Les ARNnc associés au stress oxydatif comme biomarqueurs potentiels pour le pronostic et les réponses immunitaires chez les patients atteints de carcinome squameux pulmonaire

Résumé

Cette étude identifie une signature liée au stress oxydatif à 10 ARNnc dans le carcinome épidermoïde pulmonaire (LUSC) à partir des données de The Cancer Genome Atlas. Bien que la validation ait montré une performance prédictive clinique limitée, la signature différenciait les motifs de microenvironnement immunitaire et les analyses in vitro LINC01615 soutenaient comme candidat lié à la migration et à l’invasion pour une investigation mécanistique ultérieure.

Résumé

L’ARN non codant à longue chaîne (ARNnc) influence significativement la valeur pronostique et l’infiltration immunitaire du carcinome squameux pulmonaire (LUSC). Cette étude visait à démontrer comment les ARNnc liés au stress oxydatif impactent le carcinome épidermoïde pulmonaire (CCS). Le jeu de données Cancer Genome Atlas (TCGA) a recueilli des informations sur le transcriptome et des données cliniques associées pour le LUSC. Pour construire un modèle pronostique, 10 gènes liés au pronostic ont été identifiés à l’aide d’une série d’analyses bioinformatiques comparant l’expression aberrante du gène OS dans les tumeurs et les tissus sains, ainsi que son association avec le cancer. Les sujets ont été stratifiés en groupes à haut et faible risque en fonction du score médian de risque dérivé de la signature de 10 gènes. Bien que le modèle mathématique de risque ait démontré une performance prédictive indépendante limitée dans la cohorte de validation (AUC ~ 0,5), les évaluations fonctionnelles et immunologiques ont révélé des différences significatives dans le microenvironnement tumoral (TME) selon les couches à risque. Plus précisément, les patients à haut risque présentaient des profils d’infiltration immunitaire distincts et des scores immunologiques modifiés par rapport à leurs homologues à faible risque. Ainsi, plutôt que de servir d’outil direct de prédiction clinique, cette signature d’ARNnc liée au stress oxydatif fournit des informations biologiques précieuses sur le paysage immunitaire de la LUSC et met en lumière des cibles thérapeutiques potentielles pour une investigation mécanistique ultérieure.

Introduction

Le cancer du poumon présente la plus forte incidence et mortalité mondiale parmi les^{cancers 1}. Parmi les variantes histologiques du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), le carcinome épidermoïde pulmonaire (LUSC) est un sous-type prédominant, souvent corrélé à des résultats cliniques défavorables et à un manque de traitements ciblés très efficaces comparé à l’adénocarcinome^{pulmonaire 2}. Bien que les approches thérapeutiques primaires incluent l’intervention chirurgicale, la radiothérapie et la chimiothérapie, les patients atteints de LUSC avancé présentent fréquemment une résistance^{thérapeutique 3}. Par conséquent, il est urgent d’identifier des biomarqueurs moléculaires robustes pour améliorer la stratification pronostique et orienter les stratégies thérapeutiques exploratoires pour^{LUSC 4}.

Le stress oxydatif, caractérisé par l’accumulation pathologique d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), joue un rôle crucial dans l’initiation, la croissance et la métastase des tumeurs. En l’absence de mécanismes efficaces de délamie ROS, des niveaux élevés de ROS induisent des dommages à l’ADN et une génotoxicité, entraînant finalement diverses altérations génomiques contribuant au développement du cancer. Notamment, des études ont constamment démontré une augmentation des niveaux de ROS et du stress oxydatif, notamment dans la pathogenèse du cancer du^{poumon 5,6}. Des recherches récentes ont également mis en lumière que des groupes de gènes liés au stress oxydatif pourraient fonctionner comme biomarqueurs pronostiques prospectifs dans les cancers^{pulmonaires 7}. Les ARN longs non codants (ARNnc) sont devenus des régulateurs cruciaux de l’expression génique et représentent des biomarqueurs pronostiques prometteurs dans diverses tumeurs. Bien qu’une étude notable précédente^ait établi avec succès un modèle pronostique d’ARNlcRNA lié au stress oxydatif pour l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD), le paysage pronostique spécifique et les implications immunitaires de ces ARNnc dans le LUSC restent largement inexplorés.

Dans cette étude, les auteurs ont analysé systématiquement les ensembles de données TCGA afin de construire une nouvelle signature d’ARNnN liée au stress oxydatif spécifiquement adaptée au LUSC. De plus, contrairement aux analyses purement bioinformatiques, la présente étude intègre une validation expérimentale in vitro pour confirmer le rôle fonctionnel biologique des ARNn clés identifiés (par exemple, Linc01615). Plutôt que de revendiquer une applicabilité clinique immédiate aux décisions diagnostiques et thérapeutiques, cette recherche vise principalement à explorer les mécanismes potentiels du stress oxydatif dans le LUSC et sa corrélation avec le microenvironnement immunitaire tumoral. Ces résultats visent à fournir des informations biologiques précieuses et à mettre en lumière des cibles thérapeutiques potentielles pour de futures recherches mécanistiques.

Protocole

Acquisition et prétraitement des données

Toutes les données analysées dans cette étude ont été obtenues à partir de la base de données accessible au public de la TCGA, listée dans le tableau des matériaux. Cette étude a strictement respecté la politique de partage des données génomiques des National Institutes of Health (NIH) ainsi que les directives de publication fournies par la TCGA. Comme les ensembles de données sont constitués de données cliniques et multi-omiques désidentifiées, disponibles publiquement, cette étude a été exemptée d’une approbation ultérieure du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB). Les données transcriptomiques et les informations cliniques correspondantes pour LUSC ont été téléchargées depuis la base de données Cancer Genome Atlas (TCGA). Initialement, la cohorte comprenait 551 échantillons (502 tumoraux et 49 normaux). Pour garantir la robustesse de ce modèle pronostique, les patients dépourvus de données complètes de survie globale (OS), de statut de survie ou de caractéristiques cliniques essentielles ont été exclus de l’analyse de survie en aval. À la suite de ce processus de filtrage strict, une cohorte analytique finale de 470 patients atteints de LUSC a été établie. Ces 470 patients ont ensuite été divisés aléatoirement en un ensemble d’entraînement (n = 235) et un ensemble de test (n = 235) pour la construction et la validation du modèle de risque. Un total de 792 gènes liés au stress oxydatif ont été collectés via la base de données GeneCards, listée dans le Table of Materials, en utilisant un critère d’inclusion avec un score de pertinence ≥ 7. Le package limma (version 3.66.0) a été utilisé pour dépister les gènes de stress oxydatif exprimés différemment. Les graphiques volcaniques étaient produits à l’aide du package ggplot2 (version 4.0.2). Entre le groupe de formation et le groupe de test, il n’y avait pas de variation appréciable des caractéristiques cliniques (p > 0,05). L’ensemble d’entraînement était utilisé pour la construction du modèle, et l’ensemble de test pour la validation interne.

Construction et vérification du modèle de risque

Pour identifier les ARNnc associés au stress oxydatif, une analyse de co-expression de Pearson a été réalisée. Les auteurs ont évalué la corrélation entre les profils d’expression des gènes liés au stress oxydatif différenciément exprimés identifiés et de tous les ARNlcRNA annotés au sein de l’ensemble de données TCGA-LUSC. Les critères de corrélation pour sélectionner les ARNnc co-exprimés ont été fixés à un coefficient de corrélation |R| > 0,4 et une valeur p < 0,001. Sur la base de ces seuils, un total de 6 088 ARNnc candidats liés au stress oxydatif ont été dérivés et extraits. Par la suite, ces 6 088 ARNnc candidats ont été évalués par régression LASSO et approches analytiques complémentaires pour construire le modèle pronostique du risque. En utilisant les données traitées, les patients participants ont été classés en strates à haut et faible risque.

Facteurs indépendants et courbes ROC

Des modèles de régression de Cox univariés et multivariés ont été utilisés pour identifier des variables pronostiques indépendantes. Plus précisément, pour contrôler le taux d’erreur familiale lors des analyses de régression de Cox univariées multiples (n = 236 tests), la correction de Bonferroni a été appliquée, fixant le seuil de signification strictement ajusté à p < 0,00021 (calculé comme 0,05 / 236).

Analyse de la survie et analyse des composantes principales

Le package de survie (versions 3.8-6) a été utilisé pour calculer les taux de survie globale (OS), et l’analyse en composantes principales (PCA) a été utilisée pour évaluer la robustesse du modèle de risque.

Nomogramme

L’indice d’ajustement a été évalué à l’aide du package rms dans R pour évaluer la fiabilité du nomogramme. La charge mutationnelle tumorale (TMB) a été évaluée et visualisée à l’aide du package maftools (version 2.22.0). Des algorithmes, dont ssGSEA, ont été utilisés pour détecter l’infiltration immunitaire. De plus, le paquet ggpubr (version 0.6.3) a été utilisé pour comparer les points de contrôle immunitaires entre groupes de risque. L’algorithme ESTIMATE a été utilisé pour caractériser le microenvironnement tumoral (TME).

Analyse fonctionnelle

Le package clusterProfiler (version 4.14.6) dans R était utilisé pour l’analyse d’enrichissement. Pour explorer davantage les voies fonctionnelles, une analyse GSEA a été réalisée. Grâce à Cytoscape, un réseau de co-expressions a été créé pour l’observation.

Méthodes expérimentales

Conditions de culture cellulaire et regroupement

La lignée cellulaire du carcinome épidermoïde pulmonaire humain NCI-H520 (RRID : CVCL_1566 ; listée dans le tableau des matériaux) a été cultivée dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules en phase logarithmique ont été ensemencées en plaques de culture à 6 puits. Après une adhésion réussie, les cellules ont été réparties aléatoirement en trois groupes expérimentaux distincts : un groupe témoin vide maintenu dans des conditions de culture standard, un groupe témoin négatif (si-NC) transfecté avec un siARN non ciblant, et un groupe expérimental knockdown (si-LINC01615) transfecté avec du siARN spécifique à LINC01615.

Transfection cellulaire

Les réactifs si-LINC01615 et si-NC ont été décongelés sur la glace. Pour la préparation du complexe de transfection, 95 μL de milieu RPMI-1640 sans sérum ont été pipéttés dans des tubes centrifuge stériles, suivis d’une addition séquentielle de 3 μg du siRNA respectif et de 5 μL de réactif de transfection Lipo3000. La même procédure a été appliquée pour les groupessi LINC01615 et siNC. Les solutions ont été délicatement mélangées et incubées à température ambiante pendant 5 minutes pour faciliter la formation complexe, ce qui donne un volume total d’environ 200 μL par tube. Par la suite, ce mélange a été uniformément distribué dans les puits de culture désignés contenant 800 μL de milieu basal RPMI-1640. Après une période d’incubation de 6 heures à 37 °C, le milieu de transfection était soigneusement aspiré et remplacé par un milieu de culture frais et complet.

Essai de cicatrisation des plaies (scratch)

Pour le test de cicatrisation, les cellules NCI-H520 en croissance logarithmique (RRID : CVCL_1566) ont été ensemencées dans des plaques de culture à 6 puits à une densité de 5,6 × 10 cellules⁵ par puits. À une confluence de 95–100 %, une plaie linéaire a été créée artificiellement en grattant verticalement la monocouche cellulaire au centre du puits à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL. Les puits ont ensuite été lavés trois fois avec du PBS pour éliminer les cellules détachées et les débris cellulaires, puis incubés dans un milieu RPMI-1640 sans sérum. Des images des zones blessées identiques ont été capturées à 0, 24 et 48 h à l’aide d’un microscope inversé. La zone de cicatrisation a été quantifiée en mesurant la distance d’écart à l’aide d’ImageJ (RRID : SCR_003070 ; listée dans le tableau des matériaux), et le taux de migration a été calculé par rapport à la surface initiale de la plaie à 0 h.

Migration transwell et analyses d’invasion

Les capacités de migration et d’invasion cellulaires ont été évaluées à l’aide de chambres Transwell à 24 puits équipées d’inserts membranaires en polycarbonate de taille 8,0 μm listés dans le tableau des matériaux. Pour le test d’invasion, les chambres apicales ont été pré-enduites de 50 μL de Matrigel (dilué à 1:8 dans un milieu sans sérum ; indiqué dans le tableau des matériaux) et incubées à 37 °C pendant 2 h pour polymériser, tandis que le test de migration utilisait des inserts non revêtus. Après transfection cellulaire et une période de famine sérique de 24 heures, les cellules NCI-H520 ont été prélevées, remises en suspension dans un milieu RPMI-1640 sans sérum, puis ensemencées dans les chambres apicales à une densité de 1,8 × 10⁵ cellules/puits en 200 μL. Les chambres basales étaient remplies de 600 μL de milieu RPMI-1640 complétés par 10 % de FBS comme chimioattrant. Après une incubation de 48 heures à 37 °C avec 5 % de CO₂, les inserts ont été retirés et lavés trois fois avec du PBS. Les cellules restantes à la surface apicale de la membrane ont été doucement prélevées à l’aide d’un coton-tige humide. Les cellules ayant migré ou envahi la surface basolatérale ont été fixées à 4 % de paraformoldéhyde pendant 20 minutes et colorées avec une solution de Giemsa listée dans le Tableau des matériaux pendant 30 minutes à température ambiante. Les cellules migrées et envahies ont été visualisées et énumérées sur trois champs optiques sélectionnés aléatoirement par insert à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40x.

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques et visualisations des données ont été réalisées à l’aide du logiciel R (version 4.1.2 ; RRID : SCR_001905 ; listé dans le tableau des matériaux). Les numéros de version spécifiques de tous les packages R utilisés dans cette étude ont été explicitement détaillés dans leurs sous-sections méthodologiques respectives. Une valeur significative était conventionnellement définie comme p < 0,05, sauf indication contraire. Lorsque des comparaisons multiples ont été réalisées (par exemple, les régressions de Cox univariées multiples), la méthode de Bonferroni a été appliquée rigoureusement pour maintenir le taux d’erreur familiale (FWER), avec le seuil exact ajusté (par exemple, p < 0,00021) détaillé dans la sous-section méthodologique correspondante. Les données quantitatives in vitro ont été exprimées en écart-type moyen ± et analysées à l’aide du test t de Student ou de l’ANOVA unidirectionnelle selon le cas.

Résultats

Identification de gènes exprimés différemment pour le stress oxydatif

Le flux de travail est montré à la Figure 1. Les caractéristiques cliniques de la cohorte analytique finale comprenant 470 patients atteints de LUSC sont détaillées dans le tableau 1. Sur la base du seuil défini d’un score de pertinence ≥ 7, les auteurs ont récupéré un total de 792 gènes liés au stress oxydatif à partir de la ba...

Discussion

Le carcinome épidermoïde pulmonaire (LUSC) est un sous-type histologique prédominant et très agressif du cancer du poumon non à petites cellules, souvent caractérisé par des taux de survie critiques et une résistance aux modalités thérapeutiques^{conventionnelles 8,9}. Les preuves émergentes soulignent le stress oxydatif comme un moteur clé dans la pathogenèse et la progression de diverses cancers. L’accumulation pathologique des es...

Matériaux

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Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4% Paraformaldehyde	Beyotime	P0099	Utilisé pour la fixation des cellules
Cytoscape	Consortium Cytoscape	https://cytoscape.org/	Utilisé pour la création de réseaux de co-expression
Sérum bovin fœtal (FBS)	Gibco	10099-141	Concentration finale 10% (v/v)
Base de données GeneCards	Base de données génétique humaine GeneCards	https://www.genecards.org/	Dépistage des gènes liés au stress oxydatif
Coloration de Giemsa	Sigma-Aldrich	GS500	Utilisé pour la coloration des cellules migrée/envahie
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/	Utilisé pour la quantification de la plaie
Réactif de transfection Lipo3000	GLPBIO	GK20006	Utilisé pour la transfection siRNA
Matrigel	Corning	356234	Dilué 1:8 dans un milieu sans sérum
Carcinome épidermoïde pulmonaire humain NCI-H520	ATCC	HTB-182	Utilisé pour les tests de validation in vitro
PBS (Phosphate-Buffered Saline)	Gibco	10010-023	Utilisé pour le lavage cellulaire
Penicillin-Streptomycin (1%)	Gibco	15140-122	Supplément antibiotique pour culture cellulaire
Logiciel R (v4.1.2)	R Foundation	https://www.r-project.org/	Analyse statistique et visualisation
Milieu RPMI-1640	Gibco	11875-093	Milieu de culture cellulaire
The Cancer Genome Atlas (TCGA)	Genomic Data Commons	https://portal.gdc.cancer.gov/	Source de données cliniques et de transcriptome
Chambres Transwell (8,0 µm)	Corning	3422	Utilisé pour les tests de migration et d'invasion

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