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Article de méthode

Gavage buccal chez les souris néonatales et évaluation fonctionnelle de l’intégrité de la barrière intestinale à l’aide de chambres d’utilisation

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DOI :

10.3791/69751

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9 janvier 2026

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1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit : (1) la délivrance par gavage orale de molécules testées à des souris néonatales dès le DOL 6 ; et (2) évaluation ex vivo de la fonction de la barrière épithéliale du colon dans les biopsies allant du DOL 10 au sevrage (DOL 20) des petits en évaluant la perméabilité paracellulaire et transcellulaire avec les chambres d’Ussing.

Résumé

De plus en plus de preuves soulignent l’importance des 1 000 premiers jours de vie dans la formation de l’axe intestin-microbiome. Cette fenêtre précoce est cruciale pour l’établissement de trajectoires physiologiques à long terme et d’adaptations immunologiques, pouvant influencer la susceptibilité aux maladies liées à la dysbiose et au dysfonctionnement de la barrière. Une compréhension plus approfondie des mécanismes sous-jacents nécessite une évaluation complète des paramètres physiologiques clés, y compris la perméabilité paracellulaire et transcellulaire de l’intestin néonatal. L’évaluation de ces paramètres est essentielle pour élucider comment des expositions précoces à des molécules exogènes peuvent influencer l’intégrité intestinale et les résultats sanitaires à long terme. Ainsi, la première partie de cet article décrit l’administration orale de molécules d’intérêt chez les souris dès le jour de leur vie, tout en minimisant le stress, le risque de blessure et le cannibalisme. Des aiguilles d’alimentation lubrifiées à pointe arrondie de 24 g sont utilisées pour faire des gâteaux aux souris pesant au moins 2,5 g. La seconde partie présente l’évaluation ex vivo de la perméabilité paracellulaire et transcellulaire à l’aide de tests en chambre d’Ussing sur des échantillons de côlon chez des petits entre DOL-10 et le sevrage. Des glisseurs sans goupille adaptés pour de petites biopsies sont utilisés en combinaison avec des chambres d’Ussing pour monter des échantillons de côlon néonatal. La sonde paracellulaire FITC-Dextran 4 kDa et le marqueur transcellulaire peroxydase de raifort 44 kDa Type VI sont ajoutés au compartiment apical du système au début de l’analyse. Les échantillons sont prélevés dans le compartiment basolatéral à 0 min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min afin de quantifier le passage de la sonde. Le passage des deux marqueurs est quantifié directement (FITC) et indirectement (HRP) par un lecteur de plaques, calculé à l’aide de courbes standard, et exprimé sous forme de flux.

Introduction

L’intégrité de la barrière intestinale joue un rôle fondamental dans le maintien de la santé globale en coordonnant la réponse immunitaire muqueuse et en régulant la perméabilité sélective de l’épithélium intestinal. Ce système de barrière contrôle le passage des nutriments tout en empêchant la translocation des agents pathogènes, antigènes et toxines dans la circulationsystémique 1. La perturbation chronique de cette interface, associée à une perméabilité intestinale accrue, communément appelée « intestin perméable », est désormais identifiée non seulement comme une conséquence, mais aussi comme un facteur d’états inflammatoires chroniques et d’une série de pathologiesextra-intestinales 2.

Par exemple, il a été démontré que la fonction de la barrière intestinale compromise est un élément clé des troubles auto-immuns et métaboliques tels que la maladie inflammatoire de l’intestin (MII), l’arthrite juvénile idiopathique (AIJ) et le diabète de type 1 (DT1). Cela met en lumière l’état de barrière intestinale comme biomarqueur clé, mais aussi comme cible thérapeutique pour prévenir l’initiation des processus physiopathologiques le plus tôt possible et pour prévenir la progression de l’inflammation aiguë vers un étatchronique 3,4,5,6.

Dans ce contexte, la période néonatale représente une fenêtre de développement unique et très sensible durant laquelle l’établissement et la maturation de l’interface intestin-microbiote influencent profondément la santé intestinale et systémiqueà vie 7. À ce stade précoce, l’épithélium intestinal et le système immunitaire présentent une sensibilité accrue aux facteurs endogènes et exogènes, subissant une croissance et une différenciation rapides tout en s’adaptant simultanément à la colonisation microbienne et aux changements alimentaires. Les perturbations altissant l’intégrité de la barrière intestinale durant cette fenêtre de développement critique peuvent jouer un rôle central dans l’apparition d’un large éventail de troubles aigus et chroniques plus tard dans la vie. Ces affections incluent des maladies à médiation immunitaire telles que les allergies alimentaires, ainsi que des maladies chroniques plus graves, telles que la MII, l’IAC et le DT1 7,8,9. Ces maladies soulignent que les processus physiopathologiques prennent souvent leur origine précoce, car leur apparition primaire se produit généralement entre l’enfance et le début de l’âgeadulte 10,11. Par conséquent, comprendre les mécanismes qui régissent la fonction de la barrière intestinale chez les nouveau-nés est essentiel pour développer des stratégies préventives et thérapeutiques visant à réduire le fardeau de nombreuses maladies chroniques.

Dans ce contexte, il existe un besoin pressant d’outils fiables et physiologiquement pertinents pour étudier l’intégrité de la barrière intestinale, les mécanismes des maladies chroniques et l’inflammation, spécifiquement dans le contexte néonatal. De tels outils doivent permettre la reproduction d’essais expérimentaux déjà prouvés dans le contexte adulte sans sacrifier la précision et l’efficacité. De plus, il devient de plus en plus urgent d’étudier les effets à court et long terme de nombreux candidats moléculaires d’intérêt, qui devraient avoir des effets bénéfiques ou nuisibles sur l’homéostasie intestinale dans le contexte néonatal. Parmi les outils disponibles, l’administration orale de la gage chez les souris nouveau-nés représente une méthode plus que fiable pour délivrer des molécules d’intérêt à un stade défini du développement. Il permet des investigations contrôlées sur les effets de divers composés bioactifs, médicaments ou métabolites microbiens sur la maturation intestinale et la fonction de la barrière.

La première partie de cet article décrit une méthode de garage des petits souris dès le Jour de la Vie (DOL) 6, permettant d’étudier les interventions avant, pendant et après l’expansion massive du nombre d’espèces du microbiote intestinal induite par la diversification alimentaire. Ainsi, cette technique permet des analyses longitudinales des effets du traitement sur la santé intestinale à mesure que les petits grandissent et se développent.

Dans la seconde partie de cet article, et en complément de cette approche, l’évaluation ex vivo de la fonction de la barrière épithéliale du côlon à l’aide de chambres d’Ussing fournit une mesure sensible et quantitative des caractéristiques de perméabilité. L’évaluation de la perméabilité paracellulaire et transcellulaire dans les biopsies du côlon chez des souris néonatales (par exemple, des petits DOL 10) permet de déterminer avec précision l’impact de plusieurs candidats clés sur l’intégrité et la fonction de la barrière épithéliale. Le transport paracellulaire est un mécanisme essentiellement passif qui se produit dans l’espace intercellulaire de la couche épithéliale. Il permet le passage de petits solutés entraînés par des gradients électrochimiques et osmotiques du lumen vers le côté basolatéral. Ce mécanisme est principalement régulé par des protéines de la famille des jonctions serrées, telles que les Claudins et l’occludine. Le transport transcellulaire, en revanche, est un mécanisme actif, permettant l’absorption de solutés plus gros et se produisant à travers les cellules épithéliales via des canaux spécifiques, des transporteurs et des pompes.

L’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran (4 kDa) subit principalement un transport paracellulaire en raison de sa taille, tandis que la peroxydase de raifort (HRP ; 44 kDa) est transmise sélectivement au côté basolatéral via des voies transcellulaires. La quantification de ces marqueurs non endogènes permet ainsi une évaluation distincte de la perméabilité paracellulaire et transcellulaire, respectivement. Le test en chambre d’Ussing avec FITC et HRP préserve l’architecture tissulaire et permet de mesurer en temps réel la perméabilité paracellulaire et transcellulaire de n’importe quel segment du tube intestinal. Cette combinaison de l’analyse du gavage néonatal et de la chambre d’Ussing offre une stratégie puissante pour étudier comment certaines molécules impactent le fonctionnement de la barrière intestinale, à la fois immédiatement et sur des périodes plus longues, en informant des stratégies pour atténuer l’inflammation et prévenir les maladies chroniques dès les premiers stades de la vie.

En résumé, ce protocole décrit deux procédures expérimentales complémentaires permettant : (1) l’administration de molécules d’intérêt durant la période néonatale précoce aux souris (étape 1) ; (2) évaluation de la perméabilité para et transcellulaire dans les segments intestinaux, des nouveau-nés jusqu’aux petits en sevrage, à l’aide des chambres d’Ussing (étapes 2 à 6).

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux réglementations nationales applicables et approuvées par le Ministère français de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et de l’Innovation via la plateforme APAFIS (Numéro d’autorisation : APAFIS#23855) et les subventions de l’Agence Nationale pour la Recherche (ANR) : 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 et 18-IDEX-0001. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Gavage des petits souris nouveau-nés

REMARQUE : La méthode suivante est adaptée de Francis et al.12. Bien que le protocole original autorise le gavage des souris dès le DOL 2, le gavage n’a pas été réalisé avant le DOL 6 ici, car les exigences techniques à des âges plus précoces rendent la procédure nettement plus difficile. De plus, l’utilisation de chiots plus jeunes complique les études car elle augmente le risque de perte d’animaux durant les premiers jours de traitement, nécessitant ainsi des cohortes plus importantes.

  1. Préparation et installation des solutions Gavage
    1. Peser chaque chiot individuellement.
    2. Ajustez la concentration et le volume de la solution de gavage afin que le volume total administré ne dépasse pas 20 μL par gramme de poids corporel.
      REMARQUE : Dans des conditions standard, les souris pesent rarement moins de 2,5 g au DOL 6.
    3. Lavez une aiguille d’alimentation à pointe ronde de 24 g en la rinçant profondément avec de l’eau déionisée, suivie d’un traitement à 70 % d’éthanol à l’aide d’une seringue, puis en autoclave.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser une aiguille d’alimentation séparée pour chaque groupe de traitement afin d’éviter la contamination croisée.
    4. Placez des essuie-tout propres sur une bouillotte désinfectée réglée à ~38 °C.
    5. Lavez les gants avec 70 % d’éthanol avant d’ouvrir les cages pour limiter le transfert d’odeurs aux chiots et réduire le risque de cannibalisation.
    6. Transférez la mère dans une cage séparée dans une autre pièce pour limiter le stress causé par les vocalisations possibles des petits.
    7. Frottez les gants nettoyés avec des matériaux de nidification pour limiter le risque de transmission d’odeurs extérieures aux chiots pendant la garde.
    8. Mesurez la longueur entre le processus xiphoïde (extrémité inférieure du sternum) et le museau d’un chiot pour marquer la longueur maximale d’insertion sur l’aiguille d’alimentation (Figure 1A,B).
  2. Gavage intra-œsophagien des petits souris
    1. Fixez la tête de l’aiguille à une seringue de manière stérile et puisez plus que le volume souhaité de solution de gauche pour administrer l’intégralité du volume requis sans risque d’administration de bulles d’air, car elles augmentent considérablement le risque d’aspiration.
    2. Avec le pouce et l’index de la main non dominante, pincez doucement la peau entre les omoplates pour soulever le chiot.
      REMARQUE : Ne tirez pas trop de peau du dos du chiot, car cela pourrait provoquer une suffocation.
    3. Maintenez le chiot en position quasi horizontale et insérez doucement l’aiguille d’alimentation dans la cavité buccale, en la faisant avancer perpendiculairement au pharynx jusqu’à atteindre le fond de la gorge (Figure 1C).
    4. Tout en gardant le même angle et la même profondeur, faites glisser l’aiguille vers la partie droite ou gauche de la cavité buccale pour éviter la langue.
    5. Ajustez lentement l’angle de l’aiguille tout en inclinant doucement la tête du chiot vers l’arrière, jusqu’à ce que la seringue, la tête et le dos soient alignés, la tête légèrement inclinée vers l’arrière (Figure 1D).
    6. Sans exercer de pression, laissez la seringue descendre lentement sous son propre poids jusqu’à ce que la marque d’insertion maximale soit proche ou atteigne le niveau du museau (Figure 1E).
      REMARQUE : Si une résistance est rencontrée, faites pivoter doucement la seringue en la faisant rouler d’avant en arrière entre les doigts pour faciliter la descente. Si la seringue ne progresse toujours pas, essayez d’ajuster l’angle d’insertion ou reprenez la procédure à l’aide d’une aiguille d’alimentation lubrifiée à la solution de gaguage. L’aiguille ne doit pas rester insérée plus de 20 secondes pour éviter l’asphyxie.
    7. Une fois la marque d’insertion maximale atteinte ou proche, il faut rapidement distribuer le volume désiré. Si une résistance est rencontrée lors de la distribution du volume, vérifiez l’alignement seringue-tête-arrière et ajustez légèrement la profondeur d’insertion.
      REMARQUE : Il est recommandé de délivrer rapidement le volume, car une insertion prolongée de l’aiguille augmente considérablement le risque d’asphyxie, de lutte et de blessures potentielles à l’animal.
    8. Une fois le volume correct administré, retirez doucement l’aiguille selon le même angle que celui utilisé pour l’insertion.
    9. Placez le chiot sur le papier essuie-tout précédemment posé sur le coussin chauffant et suivez la récupération. Un rythme respiratoire normal devrait revenir en moins de 20 secondes.
      REMARQUE : L’apparition de bulles par le museau ou la bouche de l’animal indique une aspiration et nécessite une euthanasie immédiate chez les chiots plus jeunes que le DOL 14. La présence d’une très faible quantité de sang dans la bouche de l’animal, causée par une lésion entre l’oropharynx et l’œsophage, nécessite une surveillance de l’animal, mais pas une euthanasie systématique. Si la récupération du chiot est incertaine, placez-le sur le côté. S’il ne tente pas de se redresser, euthanasiez immédiatement.
    10. Une fois la récupération confirmée, remettez le chiot dans le nid et regroupez-le avec sa mère.
      REMARQUE : Jusqu’au DOL 10, les chiots ont une mobilité faible et peuvent rester sur le tapis chauffant jusqu’à ce que chaque chiot dans la cage soit terminé. Les chiots plus âgés ne doivent pas être laissés sans surveillance sur le tapis, car ils pourraient tenter de s’échapper.

Figure 1
Figure 1 : Gavage du chiot nouveau-né au DOL 10. La distance entre le museau et le processus xyphoïde est mesurée (A), permettant de marquer la longueur maximale d’insertion sur l’aiguille d’alimentation (B). L’aiguille d’alimentation est insérée dans la partie gauche ou droite de la cavité buccale (C). Une fois le fond de la gorge atteint, l’angle de l’aiguille est ajusté jusqu’à ce que la seringue, la tête et le dos de l’animal soient alignés (D). L’aiguille est laissée glisser doucement vers le bas sans résistance jusqu’à ce que la marque d’insertion maximale soit presque atteinte ou atteinte (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Euthanasie et ponction du côlon chez un chiot nouveau-né

  1. Effectuer l’euthanasie selon la méthode appropriée imposée par la législation nationale.
    REMARQUE : La décapitation des chiots jusqu’au DOL 10 et la luxation cervicale des chiots d’âge supérieur au DOL 10 sont recommandées. L’euthanasie avecCO-2 ou anesthésiants n’est pas recommandée, car les chiots présentent une grande tolérance à ces méthodes.
  2. Placez l’animal euthanasié sous un microscope binoculaire.
  3. Appliquez 70 % d’éthanol sur l’abdomen de l’animal.
  4. À l’aide de pinces, pincez la peau abdominale et le péritoine sous-jacent et réalisez une grande incision transversale abdominale à l’aide de ciseaux fins (perpendiculaire à l’axe rostral-caudal) sans couper l’intestin.
  5. Insérez doucement les ciseaux fins dans l’incision et étendez la coupure latéralement à travers le péritoine des deux côtés.
  6. À l’aide de pinces et de ciseaux fins, ouvrez les parties supérieure et inférieure du péritoine, de la région thoracique jusqu’à la zone basse basse (Figure 2A).
  7. Identifiez la partie distale du côlon et faites une incision parallèle à son axe, vers le rectum.
  8. Faites une incision dans la partie terminale/rectale du côlon pour le mobiliser.
  9. Tirez doucement le côlon et progressez vers le cecum, en retirant d’éventuels morceaux de tissu conjonctif ou adipeux.
  10. Libérez le côlon de l’abdomen en coupant à la jonction iléococcicale, au-dessus du cæcum (Figure 2B).
  11. Écartez le cécum et les premiers millimètres du côlon proximal, puis prélevez un à deux échantillons du côlon proximal qui sont plus grands que la taille de l’ouverture du curseur d’Ussing (Figure 2C).
    REMARQUE : Il est conseillé de réaliser deux biopsies surdimensionnées, car le côlon néonatal est extrêmement fragile et peut facilement être déchiré, lacéré ou percé lors du nettoyage et du montage.
  12. Avec les ciseaux fermés, retirez doucement la teneur fécale de la biopsie aplatie en appliquant une légère pression et en glissant de l’extrémité proximale à l’extrémité distale.
  13. Placez la pièce de colon vidée dans un tampon KRB glacé.

Figure 2
Figure 2 : Dissection du côlon du chiot DOL 10. L’épiderme et le péritoine du chiot sont coupés et ouverts en deux étapes pour éviter une incision involontaire du côlon, jusqu’à ce que la totalité de la cavité abdominale soit exposée (A). Le côlon est libéré de l’abdomen par une première coupe de la section distale/rectale, suivie d’une seconde coupure au-dessus du cécum (B). Les premiers millimètres du côlon proximal sont écartés, et un à deux échantillons de côlon supérieurs à la taille de l’ouverture des glisseurs d’Ussing sont collectés (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Essai de perméabilité du côlon à l’aide de biopsies de souris dans des chambres d’Ussing

  1. Préparation du test
    1. La veille de l’expérience Ussing. Pour garantir des conditions optimales pour l’analyse, il est recommandé de préparer plusieurs solutions la veille de l’expérience. Ces solutions sont préparées comme indiqué dans le tableau 1.
      REMARQUE : les tableaux suivants indiquent les montants requis pour 12 chambres Ussing, avec un excédent important de KRB 10 fois pour permettre l’aliquotation.
      REMARQUE : La solution KRB 10x peut être stockée à 4 °C pendant 6 à 12 mois.
    2. Le jour de l’expérience, 30 minutes avant l’euthanasie des animaux :
      1. Préparez 400 mL de tampon KRB, comme indiqué dans le tableau 2.
        REMARQUE : Le KRB 10x, l’eau déionisée et le bicarbonate doivent être prémélangés et bouillonnés à l’aide de gaz carbogène (95 %O2 ; 5 % CO2) pendant 15 minutes avant d’ajouter du CaCl2 pour éviter les précipitations.
      2. En utilisant un système de carbogènes (95 %O 2 ; 5 % CO2), faites mousser le tampon KRB frais pendant 15 minutes.
      3. Divisez les 400 mL de tampon KRB en deux et préparez 200 mL de Krebs-Glucose, 200 mL de Krebs-Mannitol, et la solution HRP comme décrit dans le Tableau 3.
    3. Installation du système Ussing
      1. Préchauffez le système d’utilisation à 37 °C.
      2. Préassemblez les chambres comme suit :
        1. Soulevez les loquets de chaque fente.
        2. Placez les chambres dans leurs fentes sans resserrer le système.
        3. Insérez les deux tubes d’alimentation en gaz dans chaque partie des chambres.
        4. Introduisez les quatre électrodes dans les ouvertures avant (si disponibles - non couvert ici) ou scellez les quatre ouvertures à l’aide de cônes de 200 μL remplis de colle avant l’expérience.
        5. Placez des plateaux sous les chambres en prévision de fuites potentielles.
      3. Montage de tissu
        1. Séchez légèrement l’échantillon de côlon déjà nettoyé avec un essuie-tout pour éliminer l’excès d’humidité.
        2. Placez le morceau de côlon sous une loupe et insérez très délicatement une des lames de ciseaux fins dans la partie luminale pour l’ouvrir (Figure 3A).
          REMARQUE : La coupe peut se faire en un seul mouvement une fois les ciseaux complètement insérés. La section du côlon utilisée doit être aussi droite que possible tout en évitant la torsion.
        3. À l’aide de pinces fines, montez le tissu sur la partie blanche du curseur tout en gardant la partie luminale vers le haut, vers l’opérateur. Le tissu doit être dépourvu de traces de graisse, de selles, de rides, de perforations et de lacérations, et doit recouvrir largement l’ouverture (Figure 3B).
        4. Fermez le curseur sous le microscope binoculaire et vérifiez un éventuel déplacement du tissu. Une légère déformation du tissu doit être visible lorsqu’une pression est appliquée sur le couleur, ce qui indique que celui-ci est bien fermé.
          REMARQUE : Installez les curseurs dans la chambre d’Ussing (Figure 4) et commencez l’étape d’équilibrage individuellement dès qu’elle est prête, pour éviter la déshydratation de l’échantillon.
        5. Tout en maintenant une légère pression sur le curseur pour le maintenir fermé, insérez le curseur dans la chambre d’Ussing, en veillant à ce que le lumen (la partie transparente du curseur) soit orienté vers la gauche.
        6. Fermez les deux loquets et serrez la vis située à droite jusqu’à ce que la chambre soit hermétique et que le coulisseur ne puisse plus bouger.
      4. Réglage final et équilibrage
        1. Ajoutez 4 mL de Krebs-Mannitol dans le compartiment gauche (apical) de la chambre.
        2. Ajoutez 4 mL de Krebs-glucose dans le compartiment droit (basolatéral) de la chambre.
        3. Placez un petit morceau de parafilm entre les deux compartiments pour éviter toute contamination croisée.
        4. Ouvrez l’entrée de gaz (95 %O 2 / 5 % CO2) et réglez la sortie entre 1 et 2 bulles/s.
        5. Éliminez toute grosse bulle située sur le tissu ou dans le système à l’aide d’une pipette Pasteur.
        6. Laissez le système équilibrer jusqu’à 20-30 minutes.
        7. Préparez la solution FITC 4kDa + HRP + Mannitol comme décrit dans le Tableau 4.
  2. Début du test de perméabilité du côlon
    1. Une fois l’équilibre du système atteint, remplacer 200 μL de Krebs-Mannitol du compartiment apical (à gauche) par 200 μL de solution FITC 4Kd + HRP + Mannitol et démarrer immédiatement un minuteur. Lavez la pointe en faisant des montées et descentes douces dans le compartiment et jetez la pointe entre chaque chambre.
    2. Pour chaque chambre, collectez 2 x 100 μL (duplicatas) du compartiment basal (droit) et déposez les volumes dans une plaque noire à 96 puits. Couvrez la plaque de feuille d’aluminium pour éviter la photodégradation du FITC présent dans la plaque.
    3. Remplacez immédiatement les 200 μL précédemment collectés par 200 μL de Krebs-Glucose frais.
    4. Répétez les étapes (2) et (3) toutes les 30 minutes jusqu’à atteindre le point de temps de 2 heures, pour obtenir les points de temps : T0, T30, T60, T90 et T120.
    5. Scellez la plaque avec du papier aluminium pour éviter la photodégradation du FITC et procédez à la quantification du FITC.
MgCl2 1M
MW (g/mol)Volume final = 20 mLConcentration finale
milli-Q H2OPasser au dernier volume
MgCl2, 6H2O203.34,066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)Volume final = 1LConcentration finale
milli-Q H20Passer au dernier volume
NaCl58.4470 g1,198 M
KCl74.553,4 g45,6 mM
Na2HPO 4,2H 2O177.991 g5,62 mM
NaH 2PO4,2H 2O156.012,3 g14,7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
Bicarbonate 750 mM
MW (g/mol)Volume final = 250 mLConcentration finale
milli-Q H2OPasser au dernier volume
NaHCO38415,75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)Volume final = 50 mLConcentration finale
milli-Q H2OPasser au dernier volume
CaCl211111,098 g2 M

Tableau 1 : Préparation de la solution la veille de l’expérience Ussing.

Tampon KRB (400 mL)
VolumeConcentration finale
KRB 10X40 mL1X
H2O (milli-Q)352 mL
Bicarbonate 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1,2 mM

Tableau 2 : Préparation du tampon KRB le jour de l’expérience Ussing.

Krebs-glucose/mannitol (200 mL chacun)
Volume final = 200 mLConcentration finale
Tampon KRBPasser au dernier volume
Glucose360 mg10 mM
ou
Mannitol364 mg10 mM
Solution HRP
Volume final = 1480 μLConcentration finale
Krebs-MannitolPasser au dernier volume
HRP13 mg8,8 mg/mL

Tableau 3 : Préparation des solutions de glucose de Krebs/mannitol et HRP le jour de l’expérience d’Ussing.

Solution FITC 4kDa + HRP + Mannitol
Pour 12 chambresVolumeConcentration finale
HRP (8,8mg/ml)1345 μL
Krebs-Mannitol1155 μL
FITC 4Kd166,6 mg16,66 mM

Tableau 4 : Préparation de la solution FITC 4 kDa + HRP + mannitol le jour de l’expérience Ussing.

Figure 3
Figure 3 : Montage d’un échantillon de côlon provenant d’un pup DOL 9. Une lame d’une fine paire de ciseaux est insérée dans le segment luminal de l’échantillon pour le couper en un seul mouvement (A). L’échantillon ouvert est monté sur l’ouverture cursante d’Ussing avec le côté luminal orienté vers l’opérateur (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4
Figure 4 : Photo de chambres Ussing entièrement préparées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Évaluation de la perméabilité paracellulaire du côlon via la quantification FITC

  1. Préparation des normes FITC
    1. Diluez la solution FITC 4Kd + HRP + Mannitol dans Krebs-Glucose pour préparer les dilutions standard décrites dans le Tableau 5 et la Figure 5.
    2. Déposez 2 x 100 μL (en double) de chaque dilution standard de n°1 à n°7 dans la plaque. Scellez la plaque avec du papier aluminium pour la protéger de la lumière jusqu’au début de la lecture de la plaque.
  2. Acquisition de données : À l’aide d’un lecteur de plaques, réglez la longueur d’onde d’excitation à 485 nm et l’émission à 535 nm, puis lisez la plaque dès que possible.
    REMARQUE : Il est conseillé de lire la plaque à la fois au gain optimal et avec un gain réglé manuellement pour faciliter la comparaison des valeurs entre plaques et permettre l’interpolation des données en cas d’erreur lors des dilutions standards.
  3. Stockage des plaques : Une fois les données de quantification FITC stockées, les plaques sont scellées avec du papier aluminium à 4 °C toute la nuit si la quantification HRP doit être effectuée dans les jours suivants, ou congelées à -80 °C pour un stockage plus long.

Figure 5
Figure 5 : Représentation visuelle de la préparation des dilutions standard FITC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dilutions standard FTIC
N°1234567
Dilution1:10000 de solution d’origine FITC1:2 de dilution n°11:2 de dilution n°21:10 de dilution n°11:2 de la dilution n°41:2 de la dilution n°5
Krebs-Glucose
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Tableau 5 : Préparation des dilutions standard FITC le jour de l’expérience Ussing.

5. Évaluation de la perméabilité transcellulaire du côlon par quantification de la HRP

  1. La veille du test de quantification HRP :
    1. Assurer des conditions optimales le jour de l’analyse ; la préparation de plusieurs solutions est requise la veille de l’expérience. Ces solutions sont préparées comme décrit dans le tableau 6.
      REMARQUE : Les tableaux suivants indiquent les quantités requises pour une plaque à 96 puits. Les normes HRP peuvent être alicotées et stockées à -20 °C ou -80 °C pendant plusieurs mois. En raison de l’instabilité, utilisez uniquement des tampons neufs carbonate/bicarbonate.
    2. Après la préparation de la solution d’anticorps anti-HRP, recouvrir immédiatement une microplaque Clear Flat Bottom High Binding à 96 puits avec 100 μL par puits. Enveloppez-le dans du papier aluminium et faites couver toute la nuit à 4 °C.
  2. Le jour de l’analyse de quantification HRP :
    1. Préparez le tampon de blocage BSA à 5 % comme décrit dans le tableau 7.
    2. Jetez le contenu de la plaque et lavez avec 280 μL de PBS Tween 4 fois, avec 1 minute de secouage à 350 tr/min entre chaque lavage.
    3. Ajoutez 200 μL de tampon de blocage BSA à chaque puits.
    4. Scellez la plaque avec du papier aluminium et incubez sur un shaker à 500 tr/min pendant au moins 1 heure. En attendant, décongelez et diluez les échantillons (1:10 ou 1:50) et préparez les dilutions standards décrites dans le tableau 8.
    5. Jetez le contenu de la plaque et lavez avec 280 μL de PBS Tween 4 fois, avec 1 minute de secouage à 350 tr/min entre chaque lavage.
    6. Ajoutez 50 μL d’échantillons standards ou dilués, scellez la plaque, puis incubez à 300 tr/min pendant 1 heure en RT.
    7. Pendant l’incubation, amener les réactifs QuantaBlu à RT et préparer la solution de travail comme décrit dans le tableau 9.
    8. Jetez le contenu de la plaque et lavez avec 280 μL de PBS Tween 4 fois, avec 1 minute de secouage à 350 tr/min entre chaque lavage.
    9. Ajoutez 100 μL de solution de travail QuantaBlu à chaque puits à RT ou 37 °C (1,5-90 min, 30 min en moyenne).
      REMARQUE : La progression du test peut être suivie par l’apparition d’une forte fluorescence bleue sous une source de lumière UV.
    10. Ajoutez 100 μL de solution QuantaBlu Stop à chaque puits pour stopper l’activité de la peroxydase. Scellez la plaque et étouffez pendant 10 minutes en réflexion sous agitation à 350 tr/min.
    11. À l’aide d’un lecteur de plaques, réglez la longueur d’onde d’excitation à 315 nm et l’émission à 470 nm. Lisez la plaque dès que possible.
      REMARQUE : Il est conseillé de lire la plaque à la fois au gain optimal et avec un gain réglé manuellement pour faciliter la comparaison des valeurs entre plaques et permettre l’interpolation des données en cas d’erreur lors des dilutions standards. Alternativement au kit de substrats fluorogéniques peroxydase QuantaBlu, d’autres substrats de peroxydase tels que la tétraméthylbenzidine peuvent être utilisés (mesurés à 450 ou 650 nm avec ou sans solution d’arrêt, respectivement), mais cette alternative se fait au détriment d’une sensibilité plus faible.
Solution BSA
MW (g/mol)Volume final = 12,7 mLConcentration finale
Milli-Q H2OPasser au dernier volume
BSA664301,27 g100 mg/mL
Krebs-Glucose + BSA
MW (g/mol)Volume final = 30 mLConcentration finale
Krebs-GlucosePasser au dernier volume
Solution BSA60 μL0,2 mg/mL
PBS Tween
MW (g/mol)Volume final = 500 mLConcentration finale
PBS 1XPasser au dernier volume
Préadolescent-20500 μL0.1%
Carbonate de sodium sol.
MW (g/mol)Volume final = 3,22 mLConcentration finale
Milli-Q H2OPasser au dernier volume
Na2CO3105.9934,13 mg0,1 M
Bicarbonate de sodium sol.
MW (g/mol)Volume final = 12,7 mLConcentration finale
Milli-Q H2OPasser au dernier volume
NaHCO384106,68 mg0,1 M
Buffer de revêtement pH 9,6
Volume final ≈ 11 mL
Carbonate de sodium sol.2,58 mL
Bicarbonate de sodium sol.Ajouter jusqu’à pH = 9,6 (~8,4 mL)
Norme HRP 10 μM
Concentration initialeVolume final = 5 mLConcentration finale
Krebs-GlucosePasser au dernier volume
Solution HRP8,8 mg/mL50 μL0,088 mg/mL
Solution BSA100 mg/mL10 μL0,2 mg/mL
Norme HRP 1,5 nM
Concentration initialeVolume final = 15 mLConcentration finale
Krebs-GlucosePasser au dernier volume
Norme HRP 2,0 μM0,088 mg/mL2,25 μL13,2 ng/mL
Solution BSA0,2 mg/mL3 μL40 ng/mL
Solution anti-anticorps HRP
Concentration initialeVolume final = 10 mLConcentration finale
Tampon de revêtementPasser au dernier volume
Anticorps anti-HRP5,6 mg/mL8,93 μL5 μg/mL

Tableau 6 : Préparation de la solution la veille de l’expérience HRP.

Tampon de blocage BSA
Concentration initialeVolume final = 25 mLConcentration finale
PBS 1X12,5 mL
Solution BSA100 mg/mL12,5 mL50 mg/mL

Tableau 7 : BSA bloquant la préparation du tampon le jour de l’expérience HRP.

StandardKrebs-Glucose + BSANorme HRP 1,5 nMFmol HRP/50 μL
Blank1000 μL0 μL0
1993,75 μL6,25 μL0.09375
2987,5 μL12,5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

Tableau 8 : Préparation standard de la HRP le jour de l’expérience HRP.

Solution de fonctionnement QuantaBlu
Volume final = 12 mL
Solution substrat QuantaBlu10,8 mL
QuantaBlu Solution stable de peroxyde1,2 mL

Tableau 9 : Préparation de la solution de travail QuantaBlu le jour de l’expérience HRP.

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Résultats

Quantification standard de la courbe et de la concentration de puits
La valeur moyenne des blancs était soustraite de chaque puits de la plaque. Avec des valeurs d’absorbance sur l’axe Y et des concentrations sur l’axe X, une courbe standard a été créée à l’aide de la fonction « Interpolate a standard curve » de GraphPad Prism. Si tous les points standards sont alignés, le modèle « Ligne » donne les meilleurs résultats. Alternativement, le modèle « Sigmoïdal, 4 PL, X est la concentration » offre une g...

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Discussion

Le gavage oral permet l’administration répétée d’une dose luminale précise et définie à chaque souris néonatale. En revanche, l’alimentation volontaire, bien que soit une alternative viable, nécessite un délai d’administration prolongé par animal pour délivrer une quantité de composé plus faible avec une précision dedosage réduite 12. De plus, le gavage oral permet d’obtenir des volumes plus importants que ceux réalisables par voie injectable, facilitant ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été réalisé avec le soutien financier du Laboratoire d’excellence ANR-11-IDEX-0005-02 INFLAMEX, une bourse de la Fondation de l’avenir (2025, AP-RM-24-012), et des subventions ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). L’étude a été menée dans le cadre du consortium INFIBREX et a bénéficié du soutien du plan d’investissement « France 2030 », lancé par le gouvernement français et mis en œuvre par l’Université Paris Cité dans le cadre de son programme « Initiative d’Excellence » IdEx (ANR-18-IDEX-0001). Nous remercions chaleureusement la plateforme technique de la chambre Ussing au Centre de recherche sur l’inflammation pour leur soutien inestimable, et adressons un remerciement particulier à Alexandra Willemtz et Maude Le Gall pour leur assistance experte. Nous souhaitons également exprimer notre sincère gratitude à la plateforme Animal Facility du Centre de Recherche sur l’Inflammation pour leur soutien essentiel, avec un remerciement particulier à Isabelle Renault et Guillaume Anselmet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10 DPBS sans Ca & Ca MgDulbeccos14200091
Anticorps anti-HRPNordic BiositeGTX10183Peroxydase de raifort monoclonale de souris [2H11]
Loupe binoculaireOlympus  ;SZ61Aucune spécification requise.
Plaque noire à 96 puits à fond platThermoFisher Scientific137101Les plaques doivent être noires et adaptées aux relevés de fluoresence. Il faut enlever le couvercle pendant la lecture.
BSAMerckA4503
Souris C57BL/6JRivière Charles632C57BL/6J  ;
CaCl2Merck2382
Reliure haute à fond plat transparent à 96 puitsCorning9018
D-(+)-glucoseMerckG8270  ;
H< 2/sous>O distillé
D-MannitolMerckM4125
Pinces finesFST11445-12
Ciseaux finsFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4TdB LabsSensible à la photodégradation.
BouillotteMinerve20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670  ;
Milli-Q H2O
P2300 EasyMount Ussing System & ChambresInstruments physiologiquesEM6-C-CELes systèmes, chambres et coulisses doivent tous être compatibles.
P2306 Ussing Chamber SliderInstruments physiologiquesPI-P2306Différents modèles de coulisses existent pour différentes tailles et formes de mouchoirs.
Kit de substrat peroxydase fluorogénique QuantaBluThermoFisher Scientific15169
Aiguilles d’alimentation réutilisables Pointe rondeFST18061-24Calibre 24, diamètre de pointe de 1,25 mm, pointe ronde. Il faut le laver à l’eau stérile, à l’éthanol à 70 % et être autoclavé avant utilisation.
Bicarbonate de sodiumMerckS6297
Carbonate de sodiumMerckS7795
SpectrophotomètreTECAN  ;Spark 10MUn lecteur de plaques avec acquisition supérieure est nécessaire si les 137101 plaques noires sont utilisées.
Préadolescent-20MerckP7949

Références

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