Quantification PCR en temps réel de l’ADN bactérien du complexe rouge et de l’état parodontal chez les porteurs de prothèses partielles amovibles

Résumé

La réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR) a été utilisée pour quantifier l’ADN des bactéries du complexe rouge chez les porteurs de prothèses partielles amovibles (DPR). Cette étude promet une approche novatrice pour les futures stratégies de traitement par prothèses implantées pour ces patients, en tenant compte du rôle de ces bactéries dans le développement de la péri-implantite.

Résumé

L’insertion de prothèses partielles amovibles (DPR) dans la cavité buccale est associée à des modifications de la microflore buccale au fil du temps. Cependant, il existe une rareté de la littérature examinant la présence de bactéries du complexe rouge (RCB) chez ces patients. Compte tenu du rôle établi de la RCB dans le développement de la parodontite, de la péri-implantite et de diverses maladies systémiques, il est crucial d’étudier l’impact des DPR sur ces bactéries. Cette étude vise à quantifier la charge subgingivale des dents de cul en colonne de Treponema Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia et Treponema denticola-in chez des patients partiellement édentules réhabilités avec des DPR, en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-PCR). Un objectif secondaire était d’évaluer le statut parodontal des dents à cul et non, ainsi que de déterminer les corrélations entre la charge microbienne et les indices parodontaux cliniques.

Trente participants nécessitant un RPD ont été inscrits. L’acide désoxyribonucléique (ADN) a été isolé à partir d’échantillons bactériens obtenus sur les dents de culée avant (T0) et 3 mois après l’insertion (T3). La quantification des RCB a été réalisée par RT-PCR et exprimée sous la forme de « Lg (équivalents du génome/échantillon) ». Les paramètres cliniques — indice de plaque (PI), indice gingival (IG), profondeur de sonde (MP) et mobilité dentaire (TM) — ont été enregistrés pour les dents à cul et sans pille à chaque moment.

Les dents de culée ont montré des augmentations statistiquement significatives des charges en BCR chez les trois espèces cibles de T0 à T3 : P. gingivalis (1,99 ± 2,01 contre 3,64 ± 2,21, p = 0,00003), T. forsythia (2,20 ± 2,17 contre 3,56 ± 2,33, p = 0,00009), et T. denticola (0,82 ± 1,41 contre 2,35 ± 2,21, p = 0,0001). Bien que les paramètres parodontaux aient été élevés entre les dents à cul et non cul après le traitement, les différences n’ont pas atteint une signification statistique. Parmi les agents pathogènes, T. forsythia présentait la corrélation positive la plus forte avec les indices parodontaux.

L’utilisation à court terme des DPR est associée à une augmentation significative de la colonisation RCB des dents du culier, suggérant des déplacements microbiens et inflammatoires précoces pouvant précéder une dégradation parodontale cliniquement évidente.

Introduction

La cavité buccale abrite un microbiome dynamique dont l’équilibre écologique est essentiel pour maintenir la santé^{parodontale 1}. La perturbation de cette homéostasie microbienne, due à des facteurs endogènes et exogènes, peut perturber l’homéostasie microbienne, créant des conditions favorables à la croissance de bactéries pathogènes, y compris des pathogènes parodontaux tels que Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia et Treponema denticola, collectivement appelées bactéries du complexe rouge (RCB⁾². Ces agents pathogènes sont essentiels dans la pathogenèse de la parodontite et de la péri-implantite, agissant en synergie pour échapper aux défenses de l’hôte, favoriser l’inflammation et faciliter la destruction des tissus parodontaux, conduisant fréquemment à la perte de^{dents 3,4}. La perte dentaire affecte négativement la capacité d’une personne à manger et à parler, et contribue à une diminution du sentiment de confiance et de bien-être, augmentant ainsi le besoin de compensation prothétique. Parmi les méthodes les plus couramment utilisées, en particulier chez les personnes âgées en raison de diverses affections locales et générales, figure le traitement prothétique avec des prothèses partielles amovibles (DPR). Cependant, avec le temps, les^{RPD 5} peuvent entraîner divers problèmes.

Des preuves solides suggèrent que l’utilisation de DPR peut entraîner une accumulation de plaque dentaire et le développement d’une inflammation des tissus gingives et parodontaux, notamment concernant les cloisons 6,7,8,9,10. Cependant, la survenue de tels troubles bucco-dentaires dépend également de l’engagement du patient envers l’hygiène bucco-dentaire ainsi que des soins et de l’entretien de la prothèse^{11, 12, 13, 14}. Bassi et al. ont souligné dans leurs recherches l’importance de contrôler la plaque dentaire. Ils ont examiné des patients ayant porté des DPR pendant une période de 6 à 12 ans et ont constaté que l’état parodontal des dents à culée était similaire à celui des dents sans cul dans les cas présentant une hygiène bucco-dentaire régulière. En revanche, la condition parodontale s’est aggravée chez le groupe de patients qui n’accordaient pas d’importance au suivi et au maintien de l’hygiène^{bucco-dentaire 13}.

Malgré les avantages fonctionnels des DPR, leur insertion dans la cavité buccale entrave la libre circulation de la salive, prédisposant la formation d’une couche pelliculaire à la surface de la prothèse pouvant conduire à une colonisation bactérienne. Différents types de bactéries nocives ont été identifiés chez les patients atteints de^{PRPD 15}. Des études récentes ont montré que les niveaux d’agents pathogènes responsables des infections associés à la carie dentaire, tels que Streptococcus^{mutans 16}, ainsi que ceux de Staphylococcus aureus¹⁷, peuvent augmenter significativement après la pose des dentiers. En plus de servir d’indicateur de l’état de la muqueuse buccale, les modifications du niveau de bactéries résultant de l’utilisation des DPR peuvent également entraîner le développement de maladies dentaires dans les dents^{restantes 18}. Ainsi, si les patients négligent de maintenir correctement leurs DPR, des conditions anaérobies peuvent se créer sous la base de la prothèse, ce qui peut entraîner une croissance excessive de bactéries pathogènes. Certains types d’agents pathogènes parodontaux peuvent pénétrer dans la circulation sanguine générale par la porte oropharyngée, représentant un facteur de risque considérable pour le développement de diverses maladies systémiques^.

Cependant, il existe encore peu d’études sur les modifications microbiologiques du sillon gingival des dents de cul chez les patients atteints de^DPR 21,22,23,24. Parmi les rares études sur ce sujet, des méthodes conventionnelles pour la détection des agents pathogènes parodontaux, dont le test BANA-ZymeTM et la méthode de la culture, ont été utilisées. Étant donné que la plupart des agents pathogènes parodontaux sont des anaérobies facultatifs, l’utilisation de telles méthodes peut entraîner des difficultés dans leur culture, car dans ce contexte des conditions de haute intensité réductrice et pour lesquelles l’oxygène est toxique sont^{nécessaires 25}. De plus, la littérature dentaire disponible n’a pas encore abordé de manière satisfaisante la relation entre ces agents pathogènes et les différents indices parodontaux dans cette perspective.

Ainsi, pour surmonter les limites de la culture microbienne conventionnelle et améliorer la précision diagnostique, cette étude a utilisé la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) pour quantifier les charges bactériennes du complexe rouge (RCB) dans les dents de culée des porteurs de RPD. Parallèlement, le statut parodontal des dents à piliers et non culaires a été évalué à l’aide d’indices cliniques standardisés. L’étude a également étudié les corrélations entre la charge bactérienne et les paramètres parodontaux afin de mieux élucider l’interaction biologique entre l’utilisation de prothèses et la dysbiose microbienne.

Protocole

Cette étude a inclus 30 patients partiellement édentulés qui ont consulté des soins prothodontiques à la Clinique de Prothèses Dentaires du Centre Clinique Dentaire du Kosovo, entre septembre 2021 et mars 2022. L’approbation éthique a été obtenue du comité d’examen institutionnel (Approbation n° 378/19), et toutes les procédures ont respecté les principes de la Déclaration d’Helsinki. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants.

La taille de l’échantillon a été déterminée sur la base de recherches antérieures, qui indiquent que 11 à 30 participants sont suffisants pour obtenir des résultats significatifs sur les paramètres microbiens et parodontaux chez les porteurs de^{DPR 21,23}. En supposant un test t à deux queues apparié avec un niveau alpha de 0,05, l’analyse de puissance a indiqué qu’une taille d’échantillon de 28 participants fournirait 80 % de puissance pour détecter une différence statistiquement significative de cette ampleur. Pour tenir compte des éventuels abandons, nous avons inscrit 30 participants. De plus, une période de suivi de trois mois a suffi pour observer une augmentation de la charge bactérienne chez ces^{patients 24}.

Les patients éligibles étaient des utilisateurs précoces de prothèses, présentant une dentition naturelle adjacente et antagoniste. Les critères d’exclusion comprenaient : profondeur de sondage >4 mm, statut immunodéprimé (par exemple, chimiothérapie), utilisation d’antibiotiques au cours des 90 derniers jours, tabagisme intensif (>25 cigarettes/jour) et trouble cognitif entravant la compréhension des procédures de DPR.

Tous les participants ont reçu des RPD à agrafe fabriquées avec une structure métallique cobalt-chrome et de la résine acrylique (polyméthacrylate de méthyle). La conception de chaque RPD a été personnalisée en fonction de la classification de l’édentulisme, de la qualité des dorsales résiduelles et des considérations biomécaniques.

Procédure de collecte d’échantillons

La collecte d’échantillons a été réalisée exclusivement sur les dents de culée des prothèses partielles amovibles (DPR) entre les points temporels T0 et T3. Les participants devaient d’abord se gargariser soigneusement avec de l’eau pour éliminer les restes de nourriture. Avant la collecte de l’échantillon, la dent de culée sélectionnée était isolée à l’aide de rouleaux de coton pour maintenir un environnement de travail sec. Deux pointes en papier stériles (n° 35 ; 04 effilées) ont été insérées dans le sillon gingival sur les faces mésiale et distale de la surface buccale de la dent, laissées en place pendant 1 minute. Les points de papier ont ensuite été transférés dans un microtube stérile contenant 1,5 mL de solution saline normale et transportés vers un laboratoire microbiologique désigné. Les échantillons étaient stockés à -20°C jusqu’au processus d’isolation de l’ADN.

Préparation et amplification de l’ADN bactérien :

Le test Parodontoscreen (Table of Materials) a été utilisé pour identifier T. denticola, T. forsythia et P. gingivalis à l’aide de RT-PCR²⁶. Le test comprend : la préparation de l’ADN ; amplification PCR en temps réel utilisant des réactifs spécifiques (un mélange pour l’amplification bactérienne universelle, un mélange pour l’amplification bactérienne opportuniste, et un mélange pour l’amplification de l’ADN génomique humain) ; et l’enregistrement et l’interprétation des résultats d’amplification.

L’extraction d’ADN a été réalisée à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN (Table of Materials), suivant les directives du fabricant afin d’assurer une qualité optimale de l’ADN. Le test utilise une analyse qualitative PCR en temps réel avec un mélange PCR scellé à la paraffine. Ce mélange comprend un contrôle interne pour vérifier la validité de la PCR et un contrôle d’admission d’échantillons (SIC) pour évaluer la qualité de l’extraction et confirmer la suffisance d’ADN pour une amplification précise.

L’amplification par PCR a été réalisée à l’aide de bandes et condensateurs spécialisés, avec des réactifs comprenant la solution de Taq-polymérase, le mélange maître sous la couche de paraffine, un échantillon d’ADN et de l’huile minérale. Le programme PCR comprend les suivants : (i) dénaturation initiale à 80 °C pendant 30 s, (ii) dénaturation à 94 °C pendant 1 min 30 s, (iii) 5 cycles de 30 s à 94 °C (dénaturation), 15 s à 64 °C (liaison et allongement de l’amorce, détection de fluorescence), (iv) 45 cycles de 10 s à 94 °C (dénaturation), 15 s à 64°C (liaison et allongement de l’amorce, détection de fluorescence), (v) 5 s à 94 °C (dénaturation finale).

La détection de fluorescence était effectuée sur les canaux de détection Fam et Hex, à l’exception du tube n° 5, qui contenait le marqueur (où la fluorescence était détectée sur les canaux Fam et Rox). Le processus d’amplification a été réalisé à l’aide de cycleurs thermiques en temps réel (Table of Materials). Le logiciel RealTime de l’instrument (version 7.9) a été utilisé pour l’enregistrement automatique, l’interprétation et l’analyse quantitative des données d’amplification PCR, permettant une estimation précise de la charge des agents pathogènes.

Les charges microbiennes étaient représentées par « Lg (équivalents du génome/échantillon) ». Les résultats ont été présentés dans trois fourchettes dans le rapport du test Parodontoscreen pour chaque patient, basés sur les niveaux de charge bactérienne comme suit : P. gingivalis (normal <5,0 ; modéré ≥5,0 ; sévère >6,0) ; T. forsythie (normale <5,0 ; modérée ≥5,0 ; sévère >5,5) ; et T. denticola (normal <3,5 ; modéré ≥3,5 ; sévère >5,0).

Examen clinique

L’examen clinique comprenait un examen détaillé de l’état parodontal des dents à cul et non cul aux niveaux T0 et T3. L’indice de plaque (PI) a été évalué à l’aide d’une sonde dentaire selon les critères de Silness-Loe (0-3)²⁷. L’affection gingivale a été évaluée en six points sur la surface de la dent à l’aide de l’indice gingival (IG) selon les critères suivants : 0, aucune inflammation ; 1, inflammation légère ; 2, inflammation avec saignement gingival lors du sondage ; 3, inflammation sévère avec possible saignement gingival^{spontané 28}.

La profondeur de sonde () a été mesurée à l’aide de la sonde Williams depuis la marge gingivale jusqu’à l’extrémité de la profondeur de la poche^{clinique 29}. La mobilité dentaire (TM) était déterminée par palpation bimanuelle dans les directions horizontale et verticale, selon les critères³⁰ de Miller.

Tous les participants à l’étude ont reçu un traitement parodontal non chirurgical adéquat avant l’examen clinique, incluant l’ablation de la plaque dentaire et du tartre à l’aide de tartres ultrasoniques. Les sujets ont également été instruits à des procédures d’hygiène bucco-dentaire, telles que le brossage des dents et le nettoyage des dentiers, ainsi que des conseils pour retirer les prothèses la nuit.

Analyse statistique

Les données ont été analysées à l’aide de Microsoft Excel et IBM SPSS Statistics for Windows. Des statistiques descriptives (moyenne, écart-type et plage) ont été calculées pour l’âge, les charges microbiennes et les indices parodontaux, incluant IP, GI , DP et TM. Les changements dans les paramètres cliniques et microbiologiques entre avant (T0) et 3 mois après l’insertion (T3) ont été évalués à l’aide du test de rang signé de Wilcoxon pour des données non paramétriques appariées. Le test exact de Fisher (simulation de Monte Carlo, à double face) a été utilisé pour évaluer des données catégoriques liées à la classification des charges microbiennes. Le coefficient de corrélation de rang (ρ) de Spearman a été utilisé pour évaluer les associations entre les charges microbiennes et les paramètres parodontaux. Une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative pour toutes les analyses.

Résultats

Démographie des participants

Le tableau 1 présente la répartition des paramètres démographiques. Parmi les 30 participants, 16 étaient des hommes (53,3 %) et 14 des femmes (46,7 %). L’âge moyen des participants était de 64,6 ans, avec une fourchette de 48 à 76 ans. Des détails supplémentaires concernant la démographie sociale sont fournis dans le Tableau 1.

Examen clinique

Discussion

Maintenir une hygiène bucco-bucco-dentaire optimale devient de plus en plus difficile avec l’âge, en raison de la diminution de la réactivité immunitaire et des limitations mécaniques imposées par les prothèses telles que les DPR à agrafe fixée. Ces conditions favorisent l’accumulation de biofilms pathogènes, en particulier autour des clouses, qui servent de structures porteuses critiques mais sont également vulnérables à la détérioration parodontale. Cette étude visait à répondre à ces ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes microcentrifuges de 1,5 mL avec verrouillage de sécurité	Biotek	MT1.5/100
Pince dentaire	Bader	17/4021-1
Cycleurs thermiques DTprime en temps réel	ADN-Technologie		Cycleurs thermiques en temps réel
IBM SPSS  ;	IBM Corp	Version 21.0  ;
Microsoft Excel  ;	Microsoft Office 2010
Points papier (n° 35 ; 04 effilés)	DiaDent	MP210-602
Kit de détection PCR en temps réel ParodontoScreen	ADN-Technologie	R1-P808-S3/5EU
Sonde parodontale	MÉDECINE	548/9PT
PREP-GS PLUS	ADN-Technologie	P-003/2EU	Kit d’extraction ADN  ;
Logiciel en temps réel	ADN-Technologie	Version 7.9
Chlorure de sodium 0,9 %	VIOSER