, l’immunofluorescence (IF)12, et/ou l’ARNoscopie avec IF13 selon les méthodes standard.
      REMARQUE : Faites attention à ne pas percer le transwell avec des pinces lors du retrait du tissu. Soyez extrêmement doux en transférant le tronc, sinon la muqueuse intime pourrait se dissocier. Placez doucement le noyau dans un fixateur et ne faites pas d’agitation. Le NBF doit être utilisé à l’intérieur d’une hotte chimique certifiée, doit être éliminé conformément aux directives locales de santé et sécurité environnementale (EHS), et ne peut pas être versé dans les éviers. Les tissus humains non utilisés issus de l’expérience sont placés dans un excès d’eau de Javel à 10 % pendant 30 minutes, puis placés en confinement secondaire selon les exigences locales de l’EHS, avant d’être éliminés dans des bacs biohazard marqués pour incinération. La solution d’eau de Javel peut être versée dans l’évier si elle est approuvée par le service d’urgence local. Suivez les directives locales, qui peuvent varier selon l’établissement.
  2. Intégrer des répliques techniques dans le même bloc FFPE. Utilisez des cassettes grillées pour éviter la perte d’échantillon. Section sur l’axe longitudinal à 5 μm d’épaisseur. Placez trois sections en série sur une diapositive (Figure supplémentaire 1).
  3. Image H&E des diapositives à 10x et 40x à l’aide de la microscopie en champ clair. Identifier l’IntL comme la couche cellulaire organisée à l’interface entre le tissu et l’espace vide.
    1. Acquérir 3 sections représentatives 10x et 10 sections 40x représentatives réparties sur un minimum de 2 répliques techniques par condition de traitement, en maintenant l’IntL dans le champ de vision. Capturez des images sous forme de TIFF haute résolution. Effectuer une analyse histomorphométrique :
    2. Effectuer des mesures dans ImageJ/FIJI. Premièrement, réglez l’échelle en utilisant le menu Analyser → Définir l’échelle. Set Scale nécessite l’utilisation d’une lame d’étalonnage imagée sur chaque microscope à chaque objectif. Tout d’abord, utilisez l’outil ligne droite pour créer une ligne de longueur connue basée sur l’image de la diapositive d’étalonnage. Attribuez l’échelle globalement.
      REMARQUE : À 10x, l’échelle est de 3 px/μm. À 40x, l’échelle est de 12 px/μm.
    3. Mesurez l’épaisseur du SubL à l’aide des images 10x avec l’outil ligne droite. Mesurez l’épaisseur en profondeur à plomb depuis la surface IntL jusqu’au fond du SubL (μm). Après avoir tracé chaque ligne, utilisez le raccourci clavier m pour mesurer la longueur de la ligne.
      1. On obtient en moyenne au moins 5 mesures pour chaque image 10x (Figure 4A,B). La transition entre le tissu SubL et le tissu stromal est délimitée par une transition vers des zones moins organisées et moins cellulaires contenant du collagène et de l’adipeux (Figure 4B). Divisez le point de transition entre les compartiments tissulaires.
    4. Pour des mesures 40x de l’épaisseur IntL, de la cellularité IntL, de l’intégrité IntL et de la cellulité SubL, commencez par ouvrir le TIFF 40x dans Adobe Photoshop (ou tout éditeur d’images similaire). L’IntL est défini comme une couche de ~1 à 5 cellules d’épaisseur, organisée en une couche cellulaire distincte à l’interface entre le tissu et l’espace vide (par exemple, le liquide synovial) (Figure 4C).
    5. Créez une nouvelle couche. Sélectionnez l’outil Lasso polygonal . En utilisant un clic de souris pour initier le lasso ainsi que pour ancrer les flexions dans la ligne, divisez en deux la transition entre l’IntL et le SubL sur toute l’image. Ensuite, continue le lasso juste à l’extérieur de l’IntL dans l’espace vide.
      1. Fermez le lasso d’un double clic. Inversez la zone sélectionnée (sélectionnez →inverse), puis remplissez l’espace de noir à l’aide de l’outil seau à peinture . Cela couvrira toutes les zones qui ne sont pas l’IntL. Enregistrez cette image en JPG haute résolution représentant l’IntL, puis masquez le calque.
    6. Créez une nouvelle couche. Dans les paramètres du lasso polygonal, sélectionnez la fonction d’intersection , qui ne sélectionnera que l’intersection entre la nouvelle zone du lasso et celle des anciennes. Faites le lasso autour de la couche de sous-couche en cliquant à travers le centre de l’IntL, autour des bords gauche et droit de l’image jusqu’à la toile de fond, puis coupez en deux la transition entre le SubL et le tissu acellulaire derrière.
      1. Si le bas du SubL dépasse les dimensions de l’image 40x, il suffit de sélectionner la toile de fond autour du bord restant. Encore une fois, sélectionnez l’inverse de cette zone comme ci-dessus, puis utilisez l’outil seau à peinture pour remplir de noir. Enregistrez cette image en JPG haute résolution représentant le SubL. Enregistrez cette image en couches comme PSD pour référence future.
        REMARQUE : Les érythrocytes sont courants dans ces lames et peuvent interférer avec les mesures futures du nombre cellulaire. S’il y a de grandes zones de vasculature, utilisez l’outil lasso polygonal, l’outil pinceau ou d’autres outils de votre choix pour créer des masques sur une couche séparée couvrant ces zones.
    7. En FIJI, ouvrez l’image du masque  IntL. Mesurez l’épaisseur IntL (μm) en moyenne d’au moins 5 mesures sur l’image 40x à l’aide de l’outil ligne droite comme à l’étape 3.3.2-3.3.3.
    8. Mesurez la longueur totale (μm) de l’IntL à l’aide de l’outil ligne segmentée. Ensuite, mesurez la longueur uniquement des zones intactes, également avec l’outil de lignes segmentées (Figure 4D,E). Les sections IntL qui ne sont pas intactes sont délimitées par des espaces entre les cellules, une apparence rongée par les mites, et la rupture ou la détachement d’IntL des tissus.
      1. Calculez le pourcentage de frontière IntL intacte dans comme (IntL intact/IntL total)*100. Cela doit être comparé aux mêmes contrôles de points temporels pour compenser tout artefact de sectionnement.
    9. Mesurez la cellularité de l’IntL à l’aide de l’image du masque IntL. D’abord, transformer en 8 bits (Type → image → 8 bits). Ensuite, seuil (image → seuil) pour minimiser le bruit et maximiser l’identification des cellules. Dans le menu seuil, désélectionnez fond sombre et utilisez le bouton basculant du bas pour les ajustements.
      1. Déterminer manuellement le seuil par image, aidé par la disparition du bruit (par exemple, un artefact de fond) tout en conservant le nombre initial de corps nucléaires. Comparez fréquemment l’image originale pour maintenir la fidélité. Lorsque le bruit est minimisé (faux positif) mais que le signal de l’hématoxyline est maximisé (véritable positif nucléaire), il est approprié de fixer le seuil (Figure supplémentaire 2).
        REMARQUE : Le seuil sera cohérent sur un seul balayage de diapositives, mais variera entre les scans de diapositives et aussi entre les images individuelles 10x ou 40x. Cela variera aussi entre les lots de H&E, car la profondeur de couleur est peu susceptible d’être constante. Ainsi, les macros simples sont inappropriées s’il existe des différences dans l’une des catégories suivantes entre les images : patient, lot H&E, épaisseur de section, conditions d’éclairage (luminosité de la lumière dans la pièce ou le microscope/température de couleur), logiciels utilisés pour acquérir l’image, microscope utilisé pour l’obtenir, et utilisation d’algorithmes de balance des blancs ou d’équilibrage des couleurs. Cette liste n’est pas exhaustive. En utilisant le microscope AmScope T390B-3M avec une caméra et un logiciel compatibles, avec une lumière maximale dans une pièce faiblement éclairée, en utilisant des réglages automatiques de balance des blancs, 10 images aléatoires 40x couvrant 3 patients, le seuil variait de 96 à 182, avec une moyenne de 137. Cette large plage reflète les différences dans les histogrammes 8 bits sous-jacents, et non l’incohérence de l’utilisateur. Ainsi, assurer la fidélité visuelle entre l’image originale et l’image seuil est essentiel, pas le nombre exact du seuil. L’automatisation de ce processus dépasse le champ d’action d’un spécialiste de laboratoire typique et nécessiterait la programmation d’un professionnel de l’analyse d’images.
    10. Utilisez Analyser les particules (analyser → analyser les particules) dont la taille des cellules est de 8 à 150μm2 pour identifier et compter les noyaux comme substitut du nombre de cellules. Sélectionnez des masques superposés dans les paramètres pour visualiser les cellules identifiées, en les comparant à nouveau à l’image originale. Comme l’IntL est principalement une structure linéaire, et non volumrique, normalisez ces 100 μm de longueur IntL (par exemple, #cells/100 μm). Cela représentait en moyenne environ 13,19 cellules (plage 5,4-21,9, DE 3,9) cellules par 100 μm dans le tissu synovial fraîchement prélevé.
      REMARQUE : La plage de 8 à 150μm 2 a été déterminée à partir de l’échelle de l’ensemble et de la comparaison visuelle itérative de l’image seuil avec l’image originale. Les limites déterminées empiriquement à travers le jeu de données correspondent à des hypothèses de forme basées sur le fait que les macrophages ont un diamètre cellulaire pouvant varier d’environ 8 à 20μm 14,15. Les tailles plus grandes étaient exclues car cela représentait souvent plusieurs noyaux discrets à proximité lise comme une seule cellule.
      REMARQUE : Des flux de travail similaires peuvent être établis, par exemple dans QuPath.
    11. Ouvrir le masque SubL avec érythrocytes exclus (Figure 4G). Effectuer une transformation 8 bits, un seuil et analyser les particules comme mentionné aux étapes 3.3.9-10. Comme le SubL est une couche volumique, normaliser le nombre de cellules comptées à 100μm2 de la zone SubL (par exemple, la mesure des zones non masquées) (Figure 4H).
  4. Pour l’analyse de cytométrie en flux des cellules migratrices dans le puits de fond, centrifugez à 300 x g à 4 °C pendant 10 minutes et gardez la granule cellulaire sur la glace. Attendez-vous à ~20 000 cellules migratrices vivantes par noyau de biopsie de 3 mm à 24 heures. Les méthodes de cytométrie en flux ont été publiées précédemment8.
  5. Pour l’ELISA, centrifugez le milieu à vitesse maximale (>5000 x g) pendant 5 minutes à 4 °C pour pelleter les cellules ou les débris cellulaires. Conserver à la température souhaitée. Les méthodes ELISA ont été publiéesprécédemment 8.

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Résultats

Optimisation des conditions de culture d’oxygène

La perfusion physiologique des tissus est d’environ 6 % à 8 % d’oxygène, tandis que les conditions d’incubation standard pour la culture cellulaire sont aux niveaux d’oxygène atmosphérique (~21 %)16. Comparativement, l’hyperoxygénation peut améliorer la viabilité des cultures cellulaires ou êtretoxique 17. Une utilisation adéquate du JSAS nécessitait une détermination précoce de la...

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Discussion

Ce travail a démontré les capacités du JSAS, en particulier le maintien du tissu synovial vivant avec une architecture synoviale intacte et fonctionnellement réactive. La mort cellulaire était minimale sur 72 heures de culture dans la plupart des conditions d’incubation. Pour évaluer les changements microscopiques de la structure synoviale, un système de mesure histologique unique a été décrit, quantifiant les altérations structurelles de l’IntL et du SubL. De tels changements sont indic...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

Ce protocole ne serait pas possible sans la générosité des patients qui ont fait don de leur tissu, et la compétence de nos collègues en chirurgie orthopédique, qui sont prêts à acquérir des tissus en toute sécurité pour le compte du travail. K.I.C. est soutenu par NIAMS K08 AR084605, et C.P.P. est soutenu par le Veterans Affairs Career Development Program [IK2BX004532]. Ce groupe reconnaît l’utilisation du Centre de Recherche en Microscopie de l’Université de l’Iowa, une ressource centrale soutenue par le vice-président à la recherche de l’Université de l’Iowa, et le Carver College of Medicine. Les données de cytométrie en flux ont été obtenues au Flow Cytometry Facility, qui est un centre de recherche central du Carver College of Medicine / Holden Comprehensive Cancer Center à l’Université de l’Iowa. L’établissement est financé par les frais d’utilisation et le généreux soutien financier du Carver College of Medicine, du Holden Comprehensive Cancer Center et de l’Iowa City Veteran’s Administration Medical Center. Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par : le National Center for Research Resources des National Institutes of Health sous le prix numéro 1 S10 OD034193-01 ; et l’Institut national du cancer des National Institutes of Health sous le numéro de récompense P30CA086862.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (pour la stérilisation)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 doit être utilisé dans la phase exponentielle tardive pour une pathogénicité maximale
BSK-HSigma-AldrichB8291
Anticorps CD68Invitrogen14-0688-821:1000
Cuve CO2 (conditions standard)N/A
Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
sérum bovin foetalBiotechneS11150Chauffé et inactivé Lot: F22100
Forceps (sans dents)N/A
Pince hémostatiqueN/A
Incubateur cellulaire humidifié (conditions standard)N/A
Incubateur hypoxiqueN/A
Cuve hypoxique (5% O2, 5% CO2, reste N2, conditions physiologiques)N/A
Anticorps IL-4ThermofisherMA5-424701:100
Anticorps iNOSThermofisherPA1-0361:100
Ciseaux IrisN/A
LipopolysaccharideSigma-AldrichL2630
DMEM à faible teneur en glucose (+ pyruvate de sodium, + L-glutamine)Life Technologies11885084
Anticorps MMP9ThermofisherMA5-327051:1000
Chambre d'incubateur modulaire (conditions hyperoxiques)Emrbient, IncMIC-101
Protéine chimiotactique des monocytes 1Peptrotech300-04-20UG
N-acétyl cystéineSigma-AldrichA9165Doit être préparée fraîche pour chaque expérience et mise en tampon dans du bicarbonate de sodium equimolaire à un pH de 7 à 7,4
ELISA OPGMilliporeRAB0484Dilution 1:1
Cuve d'oxygène avec régulateur de débit en litres par minuteN/A
Anticorps PDPNInvitrogen14-9381-821:100
Iodure de PropidiumThermofisherJ66764.MC
Essai RNAscope multiplex fluorescent V2ACD/Biotechne323100
ELISA sRANKLMyBioSourceMBS262624Dilution 1:1
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS7563Stock 10 000X
Anticorps TNFThermofisherPA5-198101:100
Inserts transwell - 0,4 µmMillicellPICM01250
Inserts transwell - 5 µmCorningCLS3421

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