Une méthode simplifiée pour la transformation médiée par l’agrobactérie de Phytophthora palmivora

Résumé

Nous présentons un protocole simple, efficace et reproductible pour la transformation médiée par Agrobacterium de Phytophthora palmivora, qui est également applicable à P. capsici.

Résumé

Phytophthora est un genre d’oomycètes qui contient de nombreux agents pathogènes destructeurs des plantes, parmi lesquels figure l’espèce à large gamme d’hôtes P. palmivora. La génomique fonctionnelle de Phytophthora a été limitée par la disponibilité limitée de méthodes de transformation robustes et faciles à mettre en œuvre. Parmi les approches disponibles, la transformation médiée par Agrobacterium (AMT) est particulièrement attrayante car elle nécessite un équipement spécialisé minimal et produit souvent des transformants stables avec insertion de gènes à une seule copie. La plupart des protocoles AMT pour la transformation fongique et oomycète utilisent des sels à faible niveau de milieu (MM) dans les milieux d’induction et de co-culture Agrobacterium . La préparation de ces milieux implique généralement la fabrication et le mélange de plusieurs solutions de fond, certaines contenant de nombreux composants à différentes concentrations. Le processus est long et sujet aux erreurs, ce qui conduit à un succès de transformation incohérent. Ici, nous présentons un protocole AMT simplifié, simple et reproductible pour P. palmivora qui utilise des milieux basaux Murashige et Skoog (MS) disponibles dans le commerce pour préparer les milieux d’induction et de co-culture d’Agrobacterium . Ce protocole a également été appliqué avec succès pour transformer P. capsici et peut être appliqué à d’autres espèces de Phytophthora .

Introduction

Phytophthora, un genre d’oomycètes, comprend nombre des agents pathogènes végétaux les plus destructeurs au monde, responsables de pertes économiques^{importantes 1,2}. Parmi eux, Phytophthora palmivora est un agent pathogène à large gamme d’hôtes qui infecte de nombreuses cultures économiquement importantes, notamment le cacao et^{la papaye 3}. C’est l’agent causal le plus répandu de la pourriture des gousses noires dans le cacao, un arbre vivace tropical qui produit le principal composant de l’industrie du chocolat, qui représente plusieurs milliards^{de dollars.} Comprendre les mécanismes de pathogénicité moléculaire de ce pathogène destructeur est essentiel pour concevoir de nouvelles stratégies efficaces de contrôle des maladies, et la transformation génétique est un outil essentiel pour permettre de telles investigations.

Plusieurs méthodes ont été développées pour transformer les espèces de Phytophthora, notamment le bombardement par^{microprojectiles 7}, la transformation de protoplastes médiée par le polyéthylène glycol et le dichlorure de calcium (PEG/_{CaCl 2}⁾ 8,9,10,11, l’électroporation de ^zoospore 12,13,14, et la transformation médiée par Agrobacterium (AMT⁾¹⁵.¹⁶. Parmi ces approches, l’AMT présente des avantages clés car elle génère généralement une intégration génique^{monocopique 15,16} et elle est relativement facile à réaliser sans nécessiter d’équipement spécialisé.

Un protocole pour une transformation efficace de P. palmivora à l’aide de l’AMT a déjà été développé¹⁶. Avec cette méthode, nous avons transformé avec succès P. palmivora avec plusieurs constructions^17,18. Cette méthode utilise un milieu d’induction et de co-culture à base de sel à base de médium minimal (MM), couramment utilisé pour la transformation fongique et d’oomycètes 15,16,19. Bien que le protocole de transformation basé sur MM ait démontré son efficacité pour générer des transformants, préparer plusieurs solutions stock et les combiner pour créer des médias peut être une tâche à la fois chronophage et sujette aux erreurs.

Ici, nous présentons une méthode beaucoup simplifiée pour l’AMT de P. palmivora en utilisant un milieu basal commercial Murashige et Skoog (MS) pour remplacer les composants du milieu à base de sel MM dans les milieux d’induction et de co-culture^{Agrobacterium 16}. Cette méthode élimine la nécessité de préparer plusieurs solutions chimiques stock, rendant le processus moins long et hautement reproductible. De plus, cette approche semble offrir une efficacité de transformation supérieure à celle de la^{méthode 16} décrite précédemment, et s’applique également à P. capsici.

Protocole

1. Préparation des solutions de stock, des milieux et autres matériaux nécessaires à la transformation

1. Solutions antibiotiques pour la base
   1. Préparer des solutions d’origine de kanamycine (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) et céfotaxime (100 mg/mL) : dissoudre les quantités appropriées d’antibiotiques dans l’eau, filtrer les solutions, préparer des aliquotes de 1 mL, et les conserver à -20 °C.
   2. Préparez une solution bouillon de rifampicine (15 mg/mL) : dissoudez la quantité appropriée de rifampicine dans le DMSO, préparez des aliquotes de 1 mL, enveloppez-les dans du papier aluminium, puis conservez-les à -20 °C.
      REMARQUE : Veillez à filtrer les solutions chimiques préparées en DMSO à l’aide de filtres à seringue fabriqués en matériaux compatibles DMSO, tels que le nylon ou le PTFE (Téflon).
2. Milieu pour la croissance d’Agrobacterium
   1. Milieu liquide Luria-Bertani (LB) : Pour préparer 250 mL de milieu, ajoutez 6,25 g de poudre LB à 250 mL d’eau, faites l’autoclave de la solution, puis conservez-la à température ambiante (RT).
   2. Milieu d’agar LB : Pour préparer 250 mL de milieu, ajoutez 6,25 g de poudre LB et 3,75 g d’agar à 250 mL d’eau, autoclave la solution, puis stockez en RT. Ajoutez les antibiotiques appropriés à l’agar LB fondu avant de fabriquer les plaques. Conservez les assiettes complétées d’antibiotiques à 4 °C.
3. Médias pour la croissance et la transformation de P. palmivora
   1. Agar V8 à 10 % : Pour préparer 500 mL, ajoutez 50 mL de jus végétal original V8 à 100 % à 450 mL d’eau. Ensuite, ajoutez 0,5 g de CaCO₃ à la suspension et remuez pour bien mélanger. Autoclave la solution et verse-la dans des assiettes.
      REMARQUE : Ajoutez les antibiotiques appropriés si nécessaire. Conservez les assiettes complétées d’antibiotiques à 4 °C.
   2. Milieu liquide Murashige et Skoog (1/2 MS) à demi-force : Ajoutez 2,15 g de milieu basal Murashige et Skoog (MS) à 950 mL d’eau, ajustez le pH à 5,6 avec 1 N KOH, et ajoutez de l’eau jusqu’à 1 L. Utilisez directement pour fabriquer 1/2 MS agar (étape 1.3.3), autoclavez le reste de 1/2 MS liquide, puis stockez-le à RT.
   3. Agar 1/2MS pour l’agar de co-culture Agrobactérie-Zoospore (AZCA) : Pour préparer 600 mL d’AZCA, mélangez 567 mL de 1/2 MS liquide de l’étape 1.3.2 avec 9 g d’agar. Autoclave la solution et stockez-la sur RT.
   4. 50 % de glycérol : mélangez 50 mL de glycérol avec 50 mL d’eau, faites l’autoclave de la solution, puis stockez-la en RT.
   5. 1M MES (pH 5,6) : Pour préparer 200 mL, ajoutez 39,048 g de MES Hydrate à 160 mL d’eau, puis ajustez le pH à 5,6 avec une solution de NaOH. Ensuite, ajoutez de l’eau jusqu’à 200 mL, filtrez la solution, puis conservez-la en température réduite dans des conditions sombres.
      REMARQUE : Le MES se dissoudra progressivement à mesure que le pH augmente. Au début, utilisez du NaOH à 10 N pour rapprocher le pH de 5,6, ce qui dissoudra presque la poudre. Ensuite, ajoutez 1 N NaOH pour amener le pH exactement à 5,6.
   6. 20 % de glucose : dissoudre 10 g de glucose dans 40 mL d’eau, puis ajouter de l’eau jusqu’à 50 mL, filtrer la solution et la stocker en RT.
   7. 200 mM d’acétosyringone (AS) : Dissoudre 40 mg d’hydroxy-3',5'-diméthoxyacétophénone dans 1 mL de DMSO (voir NOTE sous 1.1.2) et recouvrir la solution de papier aluminium. Faites-le frais le jour de la transformation.
   8. Milieux d’induction agrobactérien (AIM) : Pour préparer 40 mL de mieux, ajoutez 400 μL de glycérol à 50 %, 400 μL de glucose à 20 %, 1,6 mL de 1 M MES (pH 5,6), 40 μL de 200 mM d’AS à 37,6 mL de solution liquide de 1/2 MS (pH 5,6) (préparée à l’étape 1.3.2) dans un tube stérile de 50 mL. Mélangez bien la solution, couvrez le tube de papier aluminium, et utilisez-le frais dans les quelques heures.
   9. Agar de co-culture agrobactérie-zoospore (AZCA) : Pour préparer 600 mL d’agar, ajoutez 6 mL de glycérol à 50 %, 3 mL de glucose à 20 %, 24 mL de 1 M MES (pH 5,6), 600 μL de 200 mM d’AS pour autoclaver et fondre 567 mL 1/2 agar MS (pH 5,6) (préparé à l’étape 1.3.3). Versez la solution dans des assiettes et recouvrez-les d’un chiffon noir pour les protéger de la lumière.
      REMARQUE : Ajouter les solutions chimiques à un 1/2 MS d’agar fondu (étape 1.3.9) lorsque la température est de 55-60 °C. Éteignez les lumières dans le capot lors des étapes 1.3.7-1.3.9 car l’AS est sensible à la lumière. Effectuez ces trois étapes le jour de la transformation.
   10. Agar plich : Pour préparer 1 L d’agar, dans 950 mL d’eau, ajoutez 0,5 g de_{KH 2}PO₄, 0,25 g de MgSO 4,7H₂O, 1 g de L-asparagine, 5 g de glucose, 0,5 g d’extrait de levure, 10 μL de thiamine (100 mg/mL dans l’eau, stocké à 4 °C), 10 mg de β-sitosterol (à dissoudre dans 3 mL d’éthanol avant l’addition). Remuez la solution pour dissoudre tous les ingrédients, puis ajoutez de l’eau pour atteindre 1 L. Divisez la solution en portions de 500 mL et ajoutez 7,5 g d’agar à chaque 500 mL. Autoclave la solution, puis ajoutez les antibiotiques appropriés lorsque la température descend à 55 °C, puis versez-la dans des plaques.
   11. Membrane Hybond N+ : Découpez la membrane avec les feuilles protectrices en morceaux de 5 cm x 6 cm, enveloppez les morceaux dans du papier aluminium, puis autoclavez-les. Lors de la pose de la membrane autoclavée sur un support AZCA, manipulez-la avec des pinces stériles et jetez les feuilles protectrices.

2. Culture de P. palmivora

1. Sept à huit jours avant la transformation, cultivez l’isolat de papaye P. palmivora P1¹⁶ sur des plaques d’agar V8 fraîchement fabriquées à 10 % en plaçant un bouchon d’agar d’une culture Phytophthora déjà cultivée (ou à partir du stock) au centre de la boîte de Petri.
   REMARQUE : Pour obtenir une concentration plus élevée de zoospores, il est important d’utiliser un agar V8 à 10 % fraîchement préparé, non clarifié.
2. Incubez les plaques à 25 °C sous un cycle de 12 heures de lumière et d’obscurité de 12 heures pendant 7 à 8 jours jusqu’à la transformation.

3. Préparation d’Agrobacterium tumefaciens

1. Trois jours avant la transformation, la souche EHA105 de la série A. tumefaciens transportant pCB301TOR-GFP¹⁶ sur une plaque agar LB complétée par la rifampicine (15 μg/mL) et la kanamycine (50 μg/mL). Couver la plaque à 28 °C pendant 2 jours.
   REMARQUE : La préparation initiale d’Agrobacterium (étape 3.1) peut être effectuée une semaine avant la transformation, et les plaques peuvent être stockées à 4 °C après la période d’incubation de 2 jours.
2. La veille de la transformation, prélever une petite quantité de cellules d’Agrobacterium et les disperser sur une nouvelle plaque d’agar LB complétée par des antibiotiques (comme décrit à l’étape 3.1) en utilisant le fond et la base plate d’un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL. Pour faciliter la propagation, ajoutez 20 μL de milieu liquide au centre de la plaque d’agar LB, mélangez les cellules bactériennes avec le milieu LB, puis répartissez-les uniformément sur la plaque. Incubez la plaque à 28 °C toute la nuit pendant environ 16 à 18 heures.
3. Récupérez les cellules cultivées toute la nuit avec une pointe de pipette de 1 mL et resuspendez-les dans un milieu d’induction Agrobacterium (AIM) de 1 mL en pipettant de haut en bas. Diluer les cellules à OD₆₀₀ = 0,4 avec AIM dans un tube stérile de 50 mL recouvert de feuille d’aluminium. Fabriquez un minimum de 5 mL à utiliser pour la co-incubation avec les zoospores de P. palmivora (étape 5.1).
   REMARQUE : Un OD₆₀₀ allant de 0,1 à 0,8 permettrait une transformation réussie. OD₆₀₀ = 0,4 est couramment utilisé car cette concentration a permis d’obtenir la plus grande efficacité de transformation lorsque des milieux d’induction et de co-culture à base de sel à base de milieu (MM) ont été utilisés pour la transformation¹⁶.
4. Incubez les bactéries en RT dans des conditions sombres pendant 1,5 à 2 heures sur un vibrateur de plateforme avec une agitation douce (environ 70 tr/min).
   REMARQUE : Il est recommandé de garder les lumières du capot éteintes pendant l’étape 3.3 et de desserrer le bouchon du tube de 50 mL pendant l’incubation (étape 3.4).

4. Libération des zoospores

1. Après 1 heure d’incubation d’Agrobacterium tumefaciens (étape 3.4), inondez une plaque de P. palmivora âgée de 7 à 8 jours avec 10 mL d’eau pré-refroidie à 4°C, retirez les bulles d’air à la surface du milieu en tapotant doucement avec une pointe de pipette, puis faites couver la plaque à 4 °C pendant 15 minutes, suivies de 15 minutes à RT sous lumière.
2. Transférez doucement les zoospores libérées (environ 7-8 mL) dans un tube centrifuge stérile de 15 mL avec une pipette sans perturber les mycélium et les sporanges.
3. Pour mesurer la concentration de zoospores, transférez une partie de la suspension de zoospore (par exemple 20 μL) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL et diluez-la 10 fois avec de l’eau (180 μL H₂O pour des zoospores de 20 μL). Faites un vortex sur le tube pendant 1 minute pour encapsuler les zoospores afin de faciliter le comptage, puis comptez le nombre de zoospores au microscope à l’aide d’un hémacytomètre. Multipliez le nombre compté par un facteur 10 pour déterminer la concentration de la suspension de zoospores préparée à l’étape 4.2.
   REMARQUE : La concentration de zoospores est mesurée pour calculer l’efficacité de transformation. Nous utilisons généralement des concentrations allant de 1,5 × 10⁶ à 5 × 10⁶ zoospores par mL, avec un succès de transformation.

5. Co-incubation d’Agrobacterium et de zoospores

1. Ajoutez 5 mL d’Agrobacterium (préparé à l’étape 3.4) à 5 mL de suspension zoospore (préparée à l’étape 4.2) dans un tube stérile de 50 mL recouvert de papier aluminium. Mélangez doucement et incubez la sonde à la RT pendant 2 heures dans le noir. Gardez le couvercle lâche et ne secouez pas le tube pendant la co-incubation.
2. Pendant la période de co-incubation (étape 5.1), préparer les plaques AZCA (étape 1.3.9). Lorsque le milieu se solidifie, placez une membrane Hybond N⁺ stérilisée (préparée à l’étape 1.3.11) sur chaque plaque AZCA et laissez les plaques dans l’obscurité.
3. Après 2 h de co-incubation entre l’agrobactérie et la zoospore (étape 5.1), répartir 300 μL du mélange sur chaque membrane Hybond ^N+ placée au-dessus des plaques AZCA (étape 5.2) avec une pointe de pipette, laissant les marges libres du liquide.
4. Laissez le mélange sécher à l’air pendant environ 10 minutes dans la hotte en laissant les boîtes de Petri découvertes. Couvrez les plaques dès que la solution sur la membrane cesse de circuler.
   REMARQUE : Lors des étapes 5.1-5.4, gardez les lumières du capot éteintes. Si nécessaire, utilisez des lumières lors de l’ajout et de l’étalement du mélange sur les membranes (étape 5.3).
5. Après séchage à l’air, incubez les plaques à 25 °C dans l’obscurité pendant 2 jours.

6. Sélection des transformants résistants à G418

1. Après 48 heures de co-incubation (étape 5.5), transférez les membranes Hybond ^N+ à l’envers à l’aide de pinces stérilisées sur des plaques agar Plich complétées par G418 (30 μg/mL) et de céfotaxime (100 μg/mL). Lors du placement des membranes sur les plaques, ne les traînez pas sur la surface du milieu.
   REMARQUE : La concentration de G418 pour la sélection des transformants pour chaque isolat de P. palmivora doit être déterminée, car différents niveaux de sensibilité sont observés selon les isolats. Pour cela, on place un bouchon de mycélium de 0,5 cm de diamètre au centre des plaques d’agar de Pich, complété par une série de concentrations de G418 par incréments de 5 μg/mL à partir de zéro. Préparez trois plaques réplicatives pour chaque concentration. Incubez les plaques à 25 °C pendant 7 jours. Identifier la concentration la plus faible de G418 qui inhibe complètement la croissance de l’isolat de Phytophthora et l’utiliser pour la sélection des transformants.
2. Utilisez la base plate d’un tube de microcentrifuge de 1,5 mL pour presser doucement et glisser sur la surface de la membrane afin de vous assurer qu’elle est en contact étroit avec le milieu. Observez le dessous des plaques pour vérifier la présence de bulles d’air entre la membrane et le milieu. Pressez doucement la bulle d’air, le cas échéant, en utilisant la base plate du même tube de microcentrifuge.
3. Incubez les plaques sous un cycle clair de 12 heures et 12 heures d’obscurité à 25 °C pendant 2 à 3 jours.
4. Après 3 jours d’incubation, retirez les membranes à l’aide de pinces stériles et continuez l’incubation des plaques dans les mêmes conditions. Les membranes peuvent être retirées après 2 jours si des colonies visibles apparaissent sur les plaques.
   REMARQUE : Les transformants apparaissent généralement dans les 1 à 3 jours suivant le retrait de la membrane, mais certaines colonies peuvent apparaître plus tard. Pour produire plus de transformants, surveillez les plaques pendant environ une semaine après le retrait des membranes.
5. Transférez les transformants sur des plaques d’agar V8 à 10 % avec la même concentration de G418 ou une concentration réduite de 30 %.

Résultats

En suivant ce protocole, nous avons mené deux expériences indépendantes pour transformer P. palmivora en utilisant A. tumefaciens EHA105 portant pCB301TOR-GFP¹⁶. Comme prévu, la co-incubation de zoospores avec Agrobacterium a donné des colonies résistantes à G418 sur des plaques agar de Plich complétées par 30 μg/mL de G418, tandis qu’aucune colonie n’a été observée sur les plaques témoins sans infection par Agrobacterium (Figure 1A). Le nombre de transformants résistants à G418 pour 10⁷ zoospores produites lors de ces deux expériences était respectivement de 55 et 50 (Tableau 1), soit près du double du nombre le plus élevé (27 ± 5) précédemment obtenu avec le protocole¹⁶ antérieur.

Les véritables transformants ont été vérifiés par deux méthodes : d’abord, l’observation de la fluorescence GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence, et deuxièmement, l’amplification par PCR d’un fragment de 550 bp du gène EGFP à l’aide de Taq 2X Master Mix (NEB) avec la paire d’amorces EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACAAGTTC-3') et EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTGGTTG-3'). Dans l’expérience (Exp) 1, 15 transformants résistants à G418 sur 18, et dans Exp 2, 17 transformants sur 21 présentaient une fluorescence GFP (Tableau 1, Figure 1B). Pour les sept transformants résistants au G418 qui n’ont pas montré de fluorescence lors des deux expériences, trois ont été confirmés comme véritables transformants par PCR (Figure 1C). Au total, le taux de véritables transformants était estimé à 90 %.

De plus, nous avons également pu transformer avec succès un isolat de courge de P. capsici , PC2024-14sz, en utilisant A. tumefaciens EHA105 portant pCB301TOR-GFP, suivant le protocole avec une modification mineure dans la préparation des suspensions de zoospores (la période d’incubation à 4 °C après l’inondation d’une plaque de P. capsici vieille de 7 jours avec de l’eau pré-refroidie a été prolongée à 30 minutes). Le nombre de transformants résistants à G418 (30 μg/mL) pour 10⁷ d’une seule expérience était de 13. Neuf transformants ont été observés au microscope à fluorescence, et tous ont produit de la fluorescence (Fichier supplémentaire 1), ce qui suggère qu’il s’agit de véritables transformants.

Figure 1 : Transformation de P. palmivora utilisant A. tumefaciens EHA105 portant pCB301TOR-GFP. (A) Apparition de transformants P. palmivora résistants à G418 sur l’agar Plich complétée par 30 μg/mL G418. (B) Détection de l’expression de GFP au microscope à fluorescence dans une souche représentative de transformant et de type sauvage (WT) de P. palmivora. Les images ont été prises à la fois sous des canaux de fluorescence en champ clair (BF) et GFP. (C) Amplification PCR de l’EGFP à partir de quatre transformants avec fluorescence GFP détectable et sept sans fluorescence GFP. La paire d’amorces universelle ITS4/ITS5²⁰ a été utilisée pour amplifier la région interne de l’espaceur transcrit (ITS) afin de vérifier l’intégrité de l’ADN. Les transformants sans fluorescence GFP sont mis en évidence en gras et souligné. Abréviations : M = échelle d’ADN NEB 100 pb ; WT = isolat P1 de type sauvage P. palmivora ; N = PCR à contrôle négatif en utilisant H₂O comme modèle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Expérience	OD600 d’Agrobacterium	Concentration de zoospores (/mL)	Volume de la zoospore (mL)	Nombre de transformants résistants à G418	Nombre de transformants avec signal GFP détectable (détecté / observé)	Nombre de transformants résistants à G418 / 107 zoospores
1	0.4	1,8 x 106	4.3	43	15/18	55
2	0.4	2,9 x 106	4.6	67	17/21	50

Tableau 1 : Efficacité de la transformation médiée par les agrobactéries de P. palmivora utilisant A. tumefaciens EHA105 transportant pCB301TOR-GFP.

Fichier supplémentaire 1 : Expression de GFP au microscope à fluorescence dans P. capsici de type sauvage (WT ) et un transformant représentatif généré à partir d’A. tumefaciens EHA105 transportant pCB301TOR-GFP. Les images ont été prises à la fois sous des canaux de fluorescence en champ clair (BF) et GFP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole utilise un milieu basal Murashige et Skoog à demi-force (1/2 MS) pour remplacer les composants des sels de milieu minimal (MM) couramment utilisés dans les milieux d’induction et de co-culture Agrobacterium pour la transformation d’oomycètes et fongiques. La préparation de milieux à base de sel MM nécessite de fabriquer plusieurs solutions de stock à partir de nombreux produits chimiques individuels, puis de combiner ces^{solutions 19}. 1/2 MS contient également de nombreux composants chimiques ; cependant, comme la MS est largement disponible dans le commerce en poudre prémélangée, la préparation au moyen est simplifiée en dissolvant la poudre dans l’eau. Cette modification réduit considérablement le temps de préparation des médias et minimise le risque d’erreur humaine. De plus, le protocole améliore l’efficacité de transformation, produisant un nombre plus élevé de transformants par rapport à la méthode^{AMT 16} décrite précédemment. Il est également efficace pour transformer P. capsici et est probablement applicable à d’autres espèces de Phytophthora . Pour renforcer son potentiel d’application plus large, le milieu à base de SEP a déjà été utilisé pour co-cultiver des souches d’Agrobacterium tumefaciens exprimant la protéine interagissant AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interacting 1) et les zoospores de P. infestans , permettant la transformation réussie de P. infestans²¹.

Il est important de noter que ce protocole peut générer un faible pourcentage de faux positifs. Parmi les 39 transformants résistants à G418 testés par observation de fluorescence GFP ou PCR, quatre n’ont montré ni fluorescence ni amplification de l’EGFP (Tableau 1, Figure 1C). Comme l’intégration partielle de l’ADN T lors de la transformation médiée par Agrobacterium n’est pas rare^22,23, il est possible que seule la portion de l’ADN T contenant le gène NPTII provenant du plasmide pCB301TOR-GFP¹⁶ ait été intégrée au génome de P. palmivora. Alternativement, les faux positifs peuvent résulter d’un contact insuffisant entre la membrane et le milieu sélectif, permettant ainsi de s’échapper de la sélection G418. Il est donc essentiel de s’assurer que la membrane reste en contact complet avec le milieu (étape 6.2).

Ce protocole peut être encore simplifié. Par exemple, le MES dans les milieux d’induction Agrobacterium (AIM) et l’agar de co-culture Agrobacterium-zoospore (AZCA) peut potentiellement être omis. Le MES est couramment utilisé comme agent tampon dans les expériences de biochimie et de biologie moléculaire pour maintenir un pH stable ; cependant, préparer une solution MES d’un million à pH 5,6 prend suffisamment de temps et augmente le coût. Dans l’AMT de plantes telles que le basilic^{doux 24} et la papaye²⁵, des milieux similaires d’induction et de co-culture à base de SEP sans MES ont été utilisés, ce qui suggère que le MES pourrait ne pas être essentiel à la transformation de P. palmivora. D’autres expériences sont nécessaires pour confirmer que l’omission de MES ne compromet pas l’efficacité de la transformation.

Dans l’ensemble, ce protocole simplifié offre une plateforme pratique et accessible pour la manipulation génétique de routine de P. palmivora, P. capsici et potentiellement d’autres oomycètes. Il soutient un large éventail d’études fondamentales, dont certaines ont des potentiels translationnels, notamment le marquage fluorescent des agents pathogènes pour suivre la dynamique des infections, le marquage des protéines pour examiner la localisation subcellulaire, et des analyses fonctionnelles via des changements ciblés dans l’expression génique ou les séquences codant pour les protéines. Lorsqu’il est associé à l’édition du génome basée sur CRISPR, le protocole devrait accélérer la dissection des mécanismes de pathogénicité et l’identification des principaux facteurs de virulence dans ces pathogènes destructeurs. Les connaissances qui en résulteront permettront, à leur tour, le développement de nouvelles stratégies de contrôle des maladies fondées sur des mécanismes de sécurité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes microcentrifuges de 1,5 mL	VWR	525-1126
4'-Hydroxy-3',5' diméthoxyacétophénone	TCI	D2666	Acétosyringone (AS)
Tube de 50 mL	Greiner Bio-one	227261
Éthanol absolu	Fisher BioReagents	BP28184
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500
Feuille d’aluminium
Membrane Hybond-N+ (30 cm et fois 3 m)	Cytiva	RPN303B
Carbonate de calcium	Sigma-Aldrich	239216-500G	CaCO3
Céfotaxime sel de sodium	Thermo-Sciences Chimiques	AAJ6269006
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
Kit micro-microbien DNeasy PowerLyzer	Qiagen	12255-50
Pinces
Microscope à fluorescence	Zeiss		Microscope à fluorescence ZEISS Axioscope 5 avec filtre réglé 38 HE
G418 sulfate	Thermo-Sciences Chimiques	AC329400010
Glycérol	Sigma-Aldrich	911046-1L
Hémacytomètre (ligne claire)	Hausser Scientific
Sulfate de kanamycine	Santa Cruz Biotechnologie	SC-257635
L-Asparagine anhydre	MP Biomédicals	ICN10079425
LB Broth, Miller	Fisher BioReagents	BP1426-2
Sulfate de magnésium heptahydré	Sigma-Aldrich	63138-250G	MgSO4· ; 7H2O
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M2933-100G
Médium basal Murashige et Skoog	Sigma-Aldrich	M5519-50L
Boîte de Petri (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-342
Phosphate de dihydrogène de potassium	Sigma-Aldrich	1370391000	KH2PO4
Rifampicine	Santa Cruz Biotechnologie	SC-200910
Taq 2X Master Mix	NEB	M0270L
Chlorhydrate de thiamine	Sigma-Aldrich	T4625-5G
Spectrophotomètre UV-Visible	Fisher Scientific	14-385-355
V8 Original 100 % jus de légumes	Compagnie de soupes Campbell
Vortex	Fisher Scientific	14-955-163
Eau			Grade de biologie moléculaire, purifié à l’aide du système de purification de l’eau Mill-Q
Extrait de levure	ACROS	611805000	Actuellement disponible via Thermo Scientific Chemicals
&beta ;-Sitosterol	Sigma-Aldrich	85451-100G