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Le flux expérimental pour évaluer l’efficacité des inoculants microbiens dans l’amélioration de la tolérance au stress hydrique chez la laitue romaine (Lactuca sativa L. var. Paspartu) est résumé à la Figure 1. Le protocole intégrait une surveillance continue de régimes d’irrigation précis avec l’acquisition périodique de données physiologiques et thermiques. Deux produits microbiens distincts ont été utilisés : (I) le consortium microbien, un consortium complexe de 67 souches comprenant le PGPR, des actinomycètes et des champignons bénéfiques, conçu pour agir comme tampon physiologique par colonisation racinaire et sécrétion d’exopolysaccharides (EPS) ; et (II) Trichoderma harzianum, un inoculant à souche unique de Trichoderma harzianum visant à induire une résistance systémique et à modifier l’architecture racinaire. Les réactifs, équipements et logiciels utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Inoculation microbienne
Un régime d’inoculation standardisé a été mis en place pour les deux traitements microbiens, comprenant six applications imbibées de sol ciblant la rhizosphère à l’aide de micropipettes de haute précision pour simuler des doses à l’échelle du champ. La première phase a eu lieu pendant le stade des semis, à 5 et 15 jours après le semis (DAS). À 30 DAS, les semis ont été transplantés dans des gouttes à cavité plus grandes, la deuxième phase d’inoculations étant effectuée 1 jour après la transplantation (DAT), suivie d’applications successives à 7, 15 et 20 DAT.
Pour le consortium microbien, les dosages ont été ajustés selon la phénologie des plantes : les deux premières applications ont été appliquées à 500 g/ha (3 mL/plante), suivies d’une dose à haute concentration de 2 kg/ha lors de la transplantation, et se terminant par trois doses d’entretien de 300 g/ha. De même, T. harzianum a été appliqué à 1 L/ha lors des deux premières étapes, 3 L/ha lors de la transplantation, et 1 L/ha lors des trois dernières applications. Cette approche progressive a été conçue pour assurer une colonisation radiculaire robuste et maintenir le rôle de la population microbienne comme tampon physiologique tout au long des périodes critiques de croissance et d’induction du stress.
2. Préparation des cultures
Des graines de laitue romaine certifiées (Lactuca sativa L. var. Paspartu) ont germé dans des plateaux en polystyrène à 311 cavités (11 mL par cavité) utilisant un substrat professionnel à base de tourbe à une profondeur de 1 cm. La germination a été réalisée dans une chambre bioclimatique contrôlée, maintenue à une température comprise entre 15 °C et 22 °C et une humidité relative de 60 % à 70 %. À 90 % de germination (environ 3 à 5 jours après le semis), les semis étaient transplantés dans des plateaux plus grands avec une capacité de motte racinaire de 55 mL afin de permettre un développement racinaire sans restriction (Figure 2 et Figure 3). L’essai a été organisé selon un plan entièrement randomisé (CRD), avec 9 unités expérimentales (plateaux) et 20 semis par plateau. Cette configuration était structurée pour accueillir une organisation factorielle 3 × 3 (3 traitements microbiens × 3 régimes d’irrigation). Les propriétés physico-chimiques détaillées du substrat et la programmation spécifique des chambresbioclimatiques 14sont fournies dans la Figure 3, le Tableau Supplémentaire 1, le Tableau Supplémentaire 2 et le Tableau Supplémentaire 3.
Les plateaux expérimentaux ont été distribués selon une disposition entièrement aléatoire à l’intérieur de la chambre bioclimatique afin d’éliminer les effets de bord et d’assurer une exposition uniforme. La chambre était programmée pour simuler des conditions dynamiques de type champ, utilisant un régime de haute température pour reproduire la contrainte thermique en champ ouvert. Pendant la phase végétative, les paramètres environnementaux ont été maintenus dans une plage d’humidité relative variable, et une photopériode de 9 heures assurée par un éclairage LED à haute intensité (réglé au-dessus de 50 % de la capacité maximale pour garantir un rayonnement photosynthétiquement actif adéquat)15. Après la phase d’établissement, le programme environnemental a été ajusté pour refléter les besoins croissants des traitements à déficit hydrique, comme illustré dans les transitions atmosphériquespar étapes 15 (Figure 4 et Figure 5). Les consignes diurnes/nocturnes spécifiques pour la température, l’humidité et l’intensité lumineuse sont détaillées dans les Tables Supplémentaires 1 et Supplément 2 afin de simplifier le protocole principal.
La stratégie de fécondation a été conçue pour répondre aux besoins phénologiques spécifiques de la laitue romaine, maintenant un flux nutritif équilibré tout au long du cycle végétatif. Pendant le stade de semis (12 à 24 DAS), les nutriments ont été fournis via des applications ciblées de nitrate de potassium (KNO3), phosphate monopotassique (KH 2PO4) et nitrate de calcium (Ca(NO3)2). Pour favoriser l’établissement précoce, un biostimulant commercial a été complété durant les 24 premiersjours 16.
De 26 DAS jusqu’à l’évaluation finale à 76 DAS, le programme de fertigation est passé à un régime de maintien où le biostimulant a été éliminé pour isoler les effets spécifiques des inoculants microbiens. Toutes les applications ont été calibrées pour maintenir une conductivité électrique (CE) et un pH optimaux dans la rhizosphère. Le calendrier chronologique complet des concentrations minérales et des volumes de dosagespécifiques 16est détaillé dans le tableau supplémentaire 3.
3. Traitement par micro-organismes
Pour évaluer l’efficacité des interventions biologiques contre le stress hydrique, trois traitements distincts ont été établis : (I) consortium microbien, un consortium microbien à haute diversité comprenant 67 souches bénéfiques, dont les Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR), les actinomycètes et les champignons ; (II) T. harzianum, une formulation spécialisée à souche unique de Trichoderma harzianum ; et (III) un contrôle non inoculé. Ces traitements ont été sélectionnés en fonction de leur potentiel de tolérance systémique induite (IST), principalement par des mécanismes tels que la modification de l’architecture racinaire, la production d’ACC-daminase et la sécrétion d’exopolysaccharides (EPS).
L’inoculation suivait une approche stratégique progressive. L’application initiale (3 mL par plante) a été effectuée par micropipette de haute précision directement dans la rhizosphère au second stade véritablement feuillaire afin d’assurer une colonisation précoce des racines. Les applications ultérieures ont été calibrées à l’échelle du champ (simulant une densité de 75 000 plantes/ha). Pour T. harzianum, une concentration de 2 L/ha a été appliquée, tandis que le consortium microbien a été administré à 1 kg/ha. Ces formulations étaient dissoutes dans l’eau d’irrigation et appliquées tous les 15 jours afin de maintenir une population microbienne stable servant de tampon physiologique tout au long du cyclevégétatif 17.
4. Différents traitements d’irrigation
Pour évaluer la plasticité physiologique et agronomique de L. sativa dans des conditions hydriques variables, trois régimes d’irrigation ont été mis en place basés sur le remplacement de l’évapotranspiration des cultures (ETc). La teneur volumétrique en eau était calibrée en fonction de la capacité de champ (FC) du substrat afin d’assurer une induction de contrainte précise. Les régimes étaient définis comme suit : (I) Contrôle/Irrigation par puits (CC-100 % ETc), où l’évapotranspiration complète était renouvelée ; (II) déficit hydrique modéré (75 % ETc), conçu pour induire une limitation hydraulique intermédiaire ; et (III) déficit hydrique sévère (50 % ETc), visant à générer un stress hydrique critique. L’irrigation a été administrée quotidiennement après avoir capturé des images thermiques à l’aide de pipettes graduées afin d’assurer un remplacement précis du volume d’eau perdu lors de l’évapotranspiration18.
5. Enregistrement des données et des images
Pour évaluer la répartition thermique des centrales et l’état de l’eau, des images thermiques infrarouges ont été capturées quotidiennement du lundi au vendredi tout au long de la période expérimentale. Tous les enregistrements photographiques ont été réalisés entre 12h00 et 14h00 afin de standardiser les mesures pendant la période de transpiration maximale et d’intensité solaire. Il est essentiel de prendre ces images immédiatement avant les traitements d’irrigation quotidiens afin d’enregistrer le stress hydrique cumulé subi par les plantes au cours du cycle de 24 heures précédent. Pour l’acquisition d’images, la caméra thermique infrarouge était connectée à un appareil mobile et maintenait une orientation perpendiculaire par rapport à l’arrière des plants de laitue à une distance constante de 60 à 70 cm. Le logiciel était configuré avec une palette thermique multicolore dans laquelle les gradients de température sont représentés du plus bas au plus élevé : en commençant par le violet (le plus froid), en passant par le bleu royal, turquoise, vert (point médian), jaune, orange, et enfin rouge (le plus chaud). Dans l’interface logicielle, la zone spécifique du plateau contenant la canopée de la plante était sélectionnée manuellement pour capturer les données thermiques. Cette échelle de couleurs sert d’indicateur physiologique : les plantes bien hydratées présentent des températures de canopée plus fraîches (violet/bleu) dues à la transpiration active, tandis que les plantes déshydratées présentent des températures de canopée plus élevées (orange/rouge) dues à la fermeture des stomates et à un refroidissement évaporatif réduit. Par la suite, ces images haute résolution ont été traitées à l’aide de la fonction de mesure en trois points sur des régions d’intérêt spécifiques (ROI) afin d’extraire des valeurs précises de température de la canopée (Tc) pour le calcul de l’Indice de Stress Hydrique des Cultures (CWSI).
Si le CWSI est :
0, alors la culture n’est pas sous stress hydrique
1 alors la culture subit un stress hydrique sévère
Où :
TC est la température de la canopée des cultures, mesurée par imagerie infrarouge. Tw est la température de la canopée en cas de conditions sans stress hydrique. Td est la température de la canopée sous des conditions de stress hydriquemaximal 19.
Les indicateurs de la croissance, du développement et de l’état physiologique des plantes, tels que la hauteur, le nombre et la température des feuilles, évalués à l’aide de la thermographie infrarouge, sont présentés dans le Tableau Supplémentaire 4 , accompagnés des variables de l’étude et des définitions conceptuelles et opérationnelles utilisées dans l’expérience. La combinaison de ces variables a permis une évaluation complète de l’impact des traitements expérimentaux sur la performance physiologique et le développement de chaque plante.
6. Analyse des données
Les données physiologiques et morphologiques ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle pour chaque régime d’irrigation afin de déterminer l’effet des différents traitements microbiens. Toutes les procédures statistiques étaient réalisées à l’aide de logiciels statistiques. Avant de réaliser l’analyse inférentielle, les exigences fondamentales pour les statistiques paramétriques ont été vérifiées afin d’assurer la fiabilité des résultats. La normalité des résidus a été confirmée par le test d’Anderson-Darling (p > 0,100), indiquant la normalité. De plus, l’homogénéité des variances a été validée à l’aide du test de Levene (p = 0,989), confirmant une forte homoscédasticité entre groupes. Puisque les deux hypothèses étaient remplies, le test post-hoc HSD (Honestly Significant Difference) de Tukey a été utilisé pour identifier des différences significatives (p < 0,05) entre les moyennes du traitement. La plante individuelle était définie comme l’unité expérimentale pour toutes les évaluations statistiques.
