Article de méthode

Microdissection par capture laser du tissu hépatique de souris fixé au paraformodéhyde pour l’analyse de l’ARN

DOI :

10.3791/69814

⸱

17 avril 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode pour isoler l’ARN à partir de régions histologiques définies de tissu hépatique de souris fixé au paraformaldéhyde et à la température optimale de coupe, en utilisant une microdissection par capture laser, permettant une analyse ciblée de l’expression génique en aval.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microdissection par capture laser (MCL) offre un accès spatial à des populations cellulaires spécifiques au sein de tissus complexes grâce à la visualisation in situ et à l’isolement. Pour permettre l’analyse transcriptomique des régions histologiquement définies dans un tissu fixé, un protocole détaillé de LCM est présenté pour l’extraction d’ARN à partir de sections hépatiques de souris fixées par le paraformaldéhyde (PFA), à température optimale de coupe (OCT). Le protocole détaille l’identification et la collecte d’échantillons à l’échelle microscopique (environ 1 000 cellules) à travers un flux de travail comprenant la fixation tissulaire, la déshydratation du saccharose, l’embedding OCT, la cryosection, la coloration à l’hématoxyline et la capture au laser des zones histologiques ciblées. Grâce à cette méthode, un ARN de haute pureté (A260/A280 : 1,9-2,1) a été obtenu. Le nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) était de 6,7 ± 0,9, reflétant la fragmentation attendue associée à la fixation du PFA. Cependant, la PCR quantitative pour β-actine a donné des valeurs de Ct de 17 à 19, et le séquençage d’ARN effectué par préparation de bibliothèque optimisée pour la fragmentation a généré des lectures de haute qualité, >90 % des bases atteignant les seuils Q20 et Q30, confirmant que l’ARN est adapté aux analyses sensibles en aval. Par conséquent, ce protocole permet une analyse spatiale et ciblée de l’expression génique en fournissant un ARN de pureté et d’intégrité définies provenant de régions histologiques spécifiques du tissu hépatic fixé au PFA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’acquisition précise de profils d’expression génique spatialement résolus est cruciale pour comprendre l’hétérogénéité tissulaire en santé et en maladie. Le séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) offre une haute résolutioncellulaire 1,2, mais il perd son contexte spatial natif et peut modifier les profils transcriptionnels lors de la dissociationtissulaire 3,4. Pour les types cellulaires dépourvus de marqueurs spécifiques identifiés publiquement, obtenir des populations pures par tri basé sur l’immunofluorescence ou l’isolement immunomagnétique restedifficile 5,6. Les technologies de transcriptomie spatiale telles que Visium et GeoMx permettent la capture in situ de données d’expression génique à haut débit, mais leur résolution spatiale est limitée au niveau unicellulaire ou subcellulaire 7,8. Inversement, la transcriptomique spatiale basée sur l’imagerie peut atteindre une résolution au niveau du nanomètre mais a un débit limité de détectiongénique 9. Cela met en lumière une lacune persistante pour l’analyse fondée sur des hypothèses de régions morphologiques spécifiques.

La microdissection par capture laser (LCM) permet la sélection et l’isolement guidées au microscope de cellules spécifiques à partir de coupes tissulaires ou de cultures cellulaires vivantes en fonction du phénotype observable. Cette approche préserve la structure cellulaire et l’informationspatiale 10. Cette technique a été largement appliquée dans la recherche sur les maladies du foie pour des analyses en aval. Par exemple, la LCM a été utilisée pour collecter des cellules épithéliales biliaires à partir de biopsies hépatiques afin d’élucider leur rôle immunorégulateur dans la cholangite biliaireprimaire 11. De plus, il a été utilisé pour isoler des tissus positifs à la γ-glutamyl transférase (GGT) à partir de modèles expérimentaux afin de confirmer l’expression du gène Ggt1 spécifique au site 12. Mais ces études se sont principalement concentrées sur des tissus frais et congelés, qui manquent souvent d’annotations cliniques ou de suivi à longterme 13. En revanche, les tissus chimiquement fixés offrent des avantages pour le diagnostichistopathologique 14. Bien que le séquençage d’ARN basé sur LCM (RNA-Seq) ait été appliqué avec succès à des spécimens hépatiques archivés, à grande échelle fixés au formol et embrouillés dans la paraffine(FFPE) 15. Cependant, un protocole robuste de profilage de l’expression génique basé sur LCM, spécifiquement destiné aux échantillons à l’échelle microscopique provenant de tissus hépatiques enracisés dans le composé fixé par paraformodéhyde (PFA) et composé à température de coupe optimale (OCT), fait défaut.

Pour répondre à ce besoin non satisfait, un protocole complet a été optimisé en utilisant des cryosections fixées en PFA et intégrées à l’OCT. Ce protocole répond aux limites des flux de travail FFPE (par exemple, traitement prolongé et produits chimiques agressifs) pour les applications sensiblesLCM-ARN 16. En revanche, le processus de fixation et d’incorporation des échantillons fixés en PFA et intégrés dans l’OCT est relativement plus simple et plus flexible, permettant une préparation rapide de coupes de haute qualité qui préservent à la fois l’intégrité de l’ARN et la morphologie tissulaire. De plus, ce protocole est réalisé à l’aide d’un système LCM laser à base d’ultraviolets (UV). Comparé aux systèmes infrarouges, l’UV-LCM offre une résolution de coupe plus fine et permet une collecte directe et sans contact, minimisant la contamination et le rendant adapté à l’isolement précis des régions à l’échelle microscopique à partir d’architectures tissulairescomplexes 17,18. Ainsi, la valeur opérationnelle de ce protocole réside dans sa capacité à capturer des régions à microéchelle (~1 000 cellules) à partir de sections hépatiques fixées par PFA. Il fournit de l’ARN adapté à l’analyse ciblée de l’expression génique, permettant une corrélation directe entre les caractéristiques histopathologiques et les profils transcriptomiques locaux.

Ici, nous décrivons un protocole de microdissection par capture laser de tissu à l’échelle microscopique (~1 000 cellules) à partir de sections hépatiques de souris fixées en PFA et intégrées en OCT, suivi d’une extraction d’ARN et d’une analyse en aval par PCR par transcription inversée quantitative et séquençage ARN. Ces procédures peuvent être réalisées en cinq jours.

Pour guider les lecteurs dans l’évaluation de l’applicabilité de ce protocole, la portée clé et les limites sont résumées ci-dessous. Ce protocole est spécifiquement optimisé pour l’échantillonnage guidé par des hypothèses et guidé par la morphologie de régions histologiques spécifiques à partir de tissus fixés en PFA et embussés en OCT, avec une application principale dans le foie de souris. Il convient aux chercheurs qui doivent corréler des données transcriptomiques spatialement résolues avec des caractéristiques histopathologiques précises préservées dans des spécimens fixes. Ce flux de travail est particulièrement précieux lorsqu’on travaille avec des tissus fixes archivés ou annotés cliniquement lorsque les échantillons fraîchement congelés ne sont pas disponibles. Cependant, ce protocole n’est pas idéal pour les études nécessitant un ARN non fragmenté à haute intégrité (par exemple, nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) > 8), car la fragmentation inhérente à la fixation chimique limite son utilisation dans des applications dépendant de transcrits de longueur complète.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures de manipulation et de soins des animaux ont été réalisées conformément aux directives éthiques et approuvées par le Comité d’éthique animale de la Southern Medical University. La méthode décrite utilisait des souris adultes mâles C57BL/6J et a été maintenue avec un régime riche en graisses, riche en sucre et pauvre en choline pour modéliser la stéatohépatite associée au métabolisme (MASH). Avant la prélèvement des tissus hépatiques, les animaux étaient euthanasiés par décapitation.

1. Préparation d’un échantillon fixé en PFA

  1. Fixez des échantillons de tissu hépatic frais (lobes individuels, épaisseur de 5 mm ou moins) dans 30 mL de PFA froid à 4 % (fraîchement préparé) à 4 °C pendant 24 heures.
    REMARQUE : Il est recommandé de perfuser le foie avec une ×solution de solution séline (PBS, 1×, généralement composée de 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ et 1,8 mM de KH₂PO₄, pH 7,4) pendant 5 minutes, suivie d’une fixation par perfusion avec 4 % de PFA pendant 5 minutes. Alternativement, le tissu peut également être fixé dans une solution à 10 % de formoline.
    ATTENTION : Le fixateur PFA est toxique. Tous les déchets PFA doivent être collectés dans un contenant de déchets chimiques désigné et correctement étiqueté, conformément aux réglementations institutionnelles et locales.
  2. Lavez les échantillons de tissu fixés 3× fois pendant 5 minutes avec une solution PBS 1× sans RNase.
  3. Placez le tissu hépatique fixe dans un tube de 50 mL rempli de 50 mL de saccharose à 30 % (fraîchement préparé dans un PBS stérile à 1×). Maintenez les échantillons à 4 °C pendant 10 à 12 heures.
  4. Retirez les échantillons de tissu de la solution de saccharose. Taillez les échantillons pour obtenir des blocs faciles à manipuler (environ 5 mm × 3 mm × 5 mm), puis intégrez les échantillons dans un cryomold (7 mm × 7 mm × 5 mm) contenant un composé OCT.
    REMARQUE : Ajustez l’orientation des tissus avec des pinces si nécessaire.
  5. Ajoutez du composé OCT par-dessus pour recouvrir complètement les échantillons de tissu, puis placez immédiatement le bloc tissulaire incrusté dans l’OCT sur de l’azote liquide ou de la glace sèche pour congeler rapidement le composé OCT et former un bloc solide. Cette congélation rapide est essentielle pour obtenir des cryosections de haute qualité.
    ATTENTION : Portez des gants résistants à la cryogénie pour protéger les mains lors de la manipulation de matériaux cryogéniques.
  6. Placez les blocs intégrés à l’OCT à -80 °C jusqu’à la cryosection.

2. Cryosection pour microdissection par capture laser

  1. Exposez les lames membranaires de polyéthylène naphtalate (PEN) à la lumière UV pendant 30 minutes, puis endussez les lames de 0,1 mg/mL de poly-L-lysine, puis séchez à l’air. Ensuite, scellez les bords de la glissière de membrane du PEN avec un support de montage neutre.
    REMARQUE : L’irradiation UV et le traitement à la poly-L-lysine des lames à membrane PEN peuvent améliorer l’adhérence des échantillons de tissu aux lames de membrane PEN. Sceller le périmètre avec un milieu de montage neutre empêche l’infiltration d’eau ou la formation de bulles sous la membrane, ce qui est essentiel pour maintenir l’efficacité du LCM.
    ATTENTION : Protégez la peau et les yeux des rayons UV. Portez des lunettes de protection anti-UV ou une visière (homologuée pour la protection UV), ainsi qu’une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des manches longues pour couvrir la peau exposée.
  2. Essuyez toutes les surfaces accessibles du cryostat et tous les outils avec un agent de décontamination RNase, et nettoyez la brosse avec 75 % d’éthanol.
    ATTENTION : Jetez les lingettes et solutions d’éthanol usagées conformément aux protocoles locaux de santé et sécurité environnementale des institutions.
  3. Laissez l’instrument atteindre et se stabiliser à −20 °C.
  4. Prélever les échantillons de foie à -80 °C et les placer dans le cryostat pendant au moins 15 minutes.
  5. Appliquez une fine couche (2-3 mm) de composé OCT sur la surface de l’étape de l’échantillon. Placez l’étape de l’échantillon sur une tablette de congélation rapide (ou dans la chambre du cryostat) pour pré-solidifier la couche OCT.
  6. Appliquez une petite quantité d’OCT sur la couche d’OCT pré-solidifiée à l’étape du spécimen. Récupérez le bloc tissulaire équilibré (de l’étape 2.4) et placez immédiatement le bloc horizontalement sur cette OCT, maintenez-le en place pendant 10 à 15 secondes pour permettre une congélation partielle et une adhésion. Une fois sécurisé, montez l’étage de l’échantillon (avec le bloc de tissu attaché) sur la tête de l’échantillon cryostatique.
  7. Insérez soigneusement la lame entre les plaques de serrage et les plaques arrière d’un côté du cryostat, puis serrez le levier de serrage.
  8. Ajustez l’épaisseur du cryostat à 10 μm.
    REMARQUE : Ajustez l’épaisseur de la tranche selon les besoins du tissu, mais maintenez l’épaisseur entre 5 et 15μm 19.
  9. Découpez et montez les sections directement sur les lames à membrane PEN prétraitées à l’intérieur de la chambre du cryostat maintenue à -20 °C.
    REMARQUE : Chaque lame de membrane PEN peut accueillir 6 à 8 sections de tissu. Il est recommandé que tout le processus de sectionnement soit réalisé en moins d’une heure. Limiter le temps de coupe minimise l’exposition des tissus aux conditions ambiantes, réduisant ainsi les risques de dégradation de l’ARN, de déshydratation tissulaire et d’artefacts morphologiques, essentiels pour préserver la qualité de l’ARN et l’intégrité histologique pour la LCM et l’analyse en aval.

3. Coloration à l’hématoxyline pour la microdissection par capture laser

  1. Décongelez les lames à température ambiante (RT) pendant 20 minutes avant utilisation.
  2. Lavez les lames avec des PBS sans RNase à 1× (3 fois, 10 s chacune).
  3. Immergez les lames tissulaires dans une solution filtrée d’hématoxyline de Mayer (composée de 1,0 g/L d’hématoxyline, 0,2 g/L d’iodate de sodium, 50 g/L de sulfate d’ammonium d’aluminium dodécahydrate, 50 g/L de chloral hydrate et 1,0 g/L d’acide citrique) pendant 5 à 10 s.
    REMARQUE : Faites passer la solution de travail d’hématoxyline à travers une membrane filtrante à seringue de 0,22 μm avant la coloration.
  4. Lavez les lames avec de l’eau sans RNase (3 fois, 10 secondes chacune) pour éliminer la solution résiduelle d’hématoxyline.
  5. Évaluez la qualité de la coloration au microscope.
    REMARQUE : Les noyaux teintés de façon optimale doivent apparaître nets d’un bleu-violet sur un fond clair. Une coloration insuffisante produit des noyaux faibles, tandis qu’une surcoloration masque les détails cellulaires. Seules les lames répondant à ces critères optimaux de coloration doivent passer à l’étape suivante.
  6. Séchez les lames avec du papier absorbant, puis séchez-les complètement à l’air libre (10-15 min).
    REMARQUE : Assurez-vous que les lames sont bien sèches avant de procéder à la LCM. Ensuite, placez les lames dans les tubes centrifugeuses de 50 mL et stockez-les temporairement sur de la glace jusqu’à la réalisation du LCM.

4. Microdissection par capture laser

REMARQUE : La durée de l’expérience LCM pour chaque lame doit être maintenue entre 30 minutes et 1 heure. Il est recommandé que l’ensemble de l’expérience LCM soit réalisée en 4 heures. Cette limite vise à minimiser la dégradation de l’ARN à la RT et à empêcher l’évaporation du tampon de collecte dans le bouchon du tube, ce qui est crucial pour une récupération efficace de l’échantillon. En pratique, le rendement cible d’environ 1 000 cellules provenant de régions morphologiquement définies peut être récolté de manière fiable en 4 heures.

  1. Essuyez les surfaces du banc de laboratoire à l’aide de l’agent de décontamination RNase.
  2. Allumez le contrôleur et laissez le microscope terminer son processus d’initialisation.
  3. Faites pivoter la touche dans le sens horaire de la position Off à la position On pour déclencher le système laser.
    REMARQUE : Le système laser nécessite environ 10 minutes pour chauffer.
  4. Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel LCM, puis attendez que le processus d’initialisation soit terminé.
  5. Insérez un tube PCR stérile de 0,2 mL (tube de collecte) dans le dispositif de collecte.
  6. Ajoutez 10 μL d’un tampon de digestion K de protéinase (voir le tableau des matériaux) au capuchon du tube PCR.
    REMARQUE : Le volume total de tampon de digestion de la proténase-K sera porté à 150 μL lors d’une étape ultérieure (voir Étape 5.4.1) dans le cadre de la procédure complète de lyse.
  7. Chargez le dispositif de collecte dans le porte-échantillons du microscope.
  8. Dans la fenêtre de changement de collecteur de dispositifs , sélectionnez d’abord le bouton Déplacer vers le point de référence . Ensuite, ajustez la mise au point de l’appareil pour obtenir une vue claire du point de référence. Si nécessaire, utilisez les flèches de la fenêtre pour centrer le point de référence dans le champ de vision.
  9. Chargez une section de tissu dans le porte-échantillon, en veillant à ce que la section de tissu soit orientée face vers le bas et que l’étiquette soit à droite.
  10. Sélectionnez la lentille objective de 10 ×, identifiez et délimitez les régions d’intérêt présentant des caractéristiques pathologiques spécifiques, telles que la stéatose microvésiculaire (caractérisée par des hépatocytes présentant de nombreux petits vacuoles cytoplasmiques clairs et des noyaux situés au centre). Ensuite, allez dans le menu Laser et cliquez sur le bouton Calibrer . Confirmez le message à l’écran en sélectionnant Oui et procédez à l’étalonnage.
    REMARQUE : La lentille objective à 10× n’est pas exclusive à la microdissection ; D’autres lentilles à grossissement (par exemple, 20×) peuvent être sélectionnées en fonction de la clarté de l’échantillon et de la résolution souhaitée.
  11. Dans le panneau de contrôle laser, réglez les paramètres de coupe à : Puissance laser = 50, Ouverture (diamètre du faisceau laser) = 5, et Vitesse = 9.
    REMARQUE : Les valeurs de paramètres listées ci-dessus servent de référence pour le système UV-LCM avec les échantillons de tissu utilisés dans ce protocole. Les utilisateurs d’autres systèmes UV-LCM devraient considérer ces paramètres comme point de départ et devront probablement ajuster les réglages de façon empirique. Les réglages optimaux peuvent varier selon le type de tissul, l’épaisseur de la section et d’autres systèmes de MCL.
  12. Dessinez un cercle autour de la zone cible à l’aide de la barre d’outils graphique. Sélectionnez la forme unique, cliquez sur le bouton Start Cut pour effectuer la LCM, puis positionnez le dispositif de collecte pour collecter le tissu disséqué.
    REMARQUE : Le détachement réussi est indiqué par une séparation de la zone sélectionnée, souvent avec un espace visible ou un mouvement de fragment. Pour la cohérence, il faut collecter à partir d’un nombre prédéfini de régions de taille similaire par échantillon. Si la zone cible ne se détache pas automatiquement, cliquez sur le bouton Déplacer et Couper pour couper manuellement l’échantillon avec la souris. Pour une estimation plus précise du nombre de cellules, le logiciel LCM peut enregistrer automatiquement la surface totale de coupe. Cette valeur peut être divisée par la surface moyenne de la section transversale d’une cellule cible pour approximer le nombre total de cellules capturées.
    ATTENTION : Pendant le processus LCM, ne fixez pas directement le faisceau laser pour éviter l’exposition au rayonnement laser.
  13. En option, capturez une image Avant et Après du site de dissection en sélectionnant la commande Enregistrer l’image en tant que dans le menu Fichier. Dans la boîte de dialogue, choisissez un emplacement, un nom de fichier et enregistrez dans un format préféré (par exemple, .tif).
  14. Après avoir collecté le nombre désiré de cellules, cliquez sur le bouton Décharger pour retirer le collecteur du niveau. Avant de sceller le tube PCR, vérifiez que le volume tampon de digestion K de la protéinase K dans le condensateur reste à 10 μL ; reconstituer le tampon si une évaporation s’est produite pendant la LCM (voir l’étape 4.6).
    REMARQUE : Ajouter 10 μL de tampon garantit que la surface du capuchon est complètement mouillée, ce qui facilite le transfert efficace de la pelote de tissu micro-disséquée lors de la centrifugation à l’étape 4.16.
  15. Manipulez soigneusement les tubes de collecte.
  16. Faites tourner brièvement les tubes de collecte et stockez les tubes d’échantillon à -80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN.
    REMARQUE : Répétez les étapes 4,5 à 4,16 pour l’échantillon suivant. Le protocole peut être mis en pause jusqu’à l’extraction de l’ARN.

5. Extraction totale d’ARN d’échantillons micro-disséqués

  1. Essuyez les surfaces du banc de laboratoire à l’aide de l’agent de décontamination RNase.
  2. Transférez les échantillons de LCM du congélateur à -80 °C vers un bain de glace. Si désiré, regroupez différents lots des mêmes échantillons capturés.
  3. Incubez les tubes micro-disséqués à l’envers à 42 °C pendant 30 minutes.
    REMARQUE : Cette inversion garantit que tout tissu restant collé au capuchon après une brève centrifugation (Étape 4.16) est libéré dans le tampon digestif. Cela garantit un transfert maximal d’échantillon dans le tampon avant l’ajustement du volume et la centrifugation à haute vitesse à l’étape 5.4.1.
  4. Isoler l’ARN total des échantillons de LCM à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN standard optimisé pour les tissus fixes (voir le tableau des matériaux).
    1. Ajustez le volume dans chaque tube d’échantillon à un final de 150 μL avec le tampon de digestion de la protéinase K (voir le tableau des matériaux). Faites tourner les tubes à 11 000 × g ( 1 min), puis transférez les échantillons dans un tube stérile de 1,5 mL.
    2. Ajoutez 10 μL de protéinase K (20 mg/mL) par tube, puis mélangez doucement les échantillons à plusieurs reprises. Cela donne un volume final de 160 μL et une concentration finale de K en protéinase d’environ 1,25 mg/mL dans la réaction de digestion par échantillon.
    3. Effectuer une incubation en deux étapes : d’abord à 56 °C pendant 15 minutes, puis 15 minutes à 80 °C. Pendant chaque incubation, faites un vortex rapide sur les tubes toutes les 5 minutes.
      REMARQUE : Pour un flux de travail optimal, utilisez deux bains-marie préchauffés. Si vous utilisez un bain unique, faites une pause après l’incubation à 56 °C : maintenez les échantillons en RT pendant que le bain chauffe à 80 °C, puis continuez.
    4. Placez les échantillons pendant 3 minutes sur de la glace, suivis d’une centrifugation à 20 000 × g ( 15 min).
    5. Aspirez le surnageant clarifié dans un nouveau tube de 1,5 mL, en prenant soin d’éviter le pellet.
    6. Ajoutez 16 μL de tampon d’incubation de DNase et 10 μL d’enzyme DNase I (2,73 unités/μL, voir le tableau des matériaux) à chaque échantillon. Ensuite, mélangez soigneusement le contenu en inversant doucement les tubes. Cela donne un volume final de 186 μL et une concentration finale de DNase I d’environ 0,15 unités/μL dans la réaction de digestion par échantillon.
    7. Effectuez une pirouette rapide pour collecter le liquide résiduel des parois du tube.
    8. Incubez les tubes d’échantillons à la RT pendant 15 minutes.
    9. Transférez 320 μL de tampon de lavage à haute teneur en sel (voir le tableau des matériaux) à chaque échantillon et mélangez soigneusement les échantillons. Cela donne un volume final de 506 μL par échantillon.
    10. Transférez 720 μL d’éthanol absolu à chaque tube, mélangez les échantillons par pipette (sans centrifugation), puis procédez immédiatement. Cela donne un volume final de 1 226 μL par échantillon.
      ATTENTION : L’éthanol absolu est hautement inflammable. Collectez l’éthanol résiduel dans un contenant désigné pour des solvants organiques non halogénés afin d’un bon élimination.
    11. Transférez 700 μL du mélange échantillon dans une colonne de purification (placée dans un tube de collecte de 2 mL, voir le tableau des matériaux). Fermez doucement le couvercle et centrifugez à 8 000 × g ( 15 s).
    12. Éliminez le flux du tube de collecte. Conservez la colonne de purification.
    13. Répétez les étapes 5.4.11 à 5.4.12.
    14. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage à base d’éthanol (voir le tableau des matériaux) à chaque tube d’échantillon. Fermez doucement les couvercles et centrifugez à 8 000 × g ( 15 s). Ensuite, il faut supprimer le flux de passage du tube de collecte.
    15. Répétez l’étape 5.4.14 dans son intégralité, avec la seule modification d’augmenter le temps de centrifugation à 2 minutes à 8 000 × g.
    16. Transférez chaque colonne de purification dans un nouveau tube de 2,0 mL. Centrifugez à 14 000 × g ( 5 min) avec le bouchon ouvert, puis jetez le tube et le liquide résiduel.
    17. Transférez chaque colonne de purification dans un nouveau tube de 1,5 mL. Pipette 16 μL d’eau sans RNase sur la membrane, ferme le capuchon et centrifuge à 14 000 × g ( 5 min) pour faciliter l’élution de l’ARN total.
      REMARQUE : Conservez tous les échantillons d’ARN élués sur la glace pour les étapes 5.5 et 5.6 afin d’éviter la dégradation.
  5. Quantifiez les échantillons d’ARN et vérifiez la pureté (rapport A260/A 280 ) par spectrophotométrie.
    REMARQUE : La mesure de la concentration et de la pureté (rapport A260/A 280 ) à cette étape, ainsi que l’évaluation de l’intégrité à l’étape 5.6, constitue le point de contrôle quantitatif définitif pour une récupération réussie de l’ARN. Un éluat d’ARN clair est attendu.
  6. Effectuer une électrophorèse sur gel d’agarose avec une concentration de gel de 1 % et déterminer le nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) à l’aide d’un système bioanalyseur pour évaluer la qualité de l’ARN.
  7. Stockez les échantillons d’ARN à -80 °C jusqu’à ce qu’il effectue la qRT-PCR ou RNA-Seq.

6. Analyse de l’ARN

REMARQUE : la qRT-PCR est décrite aux étapes 6.1 et 6.2, et l’ARN-Seq est décrite à l’étape 6.3.

  1. Préparez le mélange de réaction de transcription inverse et ajoutez 50 ng d’ARN total par réaction sur la glace. Procéder à la réaction de transcription inverse à l’aide d’un thermocycleur selon les instructions fournies (voir le tableau des matériaux).
  2. Sur glace, préparez un mélange maître PCR quantitatif pour β-actine selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux pour les séquences d’amorce). Effectuez une amplification PCR en temps réel sur un système de PCR quantitative en utilisant le protocole de cycle recommandé par le fabricant avec 10 ng d’ADNc par réaction.
  3. À l’aide d’un kit de brins à faible entrée (voir le tableau des matériaux), construisez des bibliothèques RNA-Seq à partir de 50 ng d’ARN total. Déterminer la taille et la concentration de la bibliothèque avec un système de bioanalyseur (voir le tableau des matériaux) puis effectuer un séquençage par épreuves sur une plateforme à haut débit (voir le tableau des matériaux).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le flux de travail expérimental, qui comprend la fixation du PFA, la déshydratation à 30 % de saccharose, l’inclusion et la cryosection de l’OCT, la coloration par hématoxyline, l’identification et la collecte précise de la région cible (~1 000 cellules) par LCM, la lyse cellulaire, l’isolation de l’ARN, les métriques de contrôle qualité de l’ARN et les deux principales applications analytiques, est présenté à la Figure 1. La section hépatique colorée à l’hé...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La force de la MCL réside dans sa capture précise et in situ de cellules ou régions tissulaires sélectionnées, facilitant l’étude de zones spécifiques au sein d’un tissu hétérogène. Mais son faible rendement d’échantillon, son procédé chronophage, son coût élevé et le besoin d’équipements spécialisés limitent l’application généralisée de cette technique enlaboratoire. Dans cette étude, le protocole LCM-ARN a été établi pour surmonter des limitations histo...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été en partie soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82070589), de la Fondation des sciences naturelles du Guangdong (2022A1515010218) et du projet de plan scientifique et technologique de Guangzhou (206077078001) au Professeur Yan Wang. Nous remercions le Centre de recherche biomédicale de la Southern Medical University pour son soutien technique et son accès au système de microdissection par capture laser.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< fort>Matériel
Tubes à paroi fine de 0,2 mlAxygènePCR-02-CTubes pour la collecte de LCM
Tube centrifugeuse de 1,5 mLAxygène339653
4 % de paraformoldéhydeLeageneDF0135
Tube centrifugeuse de 50 mLThermoFisher Scientific339653
DEPC (pyrocarbonate diéthylique)SigmaD-5758
Ensemble de digestion DNase IQiagen73504Composant du kit FFPE RNeasy comprend la solution d’origine DNase I et le tampon DNase Booster
Éthanol (100 %)Thermo Fisher ScientificBP2818Purifié pour la biologie moléculaire
Tampon de lavage à base d’éthanolQiagen73504RPE tampon (composant du kit FFPE RNeasy)
Tampon de lavage à haute teneur en selQiagen73504RBC tampon (composant du kit FFPE RNeasy)
Lames microtomes à profil basLeica Biosystems819
Mayer' s hématoxylineLeageneDH0001
Composé OCTSakura4583
Culasse recouverte de membrane en PENLeica11505188
Solution physiologice tamponnée au phosphateLeageneCC0010Sans DNase/RNase
Poly-L-lysineMacklinP875131S
Tampon de digestion de la proténasase KQiagen73504PKD tampon (composant du kit FFPE RNeasy)
Colonne de purificationQiagen73504Colonne de spin RNeasy MinElute (composante du kit FFPE RNeasy)
Mix master PCR quantitatifBiographie de TakaraRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Kit de transcription inverséeQiagen205411Kit de transcription inversée QuantiNova
Kit d’extraction d’ARNQiagen73504RNeasy FFPE Kit
Kit de séquençage ARN (faible entrée, brin à bas)Biographie de Takara634412Kit SMARTer à séquence totale d’ARN-seq - entrée pico mammifère v2
Agent de décontamination RNaseSolarbioSR0040Nettoyage
SaccharoseMacklinS818049
Animaux et Régime
Souris : C57BL/6JCentre des animaux de laboratoire de la province du Guangdong03
< Régime > Régime Spécial & Régime Fort Eau en boisson
Régime riche en graisses et pauvre en choline (régime de base)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MMacronutriments : protéines, 14 kcal ; glucides, 26 kcal % ; Gras, 60 kcal %)
Eau potable complétée par sucreMacklinN/A (préparé en interne)Un mélange de D-glucose (Macklin, Cat# F87500) et de D-fructose (Macklin, Cat# S818049) a été ajouté à l’eau potable en autoclav à une concentration finale de 42 g/L, avec un ratio glucose/fructose de 55:45 (v/w)
< Amorces > souris
&beta ;-actin (Avant : AGAGGGAAATCGTGCGTGAC )Séquençage BGIPersonnaliséHPLC purifié
&beta ;-actin (Revers : CAATAGTGATGACCTGGCCGT)Séquençage BGIPersonnaliséHPLC purifié
Équipement
Microtome cryostatLeica BiosystemsCM3050 S
Système de bioanalyseurAgilentG2939BA
Plateforme de séquençage à haut débitIllumina ; Inc.Système NovaSeq 6000
Système de microdissection par capture laserLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Système de PCR quantitativeBiosystèmes appliquésSystème PCR en temps réel QuantStudio 5
SpectrophotomètreThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Cycleur thermiqueBioRadT100
Logiciel
Adobe Illustrator CC 2019 (version 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (version 8.3.0)Logiciel GraphPadhttps://www.graphpad.com

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

Articles connexes