Modulation cholinergique dépendante des ligands du couplage oxydatif par phosphorylation dans les cellules neuroblastomes BE(2)-C perméméabilisées à la digitonine

Summary

Nous présentons un protocole pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique, permettant une livraison ciblée de substrats et d’inhibiteurs pour évaluer la phosphorylation oxydriale mitochondriale (OXPHOS) dans les cellules cultivées, surmontant ainsi les barrières de transport de la membrane plasmique qui entravent généralement cette analyse. Grâce à cette technique, nous avons démontré comment la fonction d’OXPHOS est modulée par les agonistes muscariniques et antagonistes.

Abstract

L’objectif de cette étude était d’évaluer la fonction de phosphorylation oxydative (OXPHOS) dans les cellules cultivées en utilisant des combinaisons substrat–inhibiteur définies tout en conservant la structure cellulaire et le contexte cytosolique perdus dans les préparations mitochondriales isolées. Comme les cellules intactes sont peu perméables à plusieurs intermédiaires du cycle de Krebs, l’évaluation directe de la respiration soutenue par le substrat via des points d’entrée spécifiques de la chaîne de transport électronique (ETC) est limitée. Pour surmonter cela, nous avons appliqué une perméabilisation sélective de la membrane plasmique médiée par la digitonine et réalisé des tests de couplage et de flux électronique basés sur un analyseur de flux extracellulaire dans les cellules neuroblastomes BE(2)-C. Pour déterminer la dépendance au type cellulaire, la digitonine a été titrée empiriquement dans les cellules HEK293 et les neurones primaires du ganglion dorsal du rat (DRG) en utilisant succinate + roténone pour isoler la respiration alimentée par le complexe II–IV.

La respiration soutenue par les succinates avec inhibition du complexe I a montré une consommation accrue d’oxygène (O₂) alimentée par le complexe II–IV dans les cellules perméabilisées comparées aux cellules non perméabilisées, ce qui correspond à un meilleur accès d’un substrat imperméable à la membrane aux mitochondries. En revanche, la respiration soutenue par des substrats entrant par des voies de transport endogènes (par exemple, pyruvate/malate) a montré des différences plus faibles entre les conditions. En utilisant cette plateforme pour tester les ligands muscariniques, nous avons observé des différences de consommation d’O₂ associées à l’agoniste versus antagoniste lors du test de couplage, tandis que le test de flux électronique a révélé des effets associés aux ligands minimes dans les conditions testées. Ces résultats indiquent que les effets détectables des ligands étaient plus marqués au niveau des états respiratoires définis par le couplage que la capacité maximale de transfert d’électrons. Dans l’ensemble, la perméabilisation sélective élargit l’accessibilité du substrat dans les tests bioénergétiques à cellules cultivées et permet l’analyse de la modulation pharmacologique de la respiration mitochondriale.

Introduction

Le dysfonctionnement ou la reprogrammation du métabolisme énergétique mitochondrial est central dans un large éventail de troubles, notamment la neurodégénérescence, le cancer, les maladies inflammatoires, les troubles cardiométaboliques et divers troubles génétiques. Pour mieux comprendre le rôle du métabolisme mitochondrial dans la pathogenèse des maladies, plusieurs stratégies analytiques ont été développées. Cela inclut les mesures du taux de consommation d’O2 (OCR), du taux d’acidification extracellulaire (ECAR), de la quantification de l’ATP, de l’utilisation du substrat, du profilage ou analyse du métabolite du cycle de Krebs, et du traçage^isotopique. Parmi ces techniques, l’OCR sert d’indicateur clé de la respiration mitochondriale et peut être évaluée à l’aide d’instruments tels que la respirométrie à haute résolution (HRR ; par exemple, Oroboros_{O 2}k)², l’électrode de type Clark ou l’analyseur de flux extracellulaire

Le système Oroboros_O2k mesure la concentration d’O2 dans une chambre scellée à l’aide d’un capteur polarographique O 2 ^(POS)3,4,5 de type Clark et convient à des échantillons tels que des mitochondries isolées, des cellules perméabilisées et des homogénéates tissulaires. Il se compose d’une cathode or/platine, d’une anode en argent et d’un réservoir d’électrolytes KCl séparés de l’échantillon par une membrane de propylène fluoriné (FEP) perméable à_O2 de 25 μm et chimiquement résistante. L’électrode^{de type Clark 3} fonctionne également dans une chambre fermée, détectant les variations de concentration d’O2 via une électrode sensible à l’O2, et est couramment utilisée pour les mitochondries isolées ou les suspensions cellulaires. En revanche, l’analyseur de flux extracellulaire quantifie l’OCR et l’ECAR dans des cellules vivantes adhérentes ou des mitochondries isolées à l’aide de capteurs fluorescents intégrés dans des microplaques, permettant un profilage métabolique à haut débit. Un avantage pratique de la plateforme d’analyseur de flux extracellulaire est l’évaluation automatisée et multiparamétrique sur plusieurs conditions en parallèle, tandis que les systèmes à chambre fermée (par exemple, HRR ou électrodes de type Clark) offrent généralement un débit plus faible et nécessitent une manipulation manuelle plus intense.

L’analyseur de flux extracellulaire est particulièrement utile pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules adhésives intactes ou des cellules en suspension qui se déposent au fond de la microplaque. Dans des tests utilisant des cellules adhérentes intactes, le métabolisme énergétique mitochondrial peut être profilé à l’aide de substrats tels que le glucose ou le^{pyruvate 6}. Alternativement, les tests utilisant de petites quantités de fractions mitochondriales enrichies permettent de mesurer séquentiellement la respiration basale, la respiration stimulée par ADP (État 3), la respiration au repos (État 4) et la respiration non stimulée par le découpleur en utilisant des combinaisons de substrats et^{d’inhibiteurs 7}. Cependant, dans les systèmes cellulaires intacts, les métabolites du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) qui ne sont pas perméables aux cellules ne peuvent pas être utilisés pour évaluer directement leur métabolisme. Tandis que les mitochondries isolées permettent l’utilisation de tels métabolites en raison de l’absence de barrières plasmatiques. L’analyse de l’approche bioénergétique mitochondriale enrichie isolée présente des limites : la structure mitochondriale peut être modifiée lors de l’isolement, et les facteurs cytosoliques influençant le métabolisme mitochondrial et le transport des métabolites sont réduits ou absents. En conséquence, les approches de perméabilisation sélective sont souvent utilisées comme compromis permettant de conserver certains aspects de l’architecture cellulaire tout en permettant un accès contrôlé aux mitochondries. Pour surmonter les limites liées à l’utilisation de cellules intactes ou de mitochondries isolées pour des essais métaboliques, ce protocole décrit une méthode de perméabilisation des cellules neuroblastomes adhérentes (BE(2)-C) à l’aide de la digitonine. Cette approche facilite l’importation de métabolites autrement non perséminents cellulaires à travers la membrane plasmique tout en maintenant des réponses mitochondriales fonctionnelles aux substrats et inhibiteurs définis.

La sélectivité de la digétonine repose sur des différences dans la composition lipidique de la membrane : la membrane plasmique est riche en cholestérol, tandis que les membranes mitochondriales—en particulier la membrane mitochondriale interne—contiennent très peu de^{cholestérol 8}. À faibles concentrations, la diguenine (ou saponine) perméabilise sélectivement et complètement la membrane plasmique en raison de sa forte teneur en cholestérol, tandis que les membranes mitochondriales ne sont affectées qu’à des concentrations plus^{élevées 9,10}. La digitonine se lie au cholestérol et forme des pores dans la membrane plasmique, permettant à de petites molécules telles que les intermédiaires du cycle TCA d’entrer dans le cytosol sans perturber la structure ou la fonction mitochondriale lorsqu’elles sont correctement optimisées. Cette approche convient mieux aux cellules cultivées pouvant être placées de façon reproductible en monocouches adhérentes dans une microplaque d’analyseur de flux extracellulaire et nécessite une titration empirique de la concentration de la diguenine pour chaque type cellulaire et densité de semis. Les indicateurs opérationnels de l’intégrité mitochondriale préservée incluent des réponses OCR robustes et sensibles aux inhibiteurs (par exemple, des diminutions attendues avec la roténone/antimycine A et une respiration IV complexe intacte avec ascorbate/TMPD), ainsi que l’absence d’effondrement OCR qui signalerait une surperméabilisation. Par conséquent, l’optimisation de la digitonine doit être réalisée avant les comparaisons expérimentales et répétée chaque fois que les conditions de culture ou la densité cellulaire changent. De plus, la concentration optimale de digitonine varie selon le type cellulaire et doit être déterminée empiriquement afin d’établir une fenêtre de perméabilisation permettant l’entrée des substrats imperméables (par exemple, le succinate) tout en maintenant une fonction mitochondriale sensible aux inhibiteurs. Dans cette étude, nous illustrons ce principe en optimisant la digitonine non seulement dans les cellules BE(2)-C, mais aussi dans les cellules HEK293 et les neurones primaires du ganglion dorsal (DRG) du rat.

Ce protocole a été démontré à l’aide de cellules neuroblastomiques BE(2)-C, initialement isolées du cerveau d’un patient masculin atteint de neuroblastome. Les cellules BE(2)-C expriment divers récepteurs muscariniques, en particulier le récepteur cholinergique muscarinique type-1 (CHRM1). Dans nos études précédentes, nous avons démontré que CHRM1 est associée aux mitochondries tant dans les corps cellulaires que dans les neurites des neurones ganglionnaires dorsaux de rats cultivés, ainsi que dans les cellules^{HEK293 transfectées par CHRM1 11}. De plus, la délétion génétique de Chrm1 chez la souris modifie plusieurs aspects de la structure et de la fonction mitochondriale^12,13. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que les cellules BE(2)-C peuvent être utilisées pour étudier les effets modulateurs des ligands muscariniques sur la fonction d’OXPHOS. Dans cette démonstration, nous avons examiné les effets des agents muscariniques — y compris l’agoniste acétylcholine, l’antagoniste biaisé pirèpine¹⁴ et l’antagoniste atropine — sur la respiration mitochondriale en présence de succinate ou pyruvate/malate comme substrats, et comparé leur impact.

Protocol

1. Dégel et plaquage initial

REMARQUE : Le milieu de base pour les cellules BE(2)-C est un mélange 1:1 de médium essentiel Eagle’s Minimum formulé par ATCC et de médium F12, complété avec un sérum bovin fœtal (FBS) à 10 %.

1. Dégelez les cellules BE(2)-C congelées d’un cryovial dans un bain-marie à 37 °C. Une fois décongelées, centrifugez les cellules à 200 × g pendant 5 minutes pour retirer le cryoprotecteur.
2. Resuspendez la granule cellulaire dans un milieu de croissance complet et placez les cellules dans un bol de culture cellulaire de 10 cm. Incubez la culture à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ dans l’air jusqu’à ce que les cellules atteignent la subconfluence.

2. Sous-culture

1. Subculturez les cellules pendant 2 à 3 galeries afin de garantir qu’elles atteignent une phase de croissance exponentielle stable.

3. Trypsinisation et préparation à la suspension monocellulaire

1. Lorsque la culture atteint une confluence de 60 à 80 %, on trypsinise les cellules. Faites passer la suspension à cellules plusieurs fois à travers des pipettes à transfert à pointe fine avec des pointes polies pour dissocier les amas et obtenir une suspension à cellule simple.
2. Ajoutez un nouveau milieu contenant du FBS pour neutraliser la trypsine. Centrifugez les cellules à 200 × g pendant 5 minutes pour les pelleter.

4. Protocole d’ensemencement cellulaire pour microplaques de culture cellulaire à 24 puits utilisées dans les analyseurs de flux extracellulaires

1. Resuspendez la pellete dans un milieu complet à une concentration finale de 10 000 cellules par 100 μL par puits.
2. Semez les cellules à une densité optimisée pour garantir qu’elles atteignent la confluence complète en 1 à 2 jours. Laissez soit les quatre puits d’angle, soit un puits d’angle unique vides, selon la conception expérimentale. Ces puits serviront de contrôles en arrière-plan.
   REMARQUE : Cela peut nécessiter des essais et des erreurs, y compris des ajustements du volume et du timing du support.
3. Surveillez la culture pour détecter les changements de couleur du milieu — le jaunissement indique une baisse du pH et nécessite un remplacement immédiat par un milieu frais pour maintenir la santé cellulaire.

5. Préparation à un test basé sur un analyseur de flux extracellulaire

REMARQUE : Les formats de couplage et d’analyse de flux électronique utilisés ici suivent les flux de travail établis de respiration mitochondriale à base de microplaques⁷, avec des modifications incluant la perméabilisation des cellules BE(2)-C utilisant la titration de la digitonine et les conditions de traitement des ligands muscariniques.

1. Préparez des solutions de base et 2 solutions d’analyse mitochondriale (MAS). Préparez à l’avance deux mélanges MAS et des solutions de réactifs actifs (substrats et inhibiteurs) (voir Tableau 1, Tableau 2 et Tableau 3).
2. Stockez toutes les solutions et MAS en stock à -20 °C pour une utilisation future, permettant une installation efficace des tests.
   SÉCURITÉ : La roténone, l’antimycine A, l’oligomycine, le FCCP, la digitonine et la TMPD sont dangereux et doivent être manipulés conformément aux directives de sécurité institutionnelles. Toutes les solutions inhibitrices doivent être préparées et manipulées dans une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants en nitrile et protection oculaire). Les solutions contenant ces réactifs, ainsi que les déchets contenant du DMSO, doivent être collectées et éliminées comme déchets chimiques dangereux conformément aux réglementations institutionnelles et locales. Les surfaces de travail doivent être décontaminées après utilisation.
3. Hydratation de la cartouche capteur
   1. La veille de l’expérience, hydratez la cartouche captrice de l’analyseur de flux extracellulaire en ajoutant 1 mL de tampon d’étalonnage de la cartouche de capteur ou de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS, pH 7,4) à chaque puits. Laissez la cartouche capteur reposer toute la nuit (12–18 h) à température ambiante (20–25 °C).
      REMARQUE : L’incubation dans un incubateur sans CO₂ à 37 °C n’est pas nécessaire, car la cartouche s’équilibrera à température ambiante pendant le chargement. Une fois placée dans l’analyseur de flux extracellulaire pour calibration, la cartouche atteindra 37 °C en environ 15 minutes.

6. Jour de l’expérience

REMARQUE : Préparez toutes les solutions fraîches, ajustez le pH si nécessaire, et laissez-les sur glace jusqu’à utilisation.

1. Dégelez les stocks de substrat congelé et 2x MA à température ambiante (20–25 °C) pendant 15–30 minutes ou dans un bain-marie à 37 °C pendant 5–10 minutes.
2. Préparez tous les substrats et solutions d’injection (voir les Tableaux 4, 5, 6 et 7) et vérifiez que le pH est à 7,4. Ajustez si nécessaire et gardez les solutions sur la glace jusqu’à utilisation. Utilisez les Tables 4 et 5 pour l’essai de couplage. Pour le test de flux d’électrons, utilisez les Tables 6 et 7.
3. Chargez les inhibiteurs et substrats dans les ports de cartouche de capteur appropriés et préparez-vous à lancer l’analyse. Selon le type d’essai — test de couplage ou test ^{d’écoulement électronique 7} — se référer respectivement aux Tables 4 et 5 ou aux Tables 6 et 7, selon les besoins.
4. Préparer toutes les solutions de travail du substrat et des inhibiteurs selon les volumes finaux définis (mélanges en vrac : 15 mL ; mélanges d’injection en cartouche : 2 mL par port). Calculer les concentrations pour atteindre les concentrations finales souhaitées dans le puits après injection (volume final du puits : 700 μL après le port D).
5. Ajouter 450 μL de la solution d’essai préparée à chaque puits de la plaque analyseur de flux extracellulaire à 24 puits contenant les ligands muscariniques (concentration finale de ligands : 1 μM ; volume total de puits : 500 μL). Assurez-vous que chaque puits contient déjà 50 μL de tampon 1x MAS et de cellules submergées.
   REMARQUE : Effectuez cette étape immédiatement avant de charger la plaque dans l’analyseur.
6. Chargez 50 μL de chaque réactif préparé dans le port d’injection correspondant de la cartouche capteur.

7. Programmation des instruments et exécution des essais

1. Allumez l’analyseur de flux extracellulaire au moins 1 à 2 heures avant l’expérience pour permettre à l’incubateur interne de se stabiliser à 37 °C. Maintenez la chambre à 37 °C pendant l’étalonnage et la prise de test.
2. Programmer l’analyseur pour effectuer les cycles de mélange, d’attente et de mesure appropriés selon le Tableau 8.
3. Étiquetter les puits et groupes expérimentaux dans le logiciel selon le plan expérimental.
4. Commencez la séquence. Laissez l’instrument calibrer la cartouche capteur (~15 min).
5. Préparez la plaque de test pour le chargement lors de l’étalonnage de la cartouche. Retarder le chargement si nécessaire ; la cartouche capteur restera stable à 37 °C à l’intérieur de l’instrument.
6. Terminez le test lorsque le cycle de mesure final après l’injection Port D sera terminé. Procédez immédiatement à la normalisation post-test et à l’analyse des données.

8. Préparation de la plaque cellulaire pour un test d’analyseur de flux extracellulaire

1. Commencez à préparer la plaque cellulaire immédiatement après avoir placé la cartouche captrice dans l’analyseur pour l’étalonnage. Ajoutez 700 μL de tampon 1x MAS à chaque puits contenant des cellules adhérentes. Incubez à température ambiante (20–25 °C) pendant 1 minute.
2. Aspirez soigneusement le tampon sans perturber les cellules attachées. Répétez l’étape de lavage pendant au moins 3 x 1 minute pour éliminer le milieu résiduel et terminez tous les lavages en 10 minutes.
3. Ajoutez 50 μL de tampon 1x MAS à un puits de fond désigné (sans cellules) pour établir une référence de volume visuelle.
4. Aspirez le tampon des puits expérimentaux, laissant environ 50 μL de tampon résiduel dans chaque puits.
5. Incubez la plaque à 37 °C dans un bain-marie, en gardant la plaque au-dessus de la surface de l’eau pour éviter l’évaporation. Maintenez à 37 °C pendant 10 minutes (maximum 20 minutes) avant le chargement.
6. Juste avant de charger la plaque, ajoutez 450 μL de tampon 1x MAS contenant les substrats appropriés à chaque puits pour atteindre un volume final de 500 μL.
7. Insérez la plaque dans l’analyseur de flux extracellulaire.

9. Fin du test et analyse des données

1. Retirez la plaque cellulaire et la cartouche capteur de l’analyseur après la fin de l’exécution.
2. Normaliser les valeurs de l’OCR par puits en utilisant la quantification totale des protéines ou le nombre total de cellules. Lyse les cellules avec un tampon RIPA et quantifie la protéine totale à l’aide du test de Bradford ou d’un autre test protéique spectrophotométrique.
3. Normaliser les valeurs OCR à l’aide du logiciel d’analyse et exporter les données si besoin.
4. Appliquez les critères d’acceptation suivants : confirmer la stabilité de base de la TOC (≤dérive de 15 % sur deux cycles de mesure consécutifs) et confirmer une réduction de ≥60 % de la ROC après une injection de roténone, d’oligomycine ou d’antimycine A.
5. Excluez les tirages qui ne respectent pas ces critères et réoptimisez la concentration de perméabilisateurs ou la densité d’ensemencement cellulaire selon les besoins.

10. Exportation des résultats

1. Insérez une clé USB dans l’instrument.
2. Exportez les données du test.

11. Traitement des données

1. Analysez les données à l’aide du logiciel instrumentaire.
2. Exportez les données traitées dans des formats compatibles avec les logiciels d’analyse de votre choix pour une analyse et une visualisation ultérieures.

Results

Optimisation de la concentration de la digitonine pour la perméabilisation des cellules BE(2) C dans un essai de couplage
Au début de ce protocole, nous avons standardisé la concentration optimale de digitonine nécessaire à une perméabilisation cellulaire efficace sans compromettre la respiration mitochondriale. Dans ce protocole, nous avons testé 5 μM et 10 μM de la digitonine comme concentrations initiales et réalisé un test de couplage. Ce test évalue le degré de c...

Discussion

Cette étude introduit un protocole rapide et économique pour évaluer la modulation d’OXPHOS médiée par ligands muscarinique dans les cellules de neuroblastome en culture. En utilisant le perméabiliseur sélectif de membranes plasmiques, la digitonine, combiné à des paires substrat-inhibiteur définies, nous avons permis une livraison ciblée de substrats métaboliques tels que le succinate directement aux mitochondries in situ. Cette approche surmonte les limites des membranes cellu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure d’acétylcholine	MilliporeSigma	A6625	Agoniste muscarinique
ADP	MP Biomédicales, Inc	ICN19014901	Accepteur d’électrons, substrat pour la synthèse d’ATP.
Antimycine A	AAJ63522MA	Thermo Scientific	Inhibe le complexe mitochondrial III
Atropine	MilliporeSigma	1044990	Antagoniste muscarinique
Cellules Be2C	Collection de la culture de type américain	CRL-2268	Une cellule neuroblaste isolée du cerveau d’un patient masculin atteint de neuroblastome, exprime un récepteur muscarinique
Digitonin	MilliporeSigma	D141	Détergent doux, perméabilisant membranaire.
D-Mannitol	Thermo-Sciences Chimiques	AA3334236	Un alcool de sucre non métabolisable, utilisé pour la stabilisation osmotique et la protection des membranes
EGTA	MilliporeSigma	E0396	La chélation du calcium empêche l’activation des protéases dépendantes du calcium et d’autres enzymes susceptibles de dégrader les protéines mitochondriales.
BSA sans acides gras	MilliporeSigma	126575	Prévient les effets incontrôlés des acides gras, stabilise les mitochondries
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Un protonophore et un découpleur de la phosphorylation oxydative dans les mitochondries
HEPES	MilliporeSigma	391340	Tampon de pH, compatibilité avec la fonction mitochondriale
L-Ascorbate	TCI America	A053925G	Cycle intermédiaire du TCA, substrat d’OXPHOS
Chlorure de magnésium	MilliporeSigma	M8266	Pour l’équilibre ionique, soutien à l’activité enzymatique
N1,N1,N1,N1-tétraméthyle-1,4-phénylène diamine (TMPD)			Donateur d’électrons au cytochrome c, évaluation de la fonction IV complexe en contournant les complexes I et II, TMPD/ascorbate permet de mesurer directement la consommation d’oxygène dépendante du complexe IV
Oligomycine	MilliporeSigma	1404-19-9	Inhibe la synthèse mitochondriale d’ATP, Complexe V
Dihydrochlorure de pirenzepine	MilliporeSigma	P7412	Agoniste biaisé muscarinique
Acide pyruvique	Thermo-Sciences Chimiques	AC132155000	Substrat du cycle TCA
Roténone	MilliporeSigma	557368	Inhibe le complexe mitochondrial I
Microplaques de culture cellulaire Seahorse XF24 V7 PS	Agilent	102340-100	Microplaques de culture cellulaire
Analyseur Seahorse XFe24	Agilent	S7801BR	Les analyseurs Agilent Seahorse XFe24 mesurent le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) des cellules vivantes sous forme de plaque à 24 puits.
Acide succinique	Fisher Chemical	AC158742500	Cycle intermédiaire du TCA, substrat d’OXPHOS
Tampon de calibration de cartouche capteur XFe24	Agilent	102340100	pH du tampon PBS 7,2
Cartouches de capteurs XFe24	Agilent	102340-100	capteur pour la mesure OCR et ECAR