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Injection intrathécalale lombaire de SOD1-ASO pour un ciblage précis du SNC et une efficacité prédictive chez les souris ALS humaines SOD1-G93A

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DOI :

10.3791/69788

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24 février 2026

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1Biogen

Dans cet article

Résumé

Cet article détaille les méthodes d’administration intrathécalienne pour les traitements ciblant le SNC chez les souris adultes, en mettant l’accent sur la précision des protocoles et la possibilité d’injections répétées. Il inclut les résultats d’une étude de validation où les oligonucléotides antisens ont réduit l’expression mutante de SOD1 chez des souris modèles SOD1-SLA, soutenant l’utilité de cette approche dans la recherche préclinique sur les maladies neurodégénératives.

Résumé

L’administration intrathécale (IT) de traitements ciblant le système nerveux central (SNC) offre une voie peu invasive pour l’administration directe de médicaments dans le liquide céphalo-rachidien (LCR), facilitant une spécificité accrue et un engagement accru des cibles. Bien que la cathétérisation IT soit standard pour un accouchement prolongé chez les rats, son application chez la souris est limitée par des contraintes anatomiques et un risque accru de complications liées à la procédure, y compris des lésions et infections vertébrales. Pour surmonter ces limites, nous avons utilisé une technique aiguë de ponction à l’aiguille pour la délivrance de médicaments IT chez des souris adultes, fournissant une alternative reproductible et moins invasive, compatible avec des dosages simples ou répétés. Dans un modèle murin transgénique de sclérose latérale amyotrophique (SLA) portant la mutation SOD1-G93A, nous avons obtenu une administration efficace de l’TI des oligonucléotides antisens (ASO) ciblant le gène SOD1. Cette approche a effectivement réduit l’expression de SOD1 mutante et a significativement amélioré le phénotype de la maladie, comme l’ont démontré des évaluations électrophysiologiques et par biomarqueurs. Ces résultats valident à la fois la méthode d’administration de l’IT et l’efficacité thérapeutique, avec des résultats comparables à l’administration intracérébroventriculaire (ICV). Plus important encore, la technique reflète les procédures utilisées dans les études cliniques humaines, offrant une forte pertinence et utilité translationnelle dans l’évaluation préclinique des interventions dirigées par le SNC. Bien qu’une expertise technique soit nécessaire pour garantir la cohérence et éviter les effets hors cible, cette stratégie de livraison des TI représente une méthodologie robuste, reproductible et cliniquement pertinente pour faire progresser le développement thérapeutique sur des modèles animaux de petite taille.

Introduction

Dans cette étude, nous décrivons un protocole d’injection intrathécale lombaire (IT), le comparons à la délivrance intracéphaventriculaire (ICV), et évaluons les résultats pharmacodynamiques et la tolérabilité afin de guider le développement de traitements ciblant le système nerveux central (SNC). Les thérapies ciblant l’ARN, en particulier les oligonucléotides antisens (ASO), représentent une modalité prometteuse pour les maladies du SNC en permettant la modulation post-transcriptionnelle de l’expression génique. Ces approches sont particulièrement pertinentes pour les troubles neurodégénératifs, où la perte neuronale progressive souligne la nécessité d’interventions précises, localisées et opportunes pour potentiellement modifier la progression de la maladie. Ici, nous comparons directement l’efficacité du protocole d’injection IT à la délivrance de CIV pour les traitements ASO.

Dans des études précliniques, des injections intrathécales lombaires chez des souris adultes (mâles ou femelles, âgés de 30 à 70 jours, poids 13-20 g) ont été utilisées pour injecter des agents pharmacologiques ou des vecteurs biologiques directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) pour le SNCciblant 1,2. Des volumes d’injection de 5 à 10 μL sont généralement administrés lentement pour limiter l’augmentation transitoire de la pression de LCR et le reflux, l’accès intrathécal étant obtenu via l’espace intervertébral L5-L6 1,2. Le succès procédural dépend d’une technique soigneuse pour éviter les lésions neurologiques, l’âge et le poids corporel influençant le volume et la manipulation du LCR. L’utilisation d’aiguilles de calibre fin (par exemple, une aiguille de 27-30 G couplée à une seringue Hamilton de 25 μL) permet une livraison fiable2. Les principaux défis techniques incluent la minimisation des pertes d’espace mort, la prévention des mauvaises injections et fuites de la péridurale, ainsi que la réduction de la variabilité dépendante de l’opérateur pouvant affecter la précision du dosage et la distribution du LCR.

Le développement de thérapies efficaces pour les troubles du SNC reste un défi majeur en raison de la complexité structurelle et de l’hétérogénéité cellulaire du SNC. Ces caractéristiques entravent la délivrance ciblée de médicaments et restreignent la biodistribution à travers de multiples barrières anatomiques et physiologiques, nécessitant des stratégies d’administration spécialisées. Un obstacle majeur provient des barrières physiologiques et anatomiques dans tout le système nerveux central qui restreignent la pénétration des médicaments. Le cerveau et la moelle épinière sont enfermés dans trois couches méningées : la dure-mère, l’arachnoïde et la pia mater, qui, avec la barrière hémato-encéphalique (BBB), offrent une défense redoutable contre les traitements circulants et autres molécules présentes dans le sang. Bien qu’essentielles pour maintenir la stabilité du SNC, ces barrières entravent considérablement la délivrance de grandes molécules hydrophiles telles que les ASO, les anticorps monoclonaux et les vecteursviraux 1,2,3,4. L’administration informatique offre un moyen de contourner ces restrictions en introduisant directement des traitements dans le LCR au sein de l’espace subarachnoïdien. Cette voie de délivrance facilite la distribution des médicaments à travers les compartiments du SNC, favorisant une pénétration tissulaire plus large et permettant ainsi un engagement efficace avec des cibles exprimées dans divers types cellulaires du SNC. Depuis son utilisation initiale par Hylden et Wilcox en 1980 pour la livraison de morphine chezla souris 1, les injections d’IT sont devenues une méthode plus largement utilisée pour délivrer une variété d’agents thérapeutiques, incluant de petites molécules, des biologiques, des vecteurs de thérapie génique et les ASOs 5,6,7,8,9,10.

Les ASO sont des oligonucléotides simples brin conçus chimiquement, conçus pour se lier aux séquences d’ARN complémentaires et moduler l’expression génique par des mécanismes tels que la dégradation médiée par RNase H, la modulation par épissage et l’inhibition stérique de la traduction 11,12,13,14,15. Des améliorations chimiques telles que les modifications de la colonne vertébrale phosphorothioate, les substitutions de 2'-O-méthoxyéthyle (2'-MOE) et les résidus éthyles contraints améliorent leur stabilité, leur affinité de liaison et leur résistance auxnucléases 6. Ces propriétés ont soutenu leur application pour cibler des gènes pathogènes impliqués dans les troubles neurogénétiques. Les traitements basés sur l’ASO administrés par voie intrathécaire ont démontré un bénéfice clinique dans des maladies telles que l’atrophie musculaire spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)12,13,14,15. Par exemple, Nusinersen (Spinraza) augmente l’inclusion de l’exon 7 dans les transcrits SMN2 pour compenser la perte de SMN1 dans SMA 7,14. Des stratégies similaires ciblant les transcripts de huntingtine mutante ont également été explorées dans la maladiede Huntington 12,13. Bien que ces essais aient été arrêtés au débutdu 2016, ils soulignent l’intérêt persistant pour les approches ASO dirigées par le SNC.

La SLA est un trouble neurodégénératif fatal caractérisé par une dégénérescence progressive des neurones moteurs supérieurs et inférieurs. La maladie, qui touche entre 6 et 9 individus pour 100 000 dans le monde et se manifeste à un taux d’environ 2 cas tous les 100 000 années-personne, présente une aggravation progressive de la faiblesse musculaire et de la spasticité, la plupart des patients succombant à une insuffisance respiratoire neuromusculaire dans les 2 à 3 ans suivant l’apparition des symptômesà 17 ans. Bien que la plupart des cas soient sporadiques (SLA), environ 10 % sont familiaux (FALS), offrant des éclairages sur les facteurs génétiques de la maladie. Parmi les gènes les plus étudiés figure la dismutase superoxyde de Cu/Zn 1 (SOD1), qui représente près de 15 à 20 % du fALS, moins de 2 % du sALS, et qui est héritée de manière autosomiquedominante 18. SOD1 code une enzyme antioxydante cytoplasmique qui détoxifie les espèces réactives de l’oxygène en convertissant les radicaux superoxyde en peroxyde d’hydrogène. Les formes mutantes de SOD1, telles que G93A, A4V et H46R, présentent une instabilité conformationnelle, conduisant à l’agrégation des protéines et à un gain de fonction toxique qui contribue au stress oxydatif, aux dysfonctionnements mitochondriaux et à l’excitotoxicité 19,20,21,22,23,24,25 . De plus, la pathologie de la SLA est aggravée par des mécanismes autonomes non cellulaires impliquant la microglie et les astrocytes, qui contribuent à un environnement inflammatoire chronique et à une lésion neuronaleprogressive 26,27,28,29. Le silence de l’expression de SOD1 à l’aide d’ASO représente donc une voie thérapeutique prometteuse pour atténuer la pathogenèse de la maladie.

Le modèle murin transgénique SOD1-G93A (souche Jax # : 004435), qui exprime la forme humaine mutante G93A de SOD1 sous le contrôle du promoteur endogène humain SOD1, reproduit de près les caractéristiques cliniques de la SLA, notamment les déficits moteurs précoces, la neurodégénérescence de la moelle épinière et la survieraccourcie à 30 ans. Des études précliniques antérieures ont montré que l’administration d’ASO spécifiques à SOD1 par un accouchement intraventriculaire soutenu à l’aide de pompes osmotiques chez des rats SOD1-G93A au jour postnatal 65, à une dose quotidienne de 100 μg pendant 28 jours consécutifs, entraîne une suppression significative des niveaux de SOD1, une réduction des réponses neuroinflammatoires, un retard dans l’apparition des signes cliniques et une amélioration des performancesmotrices 31. De plus, la réduction de SOD1 médiée par l’ASO chez les personnes vivant avec SOD1-ALS a été associée à une réduction des niveaux de chaîne légère des neurofilaments (NfL), un biomarqueur sanguin indiquant une lésionaxonale 32. Dans cette étude, nous avons administré des ASO ciblant SOD1 via injection d’IT chez des souris SOD1-G93A et évalué leur impact à travers les relevés moléculaires, électrophysiologiques et biomarqueurs. L’analyse quantitative du tissu de la moelle épinière a révélé des réductions significatives des niveaux d’ARNm SOD1. Les évaluations électrophysiologiques des potentiels d’action musculaires composés (CMAP) ont démontré la préservation de la fonction neuromusculaire. Parallèlement, les niveaux de NfL sérique ont diminué, reflétant une atténuation des lésions neuronales persistantes.

Pour évaluer la répartition spatiale et l’efficacité relative des méthodes alternatives de délivrance du SNC, nous avons inclus un bras comparatif utilisant l’injection intracérébroventriculaire (ICV), où l’agent thérapeutique est introduit dans les ventricules latéraux pour une diffusion via le flux de LCR le long des espaces épendymaux etpérivasculaires 33. En comparant les voies d’administration des TI et des ICV, nous avons cherché à distinguer les différences dans les résultats pharmacodynamiques et le ciblage tissulaire, affinant ainsi les stratégies d’administration des thérapies ASO dirigées par le SNC. De plus, pour évaluer la faisabilité translationnelle, nous avons mené des études indépendantes de tolérabilité impliquant jusqu’à quatre injections d’ITO par animal, espacées de huit semaines. Dans tous les schémas testés, aucun signe évident de détresse ou de morbidité n’a été observé, ce qui soutient la tolérance du dosage d’ASO d’IL dans le contexte de la survie. Ces résultats sont cohérents avec des rapports antérieurs démontrant la tolérabilité des injections intrathécales répétées chezla souris 34.

La pertinence clinique de la livraison ASO de l’TI est renforcée par les récentes approbations réglementaires de tofersen (QALSODY®) pour l’ALS35 associé à SOD1. Des études cliniques ont démontré un engagement robuste de la cible, reflété par des réductions de la protéine SOD1 du LCR, suivies de diminutions des niveaux de la chaîne légère des neurofilaments, un biomarqueur de la lésion neuroaxonale. Bien que le critère principal n’ait pas été atteint lors de l’essai VALOR de phase 3 initial, des analyses intégrées, y compris l’extension ouverte, ont suggéré des bénéfices potentiels d’une initiation plus précocedu traitement 35.

Collectivement, les données présentes démontrent que la livraison informatique des ASO ciblant SOD1 dans le modèle souris SOD1-G93A ALS permet une réduction moléculaire efficace, une amélioration des biomarqueurs et une préservation fonctionnelle avec une tolérabilité favorable. Ces résultats soutiennent la mise en œuvre de l’ASO IT comme une approche rationnelle et cliniquement viable pour les maladies génétiques du SNC et fournissent un cadre préclinique solide pour le développement translationnel continu.

Protocole

Toutes les procédures ici ont été approuvées et menées conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC ainsi qu’aux directives institutionnelles en matière d’hygiène chimique et de biosécurité.
REMARQUE : Réaliser des études sur des souris transgéniques C57BL/6J (JAX #000664) et SOD1-G93A (JAX #004435) hébergées dans des conditions standard (cycle clair/obscur de 12 heures, 22-24 °C, accès ad libitum à la nourriture et à l’eau).

1. Application de SOS chimiquement modifiés pour cibler les SOD1 humains

  1. Utiliser des oligonucléotides antisens validés (ASO) pour cibler spécifiquement les nucléotides 613-629 dans la région non traduite 3' (UTR) du gène SOD1 humain (RefSeq : NM_000454.5)36 : A*GoToG*T*T*T*A*T*ToToA*T*C
  2. Inclure des modifications chimiques validées pour améliorer la stabilité et l’efficacité, en incorporant MOE (2'-O-Methoxyéthyle) (indiqué en police normale), cEt (Éthyle contraint) (italique), ADN (gras), liaisons phosphates (o) et liaisons phosphorothioate (*), comme indiquéprécédemment 36. Le Fichier Supplémentaire 1 présente la chimie ASO avec le code couleur correspondant.
  3. Préparer un ASO témoin non ciblant, sans complémentarité avec les génomes humain ou rongeur, suivant le même schéma de modification pour une utilisation en tant que témoin : C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*AoGoGoA*A

2. Préparation et manipulation des solutions ASO dans des conditions stériles

  1. Reconstituer l’ASO dans le liquide céphalorachidien artificiel stérile (aCSF ; Tableau 1) à une concentration de 10 mg/mL dans des conditions stériles, visant un volume d’injection final de 10 μL (100 μg) par animal.
  2. Mélangez la solution délicatement à l’aide d’une pipette stérile pour maintenir l’intégrité moléculaire, puis faites un vortex léger pendant 5 à 10 secondes pour vous assurer qu’elle est bien mélangée.
  3. Filtrez la solution diluée à travers un filtre à seringue stérile de 0,2 mm pour éliminer les particules et les contaminants.
  4. Aseptiquement aliquote la solution finale dans des tubes stériles de microcentrifuge et conservez-la à 4 °C dans une unité surveillée et à température contrôlée pendant jusqu’à 1 semaine, évitant les cycles de gel-dégel pour maintenir la stabilité.

3. Préparation de la souris avant injection intrathécale

  1. Peser chaque souris jusqu’aux 0,1 g le plus proche à l’aide d’une balance numérique, puis transférer sur un cône nasal et induire une anesthésie avec de l’isoflurane à une concentration de 2 à 2,5 % en oxygène ; Surveillez continuellement la profondeur et confirmez le plan chirurgical par la perte du réflexe pédal.
  2. Préparez un coussin chauffant à commande thermostatique et réglez-le à 37 °C pour soutenir les souris pendant la préparation et la récupération.
  3. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les deux yeux immédiatement après l’induction de l’anesthésie pour éviter la dessiccation cornéenne. Ensuite, placez la souris en position ventral couchée sur la bouillotte pour prévenir l’hypothermie, minimiser le stress physiologique et soutenir les fonctions cardiovasculaires et respiratoires normales tout au long de la procédure.
  4. Administrez la buprénorphine en suspension injectable à libération prolongée (1,3 mg/mL) par voie sous-cutanée à 3,25 mg/kg à l’aide d’une seringue stérile avec une aiguille 25-G, puis injectez 0,05 mL pour 20 g de poids corporel avant l’intervention.
  5. Rasez la région lombaire du milieu du flanc jusqu’à la ceinture pelvienne, puis désinfectez la zone à l’aide de précipitations alternées d’alcool isopropylique et de povidone-iode, répétez trois fois, et laissez le site sécher complètement à l’air.

4. Injection intrathécalienne directe

  1. Après anesthésie et préparation au site chirurgical, déplacez la souris dans une zone d’injection propre et placez-la en position couchée ventrale sur la bouillotte.
  2. Placez la souris dans une position qui arque la colonne vertébrale pour faciliter la palpation et l’injection.
    1. Insérez une spatule courbe sous l’abdomen au niveau thoracique inférieur à lombaire supérieur pour induire une légère flexion de la colonne vertébrale et élargir les espaces intervertébraux lombaires entre la cinquième et la sixième (L5-L6, préférable) ou la quatrième et la cinquième (L4-L5) lamines.
    2. Avancez le biseau de l’aiguille entre les lamines pour entrer dans la citerne lombaire et accéder à l’espace subarachnoïdien tout en évitant le contact direct avec l’os afin d’améliorer la sécurité et la précision de l’injection.
  3. Stabiliser la ceinture pelvienne en saisissant doucement la ceinture pelvienne entre le pouce et l’index d’une main et en palpant la ligne médiane dorsale de l’autre main pour localiser l’espace intervertébral cible entre L4-L5 ou L5-L6.
  4. Alignez une seringue d’insuline stérile de 0,3 mL équipée d’une aiguille de 29 G, 1/2 pouce, perpendiculaire à la surface dorsale de la peau ou à un angle de 70-80°, avec le biseau orienté crâniquement. Avancez l’aiguille jusqu’à ce qu’une légère résistance soit rencontrée en pénétrant la dure-mère, puis continuez dans l’espace intrathécal.
  5. Insérez progressivement jusqu’à ce que la pointe entre dans l’espace intrathécal, confirmé par un réflexe de mouvement de queue indiquant une entrée intrathécale réussie.
  6. Si une résistance significative est rencontrée ou qu’aucun réflexe de mouvement de queue n’est observé, retirez l’aiguille, réidentifiez les repères anatomiques et ajustez le placement de l’aiguille avant de recommencer l’injection. Si la tentative initiale a été effectuée dans l’espace intervertébral L5-L6, effectuez la tentative suivante dans l’espace intervertébral L4-L5.
  7. Injectez lentement 10 μL de solution ASO (plus de 10 s) pour minimiser les variations de pression et éviter le reflux de LCR. L’aiguille peut être maintenue en place pendant 10 secondes supplémentaires après l’injection.
  8. Retirez soigneusement l’aiguille verticalement et en douceur pour éviter les dommages tissulaires et le reflux.
  9. Surveillez la souris en continu pendant la période de récupération, en observant la respiration, la fonction motrice, la posture et tout signe de douleur ou de détresse.
  10. Assurez-vous que la souris retrouve sa mobilité et son comportement normales avant de la remettre dans sa cage d’origine.
  11. Documentez tous les détails procéduraux pertinents, y compris le site d’injection, la dose d’ASO, le volume d’injection, ainsi que toute observation comportementale ou physiologique pendant et après la procédure, conformément aux protocoles IACUC.

5. Surveillance des souris et soutien à la récupération après injection

  1. Placez chaque souris dans un compartiment individuel ou bien espacé au sein d’une chambre de récupération préchauffée maintenue à 37 °C.
  2. Gardez la chambre contrôlée à température pendant la récupération de l’anesthésie pour éviter l’hypothermie.
  3. Surveillez en permanence la fréquence et le schéma respiratoire, la posture et la réactivité aux stimuli tactiles.
  4. Observez la souris jusqu’à ce qu’elle retrouve son réflexe de redressement et fasse preuve de mouvements coordonnés.
  5. Évitez la surpopulation pour assurer une visibilité claire et éviter les interférences.

6. Détermination des critères pour le retour dans la cage d’origine

  1. Confirmez que la souris est stable avec un mouvement spontané coordonné.
  2. Assurez-vous qu’il n’y a aucun signe de détresse, y compris une respiration laborieuse ou irrégulière, des vocalisations ou une absence prolongée de réaction.
  3. Apportez un soutien nutritionnel doux, comme un complément alimentaire en gel nutritionnellement complet, pour aider à maintenir l’hydratation et l’apport calorique avec un minimum d’effort.

7. Réalisation d’observations post-récupération des souris

  1. Vérifiez les comportements normaux tels que l’exploration, le toilettage et les interactions sociales si les souris sont en groupe.
  2. Surveillez en permanence l’apparition de tout signe de récupération anormale, comme une posture inhabituelle, une faiblesse ou une paralysie, une respiration irrégulière ou une diminution de la réactivité, et réévaluez rapidement si ces symptômes surviennent.
  3. Consultez un vétérinaire si la récupération est retardée ou compromise.

8. Injection intra-cérébroventriculaire dans le ventricule latéral utilisant la chirurgie stéréotaxique et les soins postopératoires

REMARQUE : Inclure un bras comparatif utilisant l’injection intra-cérébroventriculaire (ICV) pour évaluer la répartition spatiale et l’efficacité relative, délivrant des ASO dans les ventricules latéraux pour la diffusion médiée par le LCR et la comparaison avec l’administration intrathécale. Effectuer les injections de VCI selon des protocoles standardisés bien établis pour lasouris 37.

  1. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane à une concentration de 2 à 2,5 % d’oxygène pour l’immobilité, puis positionnez-la en couché ventral sur la bouillotte chauffante, puis administrez la buprénorphine en suspension injectable à libération prolongée (1,3 mg/mL de buprénorphine chlorhydrate) par voie sous-cutanée à 3,25 mg/kg à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL avec une aiguille de 25 g à 0,05 mL pour 20 g de poids corporel avant la procédure. Rase le cuir chevelu de la souris avec une tondeuse.
  2. Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous anesthésie. Maintenez un champ aseptique stérile tout au long de la chirurgie ICV. N’utilisez que des instruments stériles et manipulez-les avec précaution pour éviter tout contact avec des surfaces non stériles.
  3. Fixez la souris dans un cadre stéréotaxique avec une console d’affichage numérique en position allongée standard. Placez les dents de devant dans la barre dentaire de l’adaptateur de souris pour immobiliser la tête, puis fixez l’adaptateur avec les tubes respiratoires d’inhalation et d’extraction délivrant de l’isoflurane. Insérez les pare-oreilles dans les oreilles et serrez les vis pour bien stabiliser la tête.
  4. Désinfectez la zone à l’aide de prélèvements alternés d’alcool isopropylique et de povidone-iode, répétés trois fois, puis effectuez une incision médiane avec un scalpel stérile pour exposer le crâne. Utilisez une pointe en coton stérile pour retirer les tissus mous et assurez-vous que la bregma soit bien visible.
  5. Marque la brème sur le crâne. Placez la seringue contenant l’ASO avec l’aiguille (26-G, 26s/2"/2, pointe) juste au-dessus de la bregma. Alignez l’aiguille sur les coordonnées cibles : AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm à partir de la surface du crâne. Marque le crâne aux coordonnées AP et ML.
  6. Créez un trou de meule aux coordonnées indiquées, puis utilisez un cadre stéréotaxique pour abaisser l’aiguille de la seringue à une profondeur de -3 mm à partir de la surface du crâne. Injecter la solution à un débit de 10 μL/min jusqu’à ce qu’un volume total de 10 μL soit délivré. Après avoir terminé l’injection, maintenez l’aiguille en place pendant 4 minutes, puis retirez-la lentement pour minimiser le reflux.
  7. Suture l’incision du cuir chevelu, placez la souris dans une chambre de récupération préchauffée à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée, puis ramenez-la dans la cage après avoir confirmé la stabilité. Fournir un complément alimentaire en gel nutritionnellement complet et surveiller en permanence les signes d’une récupération anormale, tels que posture inhabituelle, faiblesse ou paralysie, respiration irrégulière ou diminution de la réactivité ; Réévaluez rapidement si l’un de ces symptômes apparaît.

9. Évaluations électrophysiologiques des potentiels d’action des muscles composés (CMAP)

  1. Assurez-vous que les expérimentateurs soient aveugles à la fois sur le génotype et le groupe de traitement de chaque souris afin d’éliminer les biais lors de la collecte et de l’analyse des données.
  2. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane pour l’immobilité et le confort, et maintenez la température corporelle à 37 °C.
  3. Confirmez une anesthésie adéquate en veillant à la perte du réflexe pédal.
  4. Utilisez des électrodes à aiguille monopolaire jetables de 28 G pour la stimulation et l’enregistrement. Insérez l’électrode d’enregistrement de 1 mm dans le muscle tibial antérieur.
  5. Stimulez le nerf sciatique près de l’encoche sciatique à l’aide d’impulsions monophasiques à onde carrée de 0,1 ms délivrées tous les 2 s, à partir de 1,0 mA et augmentant par incréments de 0,5 mA jusqu’à obtenir une réponse supramaximale (typiquement 1,5-3,5 mA).
  6. Une fois le seuil supramaximal déterminé, enregistrer les réponses CMAP à 0,5 mA au-dessus de ce seuil. Mesurez l’amplitude CMAP (pic à pic) à 0,8 ms après le stimulus pour exclure la latence et moyennez les amplitudes des jambes gauche et droite pour chaque souris.

10. Mesure des taux sériques de pNFH

  1. Prélever 100 μL de sang total par ponction veineuse faciale à l’aide de tubes capillaires contenant un activateur de caillots et un gel de séparation sérique à des moments déterminés.
  2. Centrifugez des échantillons sanguins à 2000 g pendant 10 minutes à 4 °C pour isoler le sérum.
  3. Quantifier les niveaux de chaîne lourde du neurofilament phosphorylé sérique (pNFH) à l’aide de réactifs immuno-essais validés pour la mesure de la pNFH dans des échantillons biologiques à l’aide d’un analyseur immunofluidique microfluidique entièrement automatisé à base de cartouche.

11. Isolement de l’ARN et réalisation de RT-qPCR

  1. Pulvériser les tissus de la moelle épinière cervicale/thoracique de la souris à l’aide d’une bille en acier de 6 mm dans un moulin à billes oscillatoires cryogéniques programmables à haute énergie pour la pulvérisation par échantillon à 1 000-1 200 coups par minute pendant 30 à 40 secondes.
  2. Homogénéisez le tissu pulvérisé (15 mg) à l’aide de billes céramiques de 2,8 mm dans un réactif d’extraction à base de thiocyanate de Phénol-guanidinium de 700 μL à l’aide d’un homogénéiseur mécanique programmable à billes à haute vitesse à 5,62 m/s pendant deux cycles de 30 s.
  3. Extraire l’ARN total à l’aide du traitement DNase en colonne, en suivant les instructions du fabricant.
  4. Synthétiser l’ADNc à l’aide d’un système de réactif de transcription inverse à haute capacité pour la synthèse de l’ADNc.
  5. Pour la détection de qPCR, concevez des ensembles d’amorces/sondes personnalisés pour détecter le gène d’intérêt ciblant l’exon 4 du gène SOD1 humain :
    amorce avant (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    amorce inversée (5′-ATGATGCAATGGTCTCTCCTGAGA-3′)
    Sonde (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Utilisez le GAPDH de la souris (ID de test TaqMan : Mm99999915_g1) comme gène de ménage.
  7. Effectuer la qPCR sur un instrument de PCR quantitative en temps réel (qPCR) à haut débit utilisant 20 ng d’ADNc par réaction, un mélange maître qPCR basé sur sonde à cycle rapide, des amorces spécifiques à chaque gène, et des sondes d’hydrolyse marquées fluorescentement pour la détection des transcrits de maintien (VIC/MGB) et cibles (FAM/MGB).

12. Analyse statistique des données

  1. Présentez les données issues des mesures dans la vie (CMAP), de la pNFH sérique et de l’analyse d’expression génique sous forme de moyenne ± écart-type (SD).
  2. Évaluer la signification statistique entre moyennes de groupe à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle, suivie du test de comparaisons multiples de Tukey, en considérant p < 0,05 comme statistiquement significatif.
  3. Utilisez un logiciel d’analyse statistique approprié pour générer des graphiques et effectuer toutes les analyses, conformément à celles menées dans l’étude.

Résultats

Pour caractériser rigoureusement la précision et l’efficacité de l’administration intrathécalienne (IT) chez les souris adultes, nous avons d’abord mené des expériences fondamentales de validation utilisant le colorant bleu Evans (0,5 %) comme traceur visuel du flux de LCR et de la perméation tissulaire. Les souris adultes sauvages de type C57BL/6J (souche #000664 ; poids 25-30g) ont été anesthésiées avec de l’isoflurane (2-2,5 %) en oxygène pour éliminer les artefacts de mouvement, et la région lombaire a été préparée dans des conditions aseptiques. Les injections de TI ont été réalisées par ponction lombaire dans l’espace sous-arachnoïdien à des doses croissantes individuelles de 20 μL, 30 μL et 50 μL afin d’évaluer la dose/volume et la relation intensité de coloration. Le bon placement de l’aiguille a été confirmé en observant un mouvement de queue ou une résistance négative lors de l’injection.

Dans les 5 minutes suivant l’administration du colorant, les souris ont été perfusées transcardiquement avec une solution saline tamponnée phosphate froide (PBS) pour éliminer les résidus de colorant dans la vasculature. Les moelles épinières ont ensuite été délicatement extraites et photographiées sous un éclairage standard sur un fond neutre. L’inspection visuelle a révélé une distribution constante et uniforme du bleu d’Evans dorsale à ventrale chez toutes les souris ayant reçu du colorant. Des volumes d’injection plus élevés étaient corrélés à une saturation accrue du colorant sur l’axe rostrocaudal, bien que même la souris injectée avec un volume de 20 μL ait également montré une coloration robuste. En revanche, les souris qui n’ont pas reçu de colorant bleu d’Evans (groupe témoin injecté avec du sérum stérile) n’ont montré aucune coloration visible ni coloration de fond dans le tissu de la moelle épinière (Figure 1). Ces résultats démontrent que les injections d’ITO chez la souris permettent une délivrance rapide et reproductible de soluté le long de la moelle épinière. Les limites de ces expériences incluent l’absence d’évaluation quantitative de la distribution des colorants et l’absence d’analyse de la distribution des colorants au volume d’injection de 10 μL utilisé pour l’administration de l’ASO. Cependant, la quantification a été réalisée lors de mesures ultérieures d’engagement de cible au niveau d’expression génique chez des souris humaines SOD1-G93A à l’aide d’une analyse d’expression génique spécifique à SOD1 humaine. Le volume d’injection de 10 μL utilisé dans les expériences ultérieures pour l’administration d’ASO a été sélectionné pour garantir un dosage sûr et bien toléré chez la souris et devrait fournir une exposition adéquate au SNC selon les étudesantérieures 38.

En nous appuyant sur cette validation anatomique, nous avons ensuite évalué la pertinence fonctionnelle de la délivrance des TI en utilisant des ASO ciblant SOD1 mutant, une stratégie thérapeutique validée dans les modèles SOD1-SLA. Les souris transgéniques SOD1-G93A hémisygotes, porteuses du gène mutant humain SOD1 , présentent une dégénérescence prévisible des motoneurones et un déclin neuromusculaire, ce qui en fait un modèle préclinique établi. À 5 semaines, avant l’apparition des symptômes, les souris recevaient un seul bolus IT d’un ASO spécifique SOD1 à une concentration de 100 μg dans 10 μL. Cette dose a été sélectionnée sur la base d’études d’optimisation antérieures menées par l’administration de VCI chez des souris, comme rapporté par McCampbell et al. (2018)36. Pour comparer l’efficacité entre l’IT et la délivrance par ICV, un groupe distinct a reçu des injections ICV de la même dose d’ASO en utilisant une administration stéréotaxique. Les contrôles recevaient un ASO inactif (contrôle non-ciblant) via la voie IT.

Cinq semaines après le traitement (à 10 semaines), les souris ont subi un test de potentiel d’action musculaire composé (CMAP) sous anesthésie légère à l’isoflurane. Les enregistrements CMAP sur la musculature des membres postérieurs, obtenus par des protocoles standardisés de stimulation du nerf sciatique, ont révélé une préservation significative de l’amplitude chez les groupes traités par TI et ICV par rapport aux contrôles inactifs traités par ASO (p < 0,0001 via ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey). Il est important de noter que la préservation de l’amplitude n’a pas différé significativement entre les méthodes de délivrance de l’IT et de l’ICV (p > 0,05), indiquant une protection neuromusculaire comparable (Figure 2A).

Pour évaluer les biomarqueurs systémiques de l’intégrité neuronale, les niveaux sériques de chaîne lourde de neurofilaments phosphorylés (pNFH) ont été mesurés à l’aide d’un test d’électrochemiluminescence hautement sensible. Les échantillons sanguins prélevés au délai de 5 semaines après injection ont montré une réduction de >40 % de la concentration de pNFH chez les souris traitées par ASO par rapport aux témoins traités par véhicule (p < 0,0001), sans différence significative observée entre les modalités de TI et de VCI (Figure 2B). La réponse uniforme des biomarqueurs moléculaires corrobore les données électrophysiologiques, suggérant que la délivrance des TI atténue efficacement les processus neurodégénératifs dans ce modèle ALS.

Pour évaluer l’engagement de la cible SOD1-ASO au niveau moléculaire, nous avons réalisé la transcription inversée par PCR quantitative (RT-qPCR) sur des tissus disséqués de la moelle épinière cervicale et thoracique. L’ARN total a été extrait à l’aide d’un protocole à colonnes, assurant une haute pureté (A260/A280>1,8), suivi d’une synthèse d’ADNc avec amorçage aléatoire d’hexamères. L’amplification quantitative par PCR ciblant les transcripts humains SOD1, normalisée en GAPDH, a révélé une baisse moyenne de 60 % après la livraison de l’informatique et de 35 % après la livraison de l’ICV, deux mesures significatives par rapport aux contrôles ASO inactifs (p < 0,0001 pour les deux). La comparaison directe entre les voies de délivrance a montré un knockdown significativement plus important avec la délivrance TI (p < 0,0001), indiquant un engagement cible plus efficace dans la moelle épinière par accès direct à la colonne vertébrale (Figure 3). D’autres études sont nécessaires pour évaluer l’engagement des cibles dans d’autres régions du SNC.

Collectivement, ces données complètes offrent une validation convaincante des injections de TI comme une technique précise, reproductible et peu invasive pour délivrer des ASO au système nerveux central (SNC) dans des modèles murins. L’administration informatique a démontré une efficacité thérapeutique comparable à celle de la livraison de la VCI sur un large éventail de critères de jugement, incluant la préservation soutenue de la fonction neurologique (CMAP), la normalisation des biomarqueurs pertinents pour la maladie (pNFH) et la réduction moléculaire robuste des transcrits humains de SOD1 dans les régions ciblées du SNC. Ces résultats soulignent la polyvalence de la prestation des TI comme voie cliniquement transférable pour les traitements ASO ciblant le SNC, offrant une efficacité équivalente à la VCI tout en maintenant la simplicité des procédures et une réduction de l’invasion. Ainsi, la TI et la mise en relation avec ICV sont des approches tout aussi viables pour des interventions ciblant le SNC, offrant une flexibilité en contexte préclinique selon l’accessibilité anatomique, la faisabilité procédurale et le contexte thérapeutique. Cela positionne la prestation informatique comme une plateforme prometteuse pour les futures thérapies ciblant le SNC. Pour soutenir les efforts translationnels, nous suggérons de mener d’autres études précliniques afin d’évaluer la distribution pharmacocinétique dans le liquide céphalo-rachidien, les différentes régions du SNC et l’absorption des cellules cibles, en utilisant des techniques telles que l’hybridation in situ par fluorescence ou l’immunofluorescence.

Figure 1
Figure 1 : Visualisation de la distribution du colorant bleu d’Evans après injection intrathécale chez des souris adultes. Le colorant bleu d’Evans (0,5 %) a été administré par injection directe intrathécale (IT) chez des souris adultes afin d’évaluer qualitativement sa distribution dans la moelle épinière. Trois volumes de colorants différents de 20 μL, 30 μL et 50 μL ont été administrés en groupes expérimentaux distincts (n = 1 souris par condition de volume). Après injection, des moelles épinières ont été prélevées et rincées afin d’évaluer la pénétration du colorant selon l’intensité de la coloration le long du tissu. Les images du tissu de la moelle épinière montrent l’étendue de dispersion du colorant associée à chaque volume d’injection, démontrant une augmentation dépendante du volume de la couverture et de l’intensité de coloration dans toute la moelle épinière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2
Figure 2 : La thérapie par oligonucléotides antisens ciblant SOD1 restaure la fonction motrice et réduit les niveaux pathologiques de neurofilaments chez la souris. Les souris transgéniques adultes SOD1-G93A ont reçu soit une dose unique d’oligonucléotide antisens actif ciblant SOD1 (SOD1-ASO) par injection intrathécale (IT) ou intracérébroventriculaire (ICV) à l’âge de 5 semaines, soit un ASO témoin inactif via injection IT. L’impact thérapeutique a été évalué à 10 semaines, correspondant à 5 semaines après le traitement. (A) Des enregistrements du potentiel d’action musculaire composé (CMAP) ont été réalisés pour évaluer la fonction neuromusculaire chez les animaux traités. Les groupes traités par SOD1-ASO (n = 5 - 6 par groupe) ont montré un renversement du déclin du CMAP par rapport au groupe témoin, indiquant une récupération fonctionnelle. (B) Les niveaux périphériques de la chaîne lourde des neurofilaments phosphorylés (pNFH), un biomarqueur de la neurodégénérescence, ont été quantifiés à partir du sérum collecté à la semaine 10 (n = 5 - 8 par groupe). Le traitement par SOD1-ASO a conduit à une réduction significative des niveaux circulants de pNFH par rapport au témoin, suggérant une atténuation des lésions neuronales associées à la maladie. Toutes les données sont présentées en moyenne ± DS. La signification statistique a été déterminée par analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du test de comparaison multiple de Tukey, avec des valeurs p ≤ 0,0001 indiquant des différences robustes entre les groupes traités. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3
Figure 3 : L’administration de SOD1-ASO supprime significativement l’expression de l’ARNm de SOD1 humain dans la moelle épinière transgénique SOD1-G93A de la souris. Pour évaluer l’efficacité de ciblage de l’oligonucléotide antisens (SOD1-ASO) ciblant SOD1 administré par injection intrathécale (IT) ou intracérébroventriculaire (ICV), une coupe cervico-thoracique du tissu de la moelle épinière provenant de souris transgéniques SOD1-G93A euthanasiées à 10 semaines (5 semaines après administration) a été analysée pour l’expression humaine d’ARNm SOD1 à l’aide de la réaction en chaîne quantitative par transcription inverse (RT-qPCR). Les niveaux de transcripts de SOD1 chez l’humain ont été quantifiés et normalisés par rapport à l’expression dans le groupe inactif traité par ASO. La figure montre le changement de pli dans l’ARNm de SOD1 humain (normalisé en GAPDH) pour chaque groupe traité (n = 5-7 souris par groupe), mettant en lumière une régulation à la baisse substantielle en réponse à l’administration de SOD1-ASO. Les données sont présentées en moyenne ± DS. Les différences statistiques entre les groupes ont été déterminées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test de comparaison multiple de Tukey, avec des valeurs p ≤ 0,0001 indiquant des différences robustes entre les groupes traités. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

ComposantFWQuantité d’addition (par L ou kg)Unités
Phosphate de sodium Monobase Dihydrate0.034g
Phosphate de sodium dibase anhydre1420.111g
Chlorure de sodium58.448.766g
Chlorure de potassium74.560.224g
Chlorure de calcium dihydraté147.020.206g
Chlorure de magnésium hexahydraté0.163g
Eau (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tableau 1 : composition de l’aCSF.

Figure supplémentaire 1 : Positionnement de la souris pour l’injection intrathécalale lombaire. Une spatule courbée ou scoopula placée sous l’abdomen fléchit la colonne vertébrale, élargissant l’espace intervertébral. L’injection cible le niveau L4-L5 ou L5-L6, avec un alignement correct le long de l’axe médian de la colonne vertébrale comme illustré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : séquence ASO et chimie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La technique d’injection intrathécale directe (IT) présentée ici représente une méthode minimalement invasive mais très efficace pour délivrer des agents thérapeutiques dans le système nerveux central (SNC), en particulier chez les petits modèles de rongeurs comme les souris. Cette procédure à l’aveugle est techniquement complexe mais s’est avérée à la fois reproductible et cliniquement pertinente lorsqu’elle est réalisée par un injecteur formé. Cette méthode utilise une anatomie précise et une technique efficace pour fournir un accès rapide au SNC sans nécessité de cathétérisme, une simplification importante avec des avantages substantiels pour l’expansion des études précliniques ; Cependant, sa pertinence translationnelle bénéficiera d’une évaluation quantitative supplémentaire et d’une validation méthodologiquestandardisée 5,8,10.

Une injection informatique réussie dépend de plusieurs étapes clés. Une préparation méticuleuse des animaux est essentielle : l’anesthésie est d’abord induite dans une chambre et maintenue avec un cône nasal, puis rase la région lombaire et administre des analgésiques pour assurer le confort de l’animal. Le positionnement correct de la souris est obtenu en plaçant une spatule courbée sous l’abdomen, en fléchissant la colonne vertébrale pour élargir l’espace intervertébral (Figure supplémentaire 1). L’objectif de l’injection intrathécale décrite ici est de positionner le biseau de l’aiguille dans la citerne lombaire en la faisant avancer entre les lames au niveau vertébral approprié. Un ciblage précis de l’espace intervertébral entre les lames L4 et L5 ou, de préférence, entre les lames L5 et L6, est essentiel pour accéder à l’espace sous-arachnoïdien 5,10. L’espace sous-arachnoïdien, également appelé espace intrathécal, se situe entre l’arachnoïde et la pia matère39. Comme la moelle épinière est plus courte que le canal vertébral, les segments caudaux sont situés plus rostralement par rapport à leurs niveaux vertébraux correspondants. Pour éviter toute ambiguïté, les sites d’injection sont désignés par l’espace intervertébral plutôt que par le niveau de la moelle épinière. Notamment, une variabilité importante existe dans la segmentation vertébrale lombaire chez la souris, tant au sein des souches que sur40. L’injection doit être réalisée le long de la ligne médiane de la colonne vertébrale afin d’éviter une déviation latérale, qui peut entraîner une parésie du membre postérieur ou, dans les cas graves, une paralysie due à une lésion de la moelle épinière. Lorsqu’elle est réalisée au bon emplacement anatomique, le risque de lésion directe de la moelle épinière est minime. Cependant, un faible risque d’irritation ou de lésions de la racine nerveuse subsiste, soulignant l’importance d’une formation adéquate de l’opérateur et d’une maîtrise des procédures pour minimiser les conséquences négatives. Le réflexe de mouvement de queue sert d’indicateur utile du placement réussi de l’aiguille, permettant à l’injecteur d’évaluer la profondeur et d’éviter une pénétration superficielle ou excessivement profonde. Cette technique demande de la pratique pour être maîtrisée, nécessitant un contrôle constant de la profondeur, de l’angle et du volume d’injection afin d’éviter le reflux et les fuites dans les tissus environnants. Bien que nous recommandions de maintenir le volume d’injection ≤10 μL, nous avons évalué jusqu’à 20 μL sans effets indésirables. Des études antérieures ont identifié un volume d’injection intrathécale de 10 μL comme optimal pour l’administrationdu médicament 38. Bien que cela représente 25 à 30 % du volume total de LCR chez lessouris 41,42, le volume maximal tolérable d’injection intrathécale chez les souris adultes a été rapporté à 30 μL10. Des volumes d’injection dépassant les limites recommandées peuvent perturber la dynamique du liquide céphalo-rachidien (LCR), entraînant une altération de la pression du LCR et un risque accru d’effets indésirables. Le volume total de LCR chez la souris est estimé entre 35 et 40 μL et se retourne 12 à 13 fois parjour 41,42, correspondant à un renouvellement complet environ toutes les 1,8 h42,43. Compte tenu du renouvellement rapide du LCR et des observations empiriques ainsi que des études antérieures démontrant l’utilisation sûre de volumes d’injection intrathécales jusqu’à 20-30 μL sans complications, un volume d’injection de 10 μL n’est pas attendu à produire des effetsindésirables 10,44.

La scalabilité est un avantage important de cette technique. Une fois maîtrisés, les injecteurs formés peuvent traiter 10 à 12 animaux par heure, facilitant ainsi des études précliniques plus larges sans les contraintes logistiques de l’implantation de cathéter ou d’approches chirurgicales plus invasives. La procédure évite l’instrumentation complexe, réduit le stress animal et raccourcit les temps de récupération par rapport au cathétérisme chronique, ce qui la rend adaptée aux études longitudinales nécessitant des doses répétées. Pour simuler les schémas de dosage clinique, nous avons validé des administrations informatiques en série chez des souris, administrant jusqu’à quatre doses espacées de huit semaines. Ces injections étaient bien tolérées, sans signes de détresse, de changements de comportement ou de maladie, conformément à des études antérieures n’ayant signalé aucun changement significatif dans la dynamique du LCR ou l’architecture de la moelle épinière après plusieurs traitementsTI 34,45. Ainsi, nos études confirment qu’il est possible de poser des doses répétées d’IT, à intervalles appropriés, en accord avec les paradigmes de traitement humain où un engagement soutenu des cibles est nécessaire pour un bénéfice thérapeutique. D’après notre expérience, ces injections répétées d’ITi ont été réalisées avec succès sur une large tranche d’âge allant de 5 à 29 semaines. Bien que l’augmentation de l’âge et de la masse corporelle puisse légèrement modifier l’accessibilité de la moelle épinière grâce à une plus grande masse sous-cutanée, une administration efficace reste possible avec un opérateur compétent, compétent dans la technique et familier avec la sensation du placement des aiguilles. Nous notons cependant que plusieurs facteurs au-delà du site d’injection et du volume de bolus, notamment la vitesse d’injection et les propriétés physiques de la solution injectée, telles que la densité par rapport au LCR, peuvent influencer de manière substantielle la distribution des solutés dans le SNC. Bien que ces paramètres n’aient pas été directement mesurés ou manipulés dans la présente étude, des travaux récents de Linninger et al. (2023) démontrent, grâce à un modèle pharmacocinétique mécanistique, que ces facteurs affectent significativement la biodistribution intrathécalienne des oligonucléotides antisens (ASO) et la cibletissulaire 46. En conséquence, nous reconnaissons cela comme une limitation de notre étude et mettons en avant la vitesse d’injection ainsi que les propriétés de la solution comme variables importantes pour des recherches futures afin d’optimiser la livraison du SNC et la pertinence translationnelle. Ensemble, ces résultats soulignent la fiabilité et la faisabilité du dosage répété d’IT dans les paradigmes précliniques multidoses, soutenant son utilisation pour l’engagement soutenu des cibles et la modélisation translationnelle des schémas thérapeutiques humains.

L’approche informatique offre également une flexibilité dans les tests thérapeutiques. Il couvre un large éventail de modalités, incluant les ASO, les petites molécules, les peptides et les vecteurs viraux, permettant une évaluation directe des interventions ciblant le SNC. La capacité à délivrer des volumes précis et contrôlés de traitements dans la citerne lombaire garantit une moelle épinière efficace et une exposition plus large au SNC tout en limitant le débordement systémique. Le réflexe tail-flick et d’autres indices procéduraux permettent une vérification en temps réel de la réussite de la livraison intrathécale, améliorant encore la reproductibilité et réduisant les taux d’échecexpérimentaux 5,6,8,47.

Des études antérieures sur des souris SOD1-G93A ont montré que la pathologie de la maladie affecte de façon marquante la moelle épinière, en particulier la région lombaire, plus que dans lecortex 29,48. Par conséquent, cette technique est particulièrement pertinente dans le contexte de SOD1-ALS, une forme génétique de SLA causée par des mutations du gène superoxyde dismutase 1 (SOD1). Ces mutations produisent des agrégats de protéines SOD1 mal repliés qui entraînent un gain toxique de fonction au sein des motoneurones, entraînant un déclin neuromusculaireprogressif 49,50. Dans cette étude, nous avons utilisé des ASO ciblant SOD1 pour démontrer un engagement réussi avec l’ARNm cible et la récupération fonctionnelle. L’analyse RT-qPCR a révélé une suppression significative des transcrits humains de SOD1 dans la moelle épinière après administration de l’IT, tandis que les enregistrements CMAP ont indiqué une inversion du dysfonctionnement des neurones moteurs. De plus, l’analyse sérique a montré une diminution des niveaux de chaîne lourde de neurofilaments phosphorylés (pNFH), un biomarqueur de la neurodégénérescence, renforçant l’efficacité de la stratégie thérapeutique.

La pertinence clinique de ce modèle est soulignée par la récente approbation par la FDA du tofersen (QALSODY®), un ASO conçu pour cibler l’ARNm SOD1 dans le traitement de SOD1-ALS35. Le Tofersen est administré par voie intrathétique chez les personnes vivant avec SOD1-SLA et a montré une activité pharmacodynamique claire, incluant des réductions des niveaux totaux de protéines SOD1 du LCR (marqueur indirect d’engagement de la cible) et du NfL plasmatique (marqueur de lésions axonales et de neurodégénérescence). Dans les analyses intégrées de l’étude de phase 3 VALOR et de son OLE, l’initiation plus précoce du traitement par tofersène a été associée à une réduction du déclin des mesures de fonction clinique, de force et de qualité de vie, ainsi qu’à une diminution du risque d’événements équivalents àla mort 35. Ces données valident la voie intrathécale comme une voie puissante pour la thérapie ASO ciblée sur le SNC et apportent un poids translationnel important aux études précliniques utilisant des stratégies d’administration similaires.

En plus de son utilité dans la SLA, la voie TI a démontré son succès dans l’atrophie musculaire spinale (SMA)14,51,52, où l’ASO Nusinersen (Spinraza®) administré par TI a été la première thérapieapprouvée 14,51,52. Les injections de TI contournent la barrière hémato-encéphalique et permettent une biodistribution étendue duSNC 53, qui est cruciale pour les maladies caractérisées par une pathologie neuronale diffuse. Bien que la répétition des dosages pose des défis logistiques et de tolérabilité, les avancées dans les techniques de formulation et d’administration continuent de rendre l’administration informatique plus viable pour un traitement à long terme.

L’administration informatique offre une plus grande pertinence translationnelle pour la pratique clinique humaine que les injections de VCI. Les injections de VCI et d’ITA chez les souris adultes diffèrent principalement par leur localisation cible dans le SNC ainsi que par la distribution et les effets résultants de la substance administrée. Les injections de VCI délivrent directement des substances dans le liquide céphalorachidien (LCR) au sein des ventricules latéraux du cerveau, ciblant principalement les sites supraspinaux. En revanche, les injections de TI injectent des substances dans le LCR à l’intérieur de l’espace sous-arachnoïdien spinal, ciblant principalement la moelle épinière. Bien que les deux méthodes contournent la barrière hémato-encéphalique et permettent une délivrance directe du SNC, l’administration de l’TI peut entraîner une durée d’action54 plus longue pour certains composés et entraîne généralement une transduction plus forte de la moelle épinière, tandis que la VCI peut atteindre des concentrations locales élevées dans les régions cérébrales adjacentes au ventriculelatéral 54. Cependant, il est important de noter que les composés administrés dans le LCR spinal peuvent atteindre le cerveau, bien que le taux de transport soit trèslent 1. Ces différences se reflètent également dans les risques procéduraux. Les injections ICV présentent un risque de contamination plus élevé si la stérilité est compromise, tandis que les injections IT, bien que non sans risque, présentent moins de vulnérabilités liées aux dispositifs. Après l’intervention, les injections de GI peuvent provoquer un inconfort transitoire ou des réactions liées aux membres postérieurs, tandis que les injections de VCI sont associées à un inconfort moins immédiat, bien qu’une irritation crânienne locale reste possible.

Les applications futures de cette technique vont au-delà des études précliniques actuelles. La livraison des TI peut être exploitée pour évaluer des thérapies de nouvelle génération ciblant le SNC, y compris les outils d’édition génétique (par exemple, les systèmes CRISPR/Cas), les modalités d’interférence ARN et les thérapies géniques basées sur des vecteurs viraux. Cette approche est adaptable aux thérapies combinées ciblant plusieurs voies du SNC, permettant une évaluation en temps réel des interactionspharmacodynamiques 55,56. De plus, l’administration informatique peut être intégrée à des modalités d’imagerie pour suivre la distribution et l’engagement cible in vivo, accélérant ainsi les pipelines translationnels. La technique offre également une plateforme pour étudier les stratégies de médecine de précision à travers des modèles murins génétiquement définis de maladies neurologiques, facilitant la découverte de biomarqueurs, les évaluations fonctionnelles longitudinales et les évaluations de sécurité avant la traduction clinique.

En conclusion, la technique d’injection directe de TI lombaire utilisant l’anesthésie isoflurane représente une méthode minimalement invasive, rapide et cliniquement tradusible pour délivrer des traitements dans le SNC murin. Son application réussie dans les modèles SOD1-ALS et sa compatibilité avec le dosage en série constituent une base solide pour un déploiement plus large dans la recherche en neurosciences translationnelles. À mesure que le domaine progresse avec un accent croissant sur la modulation génique du SNC, les thérapies ciblant l’ARN et la médecine de précision, la voie informatique restera une stratégie clé d’administration de médicaments, reliant modèles précliniques au succès clinique.

Déclarations de divulgation

SM et S-C L sont actuellement employés de Biogen, Inc., tandis que TC, DF, YL, JD et MZ sont d’anciens employés de la société. Les oligonucléotides antisens évoqués dans cet article ont été fournis aux auteurs par Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) est un produit développé conjointement par Biogen et Ionis Pharmaceuticals.

Remerciements

Nous tenons à remercier Ionis Pharmaceuticals pour la fourniture des ASO décrits dans l’article. Nous remercions Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz et David Koske de Biogen pour leurs contributions expertes, qui ont considérablement enrichi le manuscrit grâce à leurs révisions substantielles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,3 mL 29 G, 1/2 pouce d’insuline pour injection d’ITSmiths Medical4429-3
Meule de forage stérile de 0,5 mm de diamètreFine Science Tools (FST), ou équivalent1900705
Suture monofilament 5-0 ProleneEthicon  ;8870H  ;
Écouvillons d’alcoolDynarex1203
Écouvillons d’alcoolDynarex1203
Analgésique - Buprénorphine à libération prolongéeOrdonnance obligatoire
Clipper pour animauxWahl08787-450A
Kit de transcription inverse à haute capacité d’ADN cDNA Applied BiosystemsFisher Scientific43-688-14
Homogénéiseur 24 de rupteur de perlesOmni International, Inc.19-070
Prise de sang et tubes de séparation sériqueBeckton Dickinson (BD)365967
Chlorure de calcium dihydratéJT Baker1335
Pompe à seringue numériqueAppareil de Harvard70-4507
Système d’immunotest automatisé EllaR& Systèmes D600-100
Pommade oculaire - PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Stérilisateur à sec Germinator 500Braintree Scientific, ou équivalentGER 5287-120V
Seringue Hamilton avec aiguille (26s/2"/2 (style pointu)Hamilton8030026s/2"/2 :  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 26 secondes : 26 P ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 2" de longueur ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 2 : style de pointe
Mélange homogénéisant de tissus durs 2,8 mm céramique (tubes renforcés de 2 mL) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Fournisseur : Revvity Health Sciences Inc
BouillotteK& H Manufacturing1060
Plateforme ICVStoelting502063
Chambre isoflurane avec système de scavangingVetEquip901820
Chlorure de magnésium héahydrateEMD Chemicals1.05832
Ciseaux MetzenbaumFine Science Tools (FST), ou équivalent14016-14
ID de test Mouse GAPDH TaqMan Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Électrodes à aiguille pour CMAP, 28 gNatus Medical (marque Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel : Nutrition complèteBio ServNGB-2
Porte-aiguille Olsen-HegarFine Science Tools (FST), ou équivalent12502-12
Poloxamer 188Mutchler
Chlorure de potassiumJT Baker3045
Préamplificateur (pour CMAP)Instruments de précision mondiaux (WPI)SYS-DAM50
Kit pNFH ProteinSimpleR& Systèmes DSPCKB-PS-000519
Prélèvements de prélude de providone-iodureDynarex1201
QIAzol Réactif de lyse   ;Qiagen79306
Système Quant Studio 12K FlexBiosystèmes appliqués4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Electronic DesignNuméro de série 061144CMAP Software  ;
Chambre de récupération pour petits animauxUnités de soins intensifs portables pour animaux Thermocare modèle FW-1FW-1  ;
Cadre stéréotaxique pour petits animaux avec console d’affichage numériqueKOPFModèle 940  ;
Souris SOD1 G93ALe laboratoire JacksonStock # 004435
Chlorure de sodiumEMD Chemicals1.16224
Phosphate de sodium dibase anhydreSigma Aldrich55136
Phosphate de sodium Monobase DihydrateSigma Aldrich3819
Scalpel jetable stérileMed Vet International, ou équivalentMIL4410
Drape stérileDynarex4410
Compresses stériles en gazeDynarex, ou équivalentDRX-3354
Solution saline stérileThermoFisher Scientific14190094
Gants chirurgicaux stérilesAnsell, ou équivalent20277290
Isolateur de stimulus (pour CMAP)Instruments de précision mondiaux (WPI)SYS-A365D
Micro Drill Stoelting & nbsp ;Stoelting58610
Pinces courbes chirurgicales (Pinces Graefe - Titane)Fine Science Tools (FST), ou équivalent11652-10
Pinces chirurgicales de droite (Graefe Forceps - Titane)Fine Science Tools (FST), ou équivalent11650-10
Ruban chirurgicalDynarex, ou équivalent3572
Seringue pour injection sous-cutanée d’analgésiqueBD309582
TaqMan Mix Master Avancé RapideThermoFisher Scientific4444556
Eau (Milli-Q)
BalanceMettler Toledo  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; Modèle XSR2002S23-112795
Souris sauvages C57BL/6JLe laboratoire JacksonStock # 000664

Références

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Oligonucl otides antisens SOD1mod le murin de la SLAadministration dans le liquide c phalorachidieninjection dans la moelle pini reinjection intrac r broventriculairevaluation lectrophysiologiquebiomarqueur des neurofilamentsPCR quantitative
Injection intrathécalale lombaire de SOD1-ASO pour un ciblage précis du SNC et une efficacité prédictive chez les souris ALS humaines SOD1-G93A
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