Le protocole présenté vise à développer un modèle cellulaire imitant l’obésité humaine. Pour y parvenir, les cellules souches humaines dérivées de l’adipeux sont différenciées en adipocytes, qui sont ensuite engraissés à l’aide d’un mélange d’acides gras sélectionnés.
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Article de méthode
Différenciation et induction de l’accumulation de gouttelettes lipidiques dans les adipocytes humains comme modèle d’étude de l’obésité in vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modifications liées à l’obésité dans le tissu adipeux modifient les profils secrètors locaux et influencent les interactions avec d’autres cellules environnantes, y compris les cellules cancéreuses. La livraison continue de nutriments modifie le métabolisme des cellules graisseuses, les faisant agir comme un réservoir lipidique. En général, la recherche sur les mécanismes de l’obésité repose sur des modèles animaux, qui cependant ne permettent pas l’analyse des processus métaboliques au niveau cellulaire. Il est donc nécessaire de développer un modèle in vitro fiable de l’obésité humaine qui puisse aider à explorer les changements de fonction des adipocytes obèses par rapport à leurs homologues maigres. Ce travail présente un protocole pour la différenciation des adipocytes humains à partir de leurs précurseurs (cellules souches dérivées des adipos) à l’aide d’un mélange d’insuline, d’isobutyl-1-méthylxanthine, de dexaméthasone et d’indométhhacine. Par la suite, des adipocytes différenciés ont été incubés avec un ensemble d’acides gras, dont le linoléate, le palmitate et l’oléate, afin de favoriser l’accumulation lipidique. En conséquence, un modèle précieux imitant les cellules hypertrophiques dans des conditions d’obésité a été réalisé, pouvant être utilisé pour d’autres études.
Introduction
L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour un large éventail de maladies, telles que les troubles musculosquelettiques, les maladies cardiovasculaires, la résistance à l’insuline, le syndrome métabolique, le diabète et certains types decancers 1. L’obésité est l’un des problèmes de santé publique les plus perceptibles et sous-estimés, avec des causes multi-élémentaires. En résumé, l’obésité est déclenchée par un déséquilibre entre les calories consommées et dépensées, ce qui entraîne un stockage accrude graisse 2. L’excès calorique entraîne une expansion pathologique et un dysfonctionnement du tissu adipeux (AT), l’élément clé du contrôle de l’énergie par le corps.
Les adipocytes sont le principal composant cellulaire de l’AT3. Le principal facteur contribuant à la croissance de l’AT en conditions d’obésité est l’hypertrophie cellulaire, c’est-à-dire l’augmentation du volume d’adipocytes par une augmentation de la quantité de graisse stockée dans le cytoplasme sous forme de gouttelettes lipidiques (LDs)4. Même si l’obésité est un trouble pathologique complexe, les études sur le fonctionnement biologique des adipocytes peuvent servir de modèle pour analyser ses causes et explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cela met en lumière la nécessité d’une compréhension plus approfondie des mécanismes moléculaires à l’origine des altérations de la fonction des adipocytes afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les maladies liées à l’obésité.
Les modèles animaux sont ceux qui se rapprochent le plus des conditions physiologiques, ce qui les rend largement utilisés pour des études in vivo sur l’obésité5. Cependant, tirer des conclusions sur les processus biologiques fondamentaux au niveau cellulaire reste un défi majeur dans un tel système multicouche, qui favorise l’utilisation de modèles adipocytaires in vitro . La recherche in vitro repose le plus souvent sur le modèle cellulaire 3T3-L1 de la souris, qui, dans des conditions appropriées, acquiert un phénotype6 semblable à un adipocyte. Néanmoins, en raison de son origine, ce modèle ne peut pas être utilisé pour des analyses plus complexes, telles que les conditions de co-culture avec des cellules humaines, et les résultats ne peuvent pas toujours être directement traduits en adipocytes humains. Pour toutes ces raisons, un modèle imitant l’obésité chez l’humain est en cours de recherche, et l’utilisation des cellules souches humaines dérivées de l’adipe (ADSC) avec leur différenciation ultérieure semble rationnelle. Ce modèle est donc le plus adapté à l’étude de l’hypertrophie des adipocytes chez l’humain in vitro en raison de sa faible complexité. Il permet de comparer les paramètres d’un seul type de culture cellulaire dans différentes conditions, ce qui est inatteignable in vivo en raison de la présence de plusieurs types cellulaires dans le tissu adipeux.
Les préadipocytes humains et les cellules souches dérivées de l’adipe isolées de l’AT sont les exemples les plus courants pour étudier le dysfonctionnement de cetissu 6. Après la différenciation, ces cellules constituent un modèle attractif pour moduler les niveaux de LD dans les adipocytes par un engraissement supplémentaire. Néanmoins, il existe relativement peu d’études examinant l’hypertrophie dans les celluleshumaines 7,8,9, et la plupart n’utilisent qu’un seul type d’acide gras (FA) pour induire l’accumulation de LD.
Ce protocole propose de compléter les adipocytes humains avec un mélange d’AF (palmité, oléate et linoléate) pour imiter les environnements d’obésité. Cela permet de réaliser un outil basé sur des adipocytes humains surchargés en lipides, qui peuvent être directement comparés aux cellules adiposes témoins (naïves). Ce modèle peut ensuite être utilisé pour étudier les changements phénotypiques et fonctionnels chez les adipocytes normaux et hypertrophes, ou, si nécessaire, pour des expériences sur des conditions de co-culture.
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Protocole
Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes du protocole dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour les détails sur tous les réactifs et équipements. Le protocole de différenciation décrit ci-dessous convient aux cellules souches humaines dérivées de l’adip et peut différer selon d’autres types cellulaires et leur origine. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation des ADSC pour la différenciation
- Préparer le milieu de croissance des ADSC (ADSCs GM) : compléter le médium modifié Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco’s contenant 1 g/L de glucose avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de glutamine et des antibiotiques - solution antimycotique (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B).
- Réchauffez la solution GM, la solution de solution SAL tamponnée phosphate (PBS) et la solution de trypsine/EDTA à 37 °C.
REMARQUE : Les ADSC sont obtenus à partir de sources commerciales. Utilisez les cellules aux premiers passages. Plusieurs passages entraînent une diminution du potentiel de différenciation desADSC 10. - Retirer aseptiquement le GM des ADSC des ADSC qui croissent dans une fiole T75 dédiée à la culture cellulaire.
- Rince le GM résiduel des ADSC en rinçant la plaque de culture cellulaire avec 5 mL de PBS.
- Retirez tout le volume de PBS de la flasque.
- Ajoutez 2 mL de trypsine/EDTA à la cuvette de culture et incubez-la à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient détachées. Surveillez ce processus avec un microscope inversé.
REMARQUE : Taper la plaque de culture accélère le décollement cellulaire. - Bloquez l’activité de la trypsine en ajoutant 6 mL de nouveaux ADSC GM.
- Déplacez tout le volume de suspension cellulaire de la plaque de culture vers un tube approprié pour la centrifugation.
- Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT).
- Retirez le surnageant.
- Suspendre les cellules dans 2 mL des nouveaux ADSC ajoutés GM.
- Calculez la densité et la viabilité cellulaires à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur automatique de cellules.
REMARQUE : La viabilité cellulaire peut être évaluée à l’aide d’une coloration bleue trypan. - Semez les cellules dans le nombre désiré de puits, 15 000 cellules/puits, une plaque plastique de 96 puits dans 100 μL de milieu de croissance ADSC.
REMARQUE : Les cellules de graines sont toujours en double pour obtenir des adipocytes destinés au contrôle et à l’incubation avec des conditions de FA. Selon le type d’expérience, les ADSC peuvent être ensemencés sur différents types d’assiettes ou de plats en plastique. La densité de semis recommandée est de 30 000 à 60 000 cellules parcm2. Selon le nombre de cellules nécessaire pour les analyses ultérieures ou les expériences en aval, ajustez le format de la boîte de culture cellulaire pour les plaques à 6 ou 12 puits. - Cultivez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.
- Lorsque les cellules ont atteint 100 % de confluence (généralement 24 à 48 heures après le placage), induisent leur différenciation en adipocytes en suivant les instructions ci-dessous.
REMARQUE : Il est important d’atteindre un niveau élevé de confluence cellulaire avant l’induction de la différenciation. Dans d’autres cas, cela peut affecter l’efficacité de la différenciation. Si pour les cellules plaquées, il faut plus de 48 heures pour atteindre une forte confluence, changez le milieu tous les 3-4 jours pour le milieu de croissance frais de l’ADSC.
2. Induction de la différenciation adipogénique
- Préparer le milieu différenciatif (DM) : compléter le milieu DMEM/F12 avec 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, des antibiotiques - solution antimycotique (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B), 5 μg/mL d’insuline, 0,5 mM de 3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 5 μM de dexaméthasone et 200 μM d’indométhhacine.
REMARQUE : Préparez le DM uniquement dans le volume nécessaire pour une utilisation directe. Ne le stockez pas longtemps, et utilisez toujours des DM fraîchement préparés. Avant utilisation, chauffez la DM dans un bain-marie à 37 °C. IBMX et l’indométhhacine peuvent précipiter s’ils sont ajoutés au milieu à une température inférieure à 37 °C. Pour la solubiliser, réchauffez le liquide dans un bain-marie à 37 °C. - Retirez et jetez aseptiquement tout le volume du milieu des ADSC confluents.
REMARQUE : Le milieu de croissance de l’ADSC doit être complètement retiré avant d’ajouter le DM. - Ajoutez soigneusement 100 μL/puits de DM aux cellules qui croissent dans une plaque à 96 puits.
REMARQUE : Ne laissez pas les cellules sécher lors du changement de milieu. - Incubez les cellules dans un incubateur à une température de 37 °C, 5 % deCO2 pendant 7 jours.
- Supprimez et supprimez tout le volume de DM des ADSC.
- Ajoutez soigneusement 100 μL/puits de DM frais aux cellules qui croissent dans une plaque à 96 puits.
- Incubez les cellules dans l’incubateur à une température de 37 °C, 5 % de CO2, pendant les 7 jours suivants.
REMARQUE : La progression de la différenciation adipogénique peut être détectée par l’observation en champ clair des vacuoles lipidiques apparaissant dans les cellules induites.
3. Engraissement des adipocytes
- Préparez un milieu de culture d’adipocytes complété avec des FA : compléter le milieu DMEM/F12 avec 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, antibiotiques - solution antimycotique (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B), 0,33 mM de linoléate, 0,17 mM de palmitate et 0,17 mM d’oléate.
- Préparez un milieu de culture d’adipocytes témoin : compléter le milieu DMEM/F12 avec 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, des antibiotiques - solution antimycotique (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B), 0,44 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,26 % d’éthanol (ces deux derniers composés étant également utilisés comme solvants pour les FA).
REMARQUE : Préparez le contrôle et compléter avec des milieux de culture d’adipocytes FAs uniquement dans le volume nécessaire à une utilisation directe. Ne le conservez pas trop longtemps et utilisez toujours un substrat fraîchement préparé. Avant utilisation, chauffez le milieu dans un bain-marie à 37 °C. - Après un total de 14 jours de différenciation, retirez soigneusement et jetez tout le volume de milieu DM provenant des adipocytes différenciés sur une plaque à 96 puits.
- Ajoutez soigneusement 100 μL/puits de milieu de culture d’adipocytes complété par des FA à la moitié des puits dont les cellules croissent dans une plaque de 96 puits.
- Ajoutez soigneusement 100 μL/puits de milieu de culture d’adipocytes témoins à la seconde moitié des puits avec des cellules qui croissent dans une plaque à 96 puits.
REMARQUE : Ne laissez pas les cellules sécher lors du changement de milieu. - Incubez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 pendant les 48 heures suivantes.
- Après 48 heures, utilisez les cellules témoins et les cellules incubées avec des FA pour les expériences ultérieures.
REMARQUE : À ce stade, les adipocytes égraissés obtenus peuvent être utilisés à de multiples fins expérimentales, telles que la coloration cellulaire, l’analyse du métabolisme cellulaire ou la co-culture avec d’autres types cellulaires.
4. Taches de gouttelettes lipidiques
- Préparez un milieu de culture adipocytaire : compléter le milieu DMEM/F12 avec 10 % de FBS, 2 mM de glutamine, et des antibiotiques - solution antimycotique (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B).
- Diluez le colorant fluorescent pour colorer les LD dans un milieu de culture adipocytaire dans une dilution de 1:1000.
- Retirer et éliminer tout le volume du milieu de culture d’adipocytes témoin et du milieu de culture d’adipocytes complété par des FAs provenant des cellules croisant dans une plaque de 96 puits.
- Ajoutez soigneusement 50 μL/puits de milieu de culture d’adipocytes avec un colorant fluorescent.
REMARQUE : Ne laissez pas les cellules sécher lors du changement de milieu. - Incubez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % deCO2 pendant 15 minutes.
- Rincez le colorant de fluorescence en le remplaçant par un milieu de culture d’adipocytes de 100 μL/puits.
- Acquisition d’image dans le canal de détection de fluorescence verte (Ex 427 nm/Em 585 nm) avec le microscope fluorescent.
REMARQUE : Voici le protocole pour la coloration des cellules vivantes. La coloration peut également être effectuée après fixation au formaldéhyde des cellules.
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Résultats
La méthode décrite ici permet de différencier les ADSC humains en adipocytes matures, suivie d’une accumulation accrue de lipides, imitant les cellules hypertrophiques observées dans des conditions d’obésité. Le parcours temporel de la différenciation des ADSC humains est montré à la Figure 1. Au jour 0, lorsque les cellules atteignent 100 % de confluence (Figure 1A), les ADSC présentent une morphologie allongée en forme de fuse...
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Discussion
Le protocole actuel est une procédure reproductible en deux étapes pour la différenciation des ADSC, suivie d’une incubation avec des FA afin d’obtenir un modèle cellulaire imitant l’obésité. L’étape critique déterminant son efficacité est le nombre de passages des ADSC après son isolement. Plusieurs passages entraînent une diminution du potentiel de différenciation de cescellules 10.
Lors de la différenciation des adipocytes, les ADSC ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs affirment qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail rapporté dans cet article.
Remerciements
L’article a été financé par le Centre National des Sciences de Pologne, avec des subventions reçues par Dorota Nowak (OPUS 22, n° 2021/43/B/NZ3/01458) et Aleksandra Simiczyjew (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| 3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) | Merck | I5879 | ||
| 0,25 % de trypsine/0,05 % d’EDTA pH 7,2 | IITD PAN, Wroc | Thermo | 130188 | |
| Antibiotiques - Solution antimycotique | Sigma-Aldrich | A5955 | ||
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | ||
| Compteur cellulaire | N/A | N/A | ||
| Centrifugeuse | N/A | N/A | ||
| Dexaméthasone | Sigma-Aldrich | D4902 | ||
| Eagle Medium Modifié (DMEM) de Dulbecco | IITD PAN, Wroc | Gibco | 11320-033 | |
| Éthanol | Chempur | 113964200#1L | ||
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco | A5256701 | ||
| hADSC Cellules souches humaines dérivées de l’adipe | Lonza | PT-5006 | ||
| Incubateur | N/A | N/A | ||
| Indométhhacine | Sigma-Aldrich | I8280-5G | ||
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | ||
| Microscope inversé | N/A | N/A | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | 25030-024 | ||
| Sel de sodium à l’acide linoléique | Sigma-Aldrich | L8134 | ||
| LipidSpot fluorescent | Biotium | 70065 | ||
| Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) | Thermo | 10010023 | ||
| Soduim oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | ||
| Soduim palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | ||
| Flacon de culture cellulaire T75 | Thermo | 130190 | ||
| Bleu de trypan | Sigma-Aldrich | 95896HJ |
Références
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