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Article de recherche

L’ARN circulaire ZBTB46 atténue l’apoptose et le stress oxydatif dans les cellules endothéliales humaines lésées par des lipopolysaccharides en modulant la signalisation ERBB2-AKT

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DOI :

10.3791/69765

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13 février 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

Dans cet article

Résumé

L’insuffisance rénale aiguë associée à la septicémie (SA-AKI) est associée à des taux de mortalité considérables. Cette étude révèle une réduction de la régulation du circZBTB46 dans les HUVEC induits par le LPS ( SA-AKI in vitro). Sa surexpression augmente la viabilité de HUVEC, réduit l’apoptose, l’inflammation et le stress oxydatif en association avec la signalisation ERBB2/AKT, suggérant une cible thérapeutique potentielle pertinente pour la SA-AKI.

Résumé

Les ARN circulaires sont des régulateurs émergents des réponses au stress, mais leur rôle dans les lésions endothéliales conduisant à une lésion rénale aiguë liée à la septicémie reste incomplètement défini. Nous avons émis l’hypothèse que l’ARN circulaire ZBTB46 (circZBTB46) confère une protection endothéliale en engageant la signalisation ERBB2-AKT. À l’aide d’un modèle cellulaire dans lequel les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine ont été mises au défi avec un lipopolysaccharide, nous avons quantifié l’expression de circZBTB46 et testé les effets de son expression forcée sur la survie, l’apoptose, les médiateurs inflammatoires et l’homéostasie redox. Les tests de viabilité cellulaire et la cytométrie en flux ont évalué la survie et l’apoptose. Les tests immunosorbants liés aux enzymes ont mesuré l’interleukine-6, le facteur de nécrose tumorale α et l’interleukine-1β, tandis que les espèces réactives de l’oxygène, le malondiadéhyde, la superoxyde dismutase et la catalase ont été évaluées comme indices de lésions oxydatives et de capacité antioxydante. Pour définir le mécanisme, nous avons réalisé un profilage transcriptomique avec une analyse d’enrichissement de l’ensemble de gènes, confirmé les protéines de la voie par Western blotting, et évalué la nécessité à l’aide de l’inhibiteur d’ERBB2 AG-825. Hypopolysaccharide supprimé circZBTB46. La surexpression de CircZBTB46 a augmenté la viabilité, réduit l’apoptose, réduit les cytokines pro-inflammatoires et les espèces réactives de l’oxygène, diminué le malondiadéhyde, ainsi qu’une augmentation des activités de superoxyde dismutase et catalase. Les analyses transcriptomiques et protéiques ont soutenu l’activation de l’axe ERBB2-AKT, et le blocus pharmacologique ERBB2 a atténué la cytoprotection et inversé les gains de l’équilibre redox. Ces résultats identifient circZBTB46 comme un frein endogène sur les lésions endothéliales induites par lipopolysaccharides via la signalisation ERBB2-AKT et nomment circZBTB46 comme nœud mécaniste et cible thérapeutique potentielle pour la lésion rénale aiguë liée à la septicémie.

Introduction

La septicémie, une cascade inflammatoire systémique menaçant la vie initiée par une invasion pathogène, aboutit fréquemment à une défaillancemulti-organique 1. Dans ce contexte critique, la SA-AKI apparaît comme une complication prédominante et cliniquement significative dans les unités de soinsintensifs 2. Caractérisée par une détérioration soudaine de la capacité de filtration rénale concomitante à une infection systémique, cette affection présente des taux de mortalité supérieurs à ceux de l’IAK non septique de 38 % à 42 % dans les cohortescliniques 2. Environ 60 % des personnes diagnostiquées avec une septicémie ou un choc septique devraient développer uneSA-AKI 3. Par conséquent, l’AS-AKI est devenue un défi majeur en soins intensifs, contribuant de manière significative à la morbidité et à lamortalité 4. À l’heure actuelle, le mécanisme de la SA-AKI reste incomplètement compris. Bien que les études précliniques aient porté sur des dysfonctionnements microcirculatoires, des altérations du métabolisme cellulaire et des déséquilibres au sein du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS), des dysfonctionnements mitochondriaux et une dysrégulation inflammatoire, le mécanisme physiopathologique de la SA-AKI reste insaisissable, et il existe actuellement un manque de mesures optimales pour soutenir un diagnostic précoce et une prise en chargecontinue 5,6,7,8 . L’AC-A-AKI présente une apoptose accrue, un stress oxydatif excessif et une inflammation9. Dans ce cadre de recherche, le lipopolysaccharide (LPS) a été utilisé dans un système in vitro pour imiter les manifestations de l’AKI associée à la sepse dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) pour une exploration préliminaire decibles 5.

Ces dernières années, les ARN circulaires (circARN), une catégorie récemment identifiée de molécules d’ARN non codants, ont attiré une attention croissante pour leur rôle dans diversesmaladies 10. Les CircARN possèdent une structure circulaire stable et participent aux processus physiologiques et pathologiques cellulaires en servant d’éponges moléculaires pour les microARN (miARN), en régulant la transcription génique ou en participant à des interactions protéiques11. Les études ont indiqué que les circARN sont essentiellement impliqués dans la modulation de l’inflammation, du stress oxydatif et des voies apoptotiques, ce qui a accru l’attention de la recherche sur leurs possibles implications dans la septicémie et les affections associées, y compris l’insuffisance rénaleaiguë 12. Par exemple, hsa_circ_0072463 a été identifié comme un marqueur diagnostique prometteur et une cible thérapeutique pourSA-AKI 13. Circ_001653 a été rapporté comme soulageant le SA-AKI grâce au recrutement de BUD13-14. Cependant, la signification fonctionnelle des circARN dans le SA-AKI reste largement inexplorée.

Cette étude visait à examiner l’influence de circZBTB46 sur la fonction des cellules endothéliales, le stress oxydatif et les réponses inflammatoires à l’aide d’un système SA-AKI in vitro . En construisant un modèle HUVEC induit par LPS, nous avons étudié les lésions endothéliales sous stimulation endotoxine. Il convient de noter que les HUVEC défiés par le LPS représentent un modèle de stress endothélial réductionniste piloté par les endotoxines et TLR4, pertinent mais non équivalent à la physiopathologie multifactorielle de la lésion rénale aiguë associée à la septicémie. Ce modèle capture principalement l’activation inflammatoire médiée par TLR4, le stress oxydatif et les réponses endothéliales liées à l’apoptose, tout en omettant des composants clés in vivo tels que les altérations hémodynamiques, les cascades de complément et de coagulation, les schémas moléculaires associés aux dommages et les stimuli microbiens hétérogènes. Dans ce cadre expérimental, nous avons étudié si le circZBTB46 atténue le stress oxydatif induit par le LPS et l’apoptose en modulant la voie de signalisation ERBB2, protégeant ainsi la fonction des cellules endothéliales. À notre connaissance, cette étude fournit la première preuve liant circZBTB46 aux réponses endothéliales au stress dans le contexte de la lésion rénale aiguë associée à la septicémie. En élucidant les mécanismes moléculaires sous-jacents à la protection endothéliale médiée par le circZBTB46, cette recherche pourrait approfondir la compréhension des mécanismes pathogènes de SA-AKI et ouvrir la voie à des approches thérapeutiques innovantes centrées sur le circARN.

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Protocole

Ce protocole décrit les procédures expérimentales utilisées pour étudier les effets de la modulation circZBTB46 sur la signalisation inflammatoire, le stress oxydatif et l’activation de la voie ERBB2-AKT chez les HUVEC.

Culture cellulaire
Les cellules HUVEC utilisées dans cette étude ont été obtenues à partir d’une source commerciale. Les HUVEC ont été utilisés comme modèle représentatif des cellules endothéliales en raison de leur large disponibilité, de leurs conditions de culture reproductibles et de leur grande efficacité de transfection, qui facilitent la manipulation génétique et l’investigation mécanistique des voies de signalisation endothéliales sous stressinflammatoire 15,16. Les HUVEC ont été cultivés dans du DMEM complétés avec un sérum fœtal bovin à 10 % (v/v) et un cocktail antibiotique-antimycotique à une concentration de 1 %. Toutes les cultures cellulaires ont été maintenues dans des conditions physiologiques standard dans une chambre humidifiée (37 °C, 5 % CO2), ce qui favorisait une prolifération cellulaire soutenue tout en préservant >95 % de viabilité, comme confirmé par un test d’exclusion au bleu de trypan. Bien que les milieux endothéliaux spécifiques (par exemple, EGM-2 ou M199 complétés par des compléments de croissance endothéliale) soient couramment recommandés pour le maintien à long terme de HUVEC, le DMEM a été utilisé dans cette étude pour assurer la cohérence entre traitements expérimentaux et la compatibilité avec la stimulation LPS et les tests d’inhibiteurs pharmacologiques. Pour les tests d’inhibiteur d’AG-825, incuber des HUVEC avec du DMEM frais contenant 10 μM d’AG-825 pendant 1 heure. Ensuite, ajoutez la solution LPS aux puits pour obtenir une concentration finale de 10 μg/mL, et poursuivez la culture pendant 24 heures. Pour minimiser la dérive phénotypique potentielle, les HUVEC ont été utilisés à faible nombre de passages et exposés à des conditions expérimentales basées sur le DMEM uniquement pour des tests à court terme. Toutes les expériences fonctionnelles ont été réalisées dans des fenêtres de traitement définies plutôt que lors d’une culture prolongée.

Transfection cellulaire
Pour élucider le rôle biologique de circZBTB46, des plasmides de surexpression (oe-circZBTB46) et des constructs témoins négatifs appariés (oe-NC) ont été synthétisés et validés par GenScript. Les HUVEC ont été ensemencés en plaques à 6 puits à une densité de 1 x 10⁵ cellules/puits et cultivés toute la nuit pour atteindre une confluence de ~70 % à 80 % au moment de la transfection. Pour chaque puits, 2,5 μg d’ADN plasmidique (oe-circZBTB46 ou oe-NC) était dilué dans 125 μL de milieu sérique réduit et mélangé à 2,5 μL de réactif P3000 (tube A). Parallèlement, 3,75 μL de Lipofectamine 3000 ont été dilués dans 125 μL de milieu sérique réduit (tube B). Les tubes A et B ont ensuite été combinés, légèrement mélangés, puis incubés à température ambiante pendant 15 à 20 minutes pour permettre une formation complexe (volume complexe final : 250 μL/puits). Les complexes ont été ajoutés goutte à goutte aux cellules dans un milieu complet sans antibiotiques. Après 6 heures d’incubation à 37 °C, 5 % deCO2, le milieu de transfection a été remplacé par un milieu de croissance complet et frais. Les cellules ont été cultivées pendant 48 heures avant les tests ultérieurs. Toutes les procédures suivaient les instructions du fabricant.

Modèle induit par LPS
Pour générer un modèle SA-AKI in vitro, des HUVEC (5 x 10 cellules de5 cellules/puits) transfectés avec oe-circZBTB46 ou NC ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits et maintenus pendant 24 heures jusqu’à atteindre une confluence de 80 %. Par la suite, ces cellules ont été traitées par LPS à 10 μg/mL pendant 24 heures. Les HUVEC sans traitement LPS ont servi de groupe témoin.

qRT-PCR
L’extraction totale d’ARN à partir de HUVEC utilisait un réactif commercial. La transcription inverse pour la synthèse d’ADNc a été réalisée avec le kit de réactifs commercial. La PCR quantitative (qPCR) était exécutée en triple exemplaire à l’aide d’un système de PCR en temps réel accompagné d’un mix maître. Les quantités d’expression des gènes cibles ont été calibrées par rapport à U6, l’analyse étant réalisée via la méthode 2−ΔΔCT 17,18. Pour l’analyse de l’expression des circARN, l’ARN nucléaire petit U6 a été utilisé comme référence interne pour la normalisation, car il est couramment employé pour la quantification de petits ARN non codants et a été rapporté comme présentant une expression relativement stable dans des conditions expérimentales in vitro à court terme. Les séquences d’amorçage appliquées dans cette étude sont listées comme suit :

circZBTB46-Avant : 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Revers : 5'-CGCCTCTTCTACACTAGGGG-3'

U6-Attaquant : 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Reverse : 5'-GAGGTCATGCTAATCTCTCTCTG-3'.

Essai CCK-8
La viabilité des HUVEC a été évaluée à l’aide de CCK-8 achetés commercialement. En résumé, les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits, et les cellules ont subi une culture d’adhésion pendant 24 heures. Ensuite, 10 μL de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, et les cellules ont été ensuite incubées à 37 °C pendant 2 heures. Un lecteur de microplaques a été utilisé pour mesurer la densité optique (OD) à une longueur d’onde de 450 nm. Des observations préliminaires ont démontré que 10 μg/mL de LPS diminuaient significativement la viabilité des HUVEC, ce qui a conduit à la sélection de cette concentration pour les processus expérimentaux ultérieurs.

Cytométrie en flux
Initialement, les HUVEC étaient détachés avec de la trypsine sans EDTA selon les procédures standard. Conformément aux directives du fabricant pour le kit d’analyse d’apoptose Annexin V-APC/PI, les suspensions cellulaires ont été centrifugées à 1 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C, après dissociation enzymatique. Les cellules granulées ont ensuite été lavées 2 fois avec du PBS glacé dans des conditions identiques et resuspendues dans 100 μL de tampon de liaison 1x. Chaque échantillon a été traité avec 5 μL de conjugué Annexin V-FITC et 5 μL de solution colorante au iodure de propidium (PI), suivi d’une incubation de 10 minutes dans l’obscurité à température ambiante (20-25 °C). Enfin, 400 μL de tampon de liaison 1x ont été ajoutés à tous les échantillons, et l’apoptose a été analysée en 1 heure à l’aide d’un cytomètre en flux. Les événements ont d’abord été bloqués par FSC/SSC pour exclure les débris. Pour l’analyse de l’apoptose, des portes de quadrants ont ensuite été appliquées sur le graphique Annexin V-FITC vs PI en utilisant des contrôles appropriés (non colorés et contrôles à coloration unique/compensation) pour définir des populations vivantes (Annexin V-/PI-), apoptotiques précoces (Annexin V+/PI-), apoptotiques tardives (Annexin V+/PI+) et nécrotiques (Annexin V-/PI+). Le même modèle de barrage et les mêmes seuils ont été appliqués sur tous les échantillons.

Essai ELISA
Les concentrations de facteurs inflammatoires — facteur de nécrose tumeur-α (TNF-α), interleukine-6 (IL-6) et interleukine-1β (IL-1β) — dans le surnageant des HUVEC cultivés ont été mesurées à l’aide de kits ELISA disponibles dans le commerce. Plus précisément, le kit ELISA TNF-α humain a été utilisé, le kit ELISA IL-6 humain et le kit ELISA IL-1β humain ont été utilisés selon les instructions du fabricant. Pour chaque analyse, 50 μL de surnageant de culture cellulaire non diluée étaient chargés par puits. Les courbes standard étaient générées à l’aide des dilutions sérielles fournies (TNF-α : 0-1000 pg/mL ; IL-6 : 0-500 pg/mL ; IL-1β : 0-200 pg/mL). Après l’échantillon et l’ajout standard, les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 90 minutes, suivies de cinq lavages avec tampon de lavage. Un anticorps de détection conjugué à la biotine a ensuite été ajouté et incubé à 37 °C pendant 60 minutes. Après une autre étape de lavage, la streptavidine-HRP a été ajoutée et incubée à 37 °C pendant 30 minutes. Après un lavage final, un substrat de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) a été ajouté et incubé à 37 °C dans l’obscurité pendant 15 minutes. La réaction a été interrompue par une solution d’arrêt, et l’absorbance a été immédiatement mesurée à 450 nm avec une longueur d’onde de référence de 630 nm. Chaque échantillon et standard a été analysé en double, et toutes les expériences comprenaient trois réplications biologiques indépendantes. Les niveaux de marqueurs de stress oxydatif — malondiadéhyde (MDA), superoxyde dismutase (SOD) et catalase (CAT) — dans le surnageant ont été évalués à l’aide du kit MDA ELISA, du kit SOD ELISA et du kit CAT ELISA, respectivement, selon les protocolesfournis 19, 20, 21. Pour les tests MDA et SOD, 40 μL de surnageant ont été utilisés par puits sans dilution ; pour le CAT, les échantillons étaient dilués à 1:10 avec un tampon d’essai avant le chargement. Les courbes standard étaient préparées selon les spécifications du kit (MDA : 0-60 nmol/mL ; SOD : 0-100 U/mL ; CAL : 0-100 U/mL). Les étapes d’incubation ont été effectuées comme suit : MDA - 60 min à 37 °C ; SOD - 60 min à 37 °C ; CAT - 30 min à 37 °C. Les plaques ont été lavées 4 fois entre les étapes clés d’incubation. Le développement des couleurs a été obtenu en ajoutant les substrats respectifs et en incubant à 37 °C (MDA : 15 min ; Durée de séance : 20 min ; CAT : 15 min). L’absorption a été mesurée à 450 nm pour SOD et CAT, et à 532 nm pour MDA. Toutes les mesures ont été effectuées dans des puits en double et répétées sur trois réplications biologiques indépendantes.

Séquençage de l’ARN
L’ARN total a été extrait des HUVEC à l’aide de réactifs commerciaux selon les instructions du fabricant. La pureté et la concentration de l’ARN ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nm (A260/A280), et l’intégrité de l’ARN a été évaluée à l’aide d’un bioanalyseur. Seuls des échantillons d’ARN avec un numéro d’intégrité ARN (RIN) ≥ 7 ont été utilisés pour la préparation ultérieure de la bibliothèque. L’ARN ribosomique a été retiré lors de la préparation de la bibliothèque à l’aide d’une procédure standard de déplétion de l’ARNr réalisée par une entreprise commerciale. Lorsque cela est indiqué, un traitement RNase R a été appliqué avant la construction de la bibliothèque pour digérer sélectivement les ARN linéaires et enrichir les espèces d’ARN circulaires. La fragmentation de l’ARN a ensuite été réalisée sous des températures élevées selon le protocole standard du manuel du kit de préparation de la bibliothèque d’ARN afin de générer des fragments d’ARN de taille appropriée. Les bibliothèques de séquençage étaient préparées à l’aide du kit de préparation de la bibliothèque ARN selon les instructions du fabricant et séquencées sur une plateforme Illumina selon une stratégie de séquençage par extrémités avec une longueur de lecture de 150 bp (PE150). La profondeur de séquençage était suffisante pour soutenir une analyse à l’échelle du transcriptome. Les lectures de séquençage brut étaient traitées selon des procédures standard de contrôle qualité pour supprimer les séquences d’adaptateurs et les lectures de faible qualité. Les lectures nettes ont été alignées sur le génome de référence humain, et les niveaux d’expression génique ont été quantifiésen conséquence 22,23. Des gènes différenciellement exprimés (DEG) entre les HUVEC surexprimant circZBTB46 et les HUVEC traités NC sous stimulation LPS ont été identifiés à l’aide de méthodes statistiques établies. L’analyse d’enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) a été réalisée pour identifier les voies de signalisation associées à la surexpression de circZBTB46. Les gènes ont été classés selon l’expression différentielle entre les groupes expérimentaux. Des ensembles de gènes sélectionnés issus de la Molecular Signatures Database (MSigDB) ont été utilisés pour l’analyse d’enrichissement. La signification de l’enrichissement a été évaluée sur la base du score d’enrichissement normalisé (NES) et du taux de fausses découvertes (FDR), FDR < 0,25 étant considéré comme statistiquement significatif. Le séquençage des CircARN et toutes les analyses bioinformatiques associées ont été externalisés.

Identification des DEG
Pour filtrer les DEG, les niveaux d’expression entre deux groupes distincts ont été comparés via le logiciel DESeq (2012) R. Les seuils de signification statistique ont été définis comme p < 0,05 avec un |log2FC| valeur supérieure à 0,58. La carte thermique a été générée par le paquet Pheatmap R, et le graphique volcanique utilisait le paquet Goplot2 R pour le dessin.

Analyse de l’enrichissement fonctionnel
Les analyses d’enrichissement GO et KEGG dérivées de transcriptions linéaires ont été réalisées via la plateforme en ligne EnrichR, et le Bubble Chart a été dessiné à partir du package GOplot R. Le logiciel GSEA a été utilisé, basé sur la matrice d’expression et les fichiers de l’ensemble génétique fournis par la base de données MSigDB, avec des paramètres d’analyse définis (par exemple, nombre de permutations et méthodes statistiques). L’enrichissement des ensembles de gènes a été évalué à l’aide du score d’enrichissement normalisé (NES), de la valeur P et de la valeur FDR, offrant une exploration approfondie des fonctions et des mécanismes biologiques potentiels des gènes exprimés différenciellement.

Tache occidentale
La protéine totale a été extraite des HUVEC (environ 1 x 10⁶ cellule) à l’aide d’un tampon de lyse RIPA complété avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. La concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un kit de quantification des protéines BCA. Des quantités égales de protéines (20 μg par voie) ont été résolues par électrophorèse sur des gels de dodécyle sulfate-polyacrylamide à 10 % (SDS-PAGE) à 80 V pendant 30 minutes, suivies de 120 V pendant 60 minutes. Par la suite, les protéines ont été transférées dans des membranes de polyvinylidène fluorure (PVDF) à l’aide d’un système de transfert humide à 100 V pendant 90 minutes à 4 °C. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé dans une solution saline tamponnée à 0,1 % Tween-20 (TBST) pendant 1 heure à température ambiante, suivie d’une incubation avec des anticorps primaires dilués dans le même tampon de blocage (typiquement 1:1000 pour les protéines cibles et 1:5000 pour le GAPDH) à 4 °C pendant la nuit. Les principaux anticorps utilisés étaient les suivants : ERBB2, p-AKT, AKT et GAPDH. Après l’incubation, les membranes ont été lavées 3 fois (10 min par lavage) avec TBST puis incubées avec un anticorps secondaire anti-lapin, IgG de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1:5000 en tampon de blocage) pendant 1 h à température ambiante. Après trois lavages supplémentaires de TBST (10 min chacun), les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un kit de substrat Western Blotting à chemiluminescence améliorée (ECL) et imagées avec un système d’imagerie. Les intensités des bandes ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel.

Analyse statistique
Les évaluations statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism 10. Les données sont affichées sous forme de moyens ±erreur standard des moyennes (SEM). Une valeur p < 0,05 a été définie pour indiquer la signification statistique.

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Résultats

Analyse qRT-PCR de l’expression de circZBTB46 dans un modèle in vitro SA-AKI
Cet ensemble d’expériences a été mené pour tester l’hypothèse selon laquelle l’expression de circZBTB46 est modifiée sous stimulation LPS et que la modulation de circZBTB46 affecte la viabilité des cellules endothéliales et l’apoptose dans un modèle in vitro SA-AKI. Au départ, l’e...

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Discussion

Lors de la septicémie, les motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP), tels que le LPS libéré par les agents pathogènes, activent des récepteurs de type Toll (par exemple, TLR4), déclenchant une réponse inflammatoiresystémique 26. Ce processus déclenche la sécrétion de multiples médiateurs pro-inflammatoires, tels que TNF-α, IL-6 et IL-1β, provoquant une tempête decytokines 27. Simultanément, le LPS endommage directement les ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent. Les auteurs déclarent que les principaux résultats présentés dans ce manuscrit n’ont pas été publiés auparavant et ne sont pas en cours d’examen pour une publication ailleurs.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AG-825 (inhibiteur d’ErbB2)MedChemExpressHY-1019710 & mu ; M pour blocage de passage
Bioanalyseur Agilent 2100AgilentG2939BAIntégrité de l’ARN (RIN&ge ; 7)
Anticorps AKTProteintech60203-2-IGWB (1:15000)
Kit d’apoptose Annexin V-APC/PIElabscienceE-CK-A327Détection de l’apoptose
Antibiotique-AntimycotiqueGibco152400621 % de concentration
Kit de quantification des protéines BCABeyotimeP0012Concentration en protéines
CAT ELISA KitMEIMIANMM-0897H2Enzyme antioxydante
CCK-8 KitDojindoCK04Essai de viabilité cellulaire
CircRNA seqFuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.PE150Séquençage des circARN et toutes les analyses bioinformatiques associées
Cytomètre à flux CytoFLEXBeckman CoulterB53000Analyse de l’apoptose
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Milieu de culture cellulaire
Kit de substrat ECLMilliporeWBKLS0100Détection des protéines
Anticorps ERBB2Sino Biological100271-T32WB (1:10000)
Sérum fœtal bovin (FBS)Industries biologiques04-001-1ACSSupplément à 10 % (v/v)
Anticorps GAPDHProteintech60004-1-IGWB (1:50000)
HUVECsSystème ProcellCP-H082Source de la lignée cellulaire
IL-1 & bêta ; ELISA KitMEIMIANMM-0181H2Facteur inflammatoire
IL-6 ELISA KitMEIMIANMM-0049H2Facteur inflammatoire
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Séquençage de l’ARN
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000008Réactif de transfection
LPS (E. coli O111 :B4)Sigma-AldrichL263010 & mu ; g/mL pour le modèle SA-AKI
MDA ELISA KitMEIMIANMM-2037H2Marceur de stress oxydatif
NanoDrop 2000Thermo FisherND-2000Quantification de l’ARN
Kit de bibliothèque ARN NEBNext Ultra IINEBE7770SPréparation de la bibliothèque RNA-seq
plasmide oe-circZBTB46GenScriptSynthèse personnaliséeVecteur de surexpression circZBTB46
Plasmide OE-NCGenScriptSynthèse personnaliséeVecteur de contrôle négatif
Anticorps p-AKT (Ser473)Proteintech66444-1-IGWB (1:1200)
Kit de réactifs PrimeScript RTTakaraRR047ASynthèse de l’ADNc
PVDF MembranesMilliporeIPVH00010Transfert de blot occidental
Système QuantStudio 5Thermo FisherA28137PCR en temps réel
Ribonucléase RLucigenRNR07250Retrait de l’ARNr
Tampon de lyse RIPABeyotimeP0013BExtraction des protéines
RNAiso PlusTakara9109Extraction totale d’ARN
SOD ELISA KitMEIMIANMM-25469H2Enzyme antioxydante
TB Green Premix Ex TaqTakaraRR420ARéactif qPCR
TNF-& alpha ; ELISA KitMEIMIANMM-0122H2Facteur inflammatoire

Références

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