Visualisation des nectaires foliaires et bractéaux du coton à l’aide de la microscopie numérique pour améliorer la précision des scores et la préservation des données

Summary

Ici, nous illustrons les processus étape par étape pour le phénotypage des nectaires foliaires et bractéaux chez les plants de coton à l’aide d’images générées par microscopie numérique. C’est une méthode efficace pour évaluer les nectaires des feuilles et des bractées du coton, car les informations peuvent être collectées et conservées sous forme d’images numériques.

Abstract

Les nectaires sont des glandes distinctes productrices de nectar, présentes chez de nombreuses espèces végétales. Les nectaires présentent des structures et des fonctions diverses. Dans le coton, la notation traditionnelle du caractère nectaire est sujette à des erreurs, peu fiable et présente des limites, car les phénotypes de ce trait ne sont souvent pas visibles à l’œil nu. L’expression des traits nectaires est contrôlée par les gènes, Ne1 et/ou Ne2. De plus, l’expression des traits peut être influencée par l’environnement et les stades de croissance, soulignant la nécessité de méthodes de notation précises. En particulier, la notation phénotypique par images numériques permet une méthode de notation plus précise des nectaires. Cette méthode surmonte les limites de la notation traditionnelle en générant des images haute résolution. De plus, cela facilite l’identification et la différenciation des différences fines d’expression des traits nectaires tout en préservant ces images numériques pour une référence future. Cette méthode de notation de phénotypage décrite ici peut être facilement adaptée pour évaluer d’autres traits de la plante tels que les glandes, les poils et la couleur. Ces méthodes de pointage peuvent être adaptées à d’autres espèces végétales. Dans cet article, nous expliquons la procédure étape par étape pour prélever des échantillons sur le terrain ou la serre, les disséquer pour les observer à l’aide de la microscopie numérique, et conserver ces images pour une analyse de notation future. Pour cette méthode, nous utiliserons, par exemple, le calcul d’échantillons foliaires et bractéaux de plants de coton afin de différencier la présence de nectaires (pleinement développés, réduits et vestigiaux) de l’absence de nectaries.

Introduction

Les plantes possèdent des glandes spécialisées appelées nectaires qui synthétisent et produisent du nectar chez la plupart des angiospermes, certaines fougères, et certaines^gymnospermes 1,2,3,4. Les nectaires sont classés en trois types, à savoir mésosophyllaire, trichomatique et épithélial, selon l’origine des cellules produisant^{le nectar 5}. Les nectaires du coton sont des stomates modifiés composés de tricomes glandulaires appelés papilles et classés comme trichomatiques^{de type 5,6}. La plupart des espèces de Gossypium possèdent des nectaires ; cependant, le nombre de nectaires présents dans ce genre varie selon les espèces^{d’une espèce à l’espèce 7}. Les nectaires floraux (FN) sont plus courants que les nectaires extrafloraux (EFN) chez^{les plantes 8}. Ces nectaires peuvent se trouver partout sur la plante sauf aux^{racines 1,2}. Par exemple, Gossypium hirsutum présente à la fois des nectaires floraux et^{extrafloraux 9}. Les plants de coton domestiques présentent trois nectaires floraux supplémentaires et un nectaire^{floral 10}. Les trois nectaires floraux supplémentaires sont foliaire, bractéal et^{circumbractéal 11}. Le nectaire foliaire est végétatif et est généralement présent sur les feuilles du côté inférieur de la nervure centrale, tandis que les nectaires bractéaux et circumbractés sont reproducteurs et se développent à la base de la bractée et à la surface du calice abaxial. Le nectaire floral est associé à une fleur, qui se développe sur la surface adaxiale (supérieure) du calice. Ce trait nectaire est contrôlé par un seul locus^{génique 12}. Des études menées par deux groupes de recherche indépendants ont identifié que le trait nectaire est contrôlé par un gène, Ne1 du génome A ou Ne2 du génome D, cartographié sur les chromosomes 12 et 26, respectivement^{12 et 13}. Ce trait n’est exprimé que dans une condition double récessive, ce qui signifie que seule une condition homozygote récessive exprimera ce trait sans nectarie.

En plus de ces gènes, les conditions environnementales et les stades de croissance jouent un rôle dans le contrôle du degré d’expression. Par conséquent, il doit exister une méthode précise pour évaluer ce trait. L’étude actuelle se concentre sur le phénotypage des nectaires foliaires et bractéaux dans le coton. Les plantes présentant des nectaires visibles produisant du nectar sont notées comme nectariées, tandis que les plantes dépourvues de ce trait sont notées comme sans nectari 1,2,3,4. L’objectif principal de cet article est de présenter des méthodes de notation précises du caractère nectaire en utilisant la technologie de microscopie numérique. Le score traditionnel par observation visuelle directe ne peut pas facilement détecter les différences dans la variation d’expression du trait nectaire in situ à l’œil nu. Ces différences subtiles dans l’expression des traits nectaires peuvent être visualisées à l’aide de la microscopie numérique. Pour illustrer, dans le nectaire de feuilles de coton, la grille d’évaluation suit une échelle standard de 1 à 4 où 1 représente l’absence de nectaire, 2 représente une bosse sur le phénotype veineux, 3 représente des coussinets ou des crêtes sous-développées sans nectar, et 4 représente des nectaires entièrement formés/complets avec des coussinets et crêtes^{clairs 13}. Cette notation phénotypée a été générée à partir d’images numériques des nectaires foliaires [en utilisant des images numériques du côté abaxial (inférieur) de la nervure centrale de la feuille]. En général, l’absence de nectaires est notée comme 0, mais pour la signification statistique, la valeur 0 ne peut pas être utilisée et remplacée par la valeur 1. Ainsi, la plage de notation du phénotypage a été modifiée à 1-4 à partir de la classification standardisée de^{0-4 13}. La grille d’évaluation pour les fleurs suit un schéma de notation similaire de 1 à 4 : 1 représente des glandes sans nectari, sans proéminences ni crêtes, 2 pour les glandes obfusquées où les nectaires n’ont que des marques subtiles sur les coussinets et pas de nectar, 3 pour les glandes mal formées avec des crêtes et/ou coussinets faibles ou absentes, et 4 pour des nectaires entièrement formés avec du nectar. Ce schéma de notation montre 4 pour les phénotypes nectariés (homozygote/hétérozygote dominant pour l’un des gènes), 3, 2 pour l’expression différentielle du trait nectaire comme chez hétérozygote, et 1 pour les sans nectari (homozygote récessif pour les deux gènes).

De même, des fleurs sont collectées et disséquées comme décrit étape par étape dans cet article afin de collecter des images numériques pour évaluer les nectaires bractéaux. Ce phénotype peut être visualisé au microscope pour un score précis qui peut être stocké sous forme d’images numériques. Dans le coton, les caractéristiques nectaires attirent non seulement les pollinisateurs, mais attirent aussi les ravageurs qui provoquent des pertes de rendement¹⁴. Pour résoudre ce problème, les sélectionneurs ont sélectionné des plantes sans caractéristiques nectariques (sans nectari) comme alternative pour contrôler naturellement les ravageurs sans recourir à des pesticides chimiques^9,15. Le trait sans nectari a été initialement introgressé de Gossypium tomentosum à Gossypium hirsutum (coton cultivé des hautes terres)⁸. Cette méthode de notation est particulièrement utile pour identifier la ségrégation des caractères sans nectari dans les populations générées par le croisement de parents nectariés avec des parents sans nectari. En raison de ces croisements de parents divers, F₂ (Deuxième génération filiale) présente différents génotypes d’homozygotes nectariés, hétérozygotes nectaires et homozygotes sans nectari. Un seul gène dominant est nécessaire pour l’expression des traits nectaires, qui suit le rapport de ségrégation de 15:1 (9:3:3:1). Ainsi, 1 sur 16 exprimera le caractère sans nectari dans une condition homozygote récessive avec génotype ne1ne1ne2ne2. Cependant, les chercheurs dans les programmes de sélection ont observé plus de lignées sans nectari que le ratio attendu de 1 sur 16. Cela signifie que le trait nectaire s’exprime lorsque les gènes sont exprimés comme Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. Le schéma diversifié d’expression des traits nectaires dans ces populations de nectaries homozygotes (Ne1Ne1Ne2Ne2), hétérozygote nectarié (Ne1ne1Ne2ne2), et homozygotes sans nectari (ne1ne1ne2ne2) les plantes peuvent être parfaitement notées en détectant les changements visualisés dans les images numériques^12,13. Comme les plantes hétérozygotes avec un nectaire réduit peuvent ne pas présenter visuellement le trait nectarique et ressembler au caractère sans nectaire, le phénotypage visuel pose des défis dans la sélection fiable de ce trait. Ces problèmes s’aggravent en fin de saison de croissance, lorsque les nectaires ne sont pas présents dans certains cultivars de coton. Les différences entre les plantes hétérozygotes et les plantes homozygotes sans nectari peuvent être facilement détectées par imagerie numérique, car les plantes hétérozygotes peuvent présenter de petits ou réduits nectaris tandis que les plantes homozygotes sont totalement dépourvues de ce trait. Phénotypiquement, la présence de nectaire est classée comme nectariée (homozygote/hétérozygote avec au moins un gène dominant), la présence de petits nectaires ou vestigiaux comme hétérozygotes, et l’absence de nectaires comme plantes homozygotes sans nectari. La notation numérique des images a réduit l’inexactitude des plantes hétérozygotes en tant que plantes sans nectari. De même, le stade de pleine floraison est préféré lorsqu’il y a une expression maximale des traits. Ainsi, des échantillons de feuilles et de fleurs ont été prélevés à ce stade pour réaliser ces expériences de notation de phénotypage afin d’obtenir une notation précise et fiable des traits nectaires. De plus, la visualisation des caractéristiques nectaires à l’aide de la microscopie numérique prévient ou réduit les faux positifs de populations sans traits nectaires. Cette évaluation phénotypique du caractère nectaire est également utilisée dans des études de cartographie pour identifier les marqueurs ADN associés au caractère sans nectari que les sélectionneurs peuvent utiliser pour la sélection assistée par marqueurs (MAS) du caractère sans nectari¹³. Cette technique de pointage peut être étendue à d’autres espèces végétales en plus de l’étude d’autres caractéristiques telles que les glandes, les poils et la couleur. Dans l’ensemble, la notation numérique des images résout non seulement le problème de l’inexactitude de la notation des traits nectaires en fournissant des images haute résolution, mais permet aussi d’identifier les changements subtils d’expression et de stocker les images numériques pour une utilisation future. Le coton avec un trait sans nectari peut être utilisé pour le biocontrôle des nuisibles, en plus de répondre aux questions de recherche sur la manière dont ce trait encourage les interactions bénéfiques avec les insectes.

Protocol

1. Échantillonnage en serre ou champ de feuilles (Figure 1)

1. Préparez des sacs zip-lock pour échantillons avec des pièces d’identité d’échantillon. Conservez les sacs d’échantillons à température ambiante jusqu’à utilisation.
2. Placez la glacière au réfrigérateur un jour avant la collecte de l’échantillon. Placez une poche de glace du congélateur au fond de la glacière. Placez un plateau en plastique sur la poche de glace dans la glacière.
   REMARQUE : N’importe quel refroidisseur portable peut être utilisé à cet effet. Placez la poche de glace dans la glacière suivie d’un plateau en plastique (cette séparation évite les dommages causés par congélation, qui se produit par contact direct de l’échantillon avec la glace) avant de transporter la glacière vers le site de prélèvement.
3. Transportez les sacs de refroidissement et les sacs ziplock étiquetés vers la serre/champ pour la collecte des échantillons. Des pulvérisations régulières étaient prévues pour les plantes de champ afin de collecter des échantillons sans nuisibles. De même, pour les plantes en serre, des pulvérisations régulières et des calendriers d’engrais ont été suivis pour les plantes en bonne santé.
4. Prélevez de jeunes feuilles de plantes individuelles de 8 à 12 semaines en serre ou en coton, dans les sacs d’échantillons indiqués.
   1. Sélectionnez le stade de floraison moyenne pour sélectionner l’échantillon en raison de la plus haute expression du caractère nectaire à ce stade. Sélectionnez les jeunes feuilles de toutes les plantes à ce stade de développement. En plus de l’influence génétique et environnementale, le trait nectaire est également influencé par le stade de développement.
   2. Pour maintenir le stade de développement constant afin de comparer les différents génotypes au sein de la population F₂ , il faut collecter des échantillons de feuilles uniformément à un stade afin de restreindre la comparaison à ce stade. Utilisez la taille des feuilles de 5 à 7 cm comme référence, mais les jeunes feuilles de la même taille peuvent être collectées à partir de tous les échantillons. Les vieilles feuilles présentent une expression de trait nectarique, mais dans certaines lignées, ce trait ne s’exprime pas aux stades ultérieurs du développement. Pour éviter cette variation et améliorer la cohérence de la collecte des données, suivez ces instructions lors de la collecte des échantillons.
5. Prélever le tissu foliaire et le placer dans le sac correspondant. Prélever au moins 2 feuilles par échantillon de plante.
6. Pour le tissu foliaire, sélectionnez des feuilles saines de 5 à 7 cm de largeur du limbe, à partir de la branche supérieure de la plante.
   REMARQUE : Les jeunes feuilles présentes sur les branches supérieures sont préférées pour tous les échantillons. Ce type de collecte d’échantillons ne limite pas seulement l’échantillonnage à un stade de développement spécifique, mais réduit aussi les erreurs de phénotypage en maintenant le type d’échantillon constant. D’autres paramètres incluent un accès facile et des feuilles en bonne santé. Une comparaison cohérente des données sera effectuée lorsque plusieurs feuilles de plantes seront collectées au même stade de développement afin d’identifier les différences phénotypiques basées sur le génotype dans la population.
7. Placez chaque sac d’échantillon scellé avec le tissu foliaire dans la glacière. Transportez la glacière au laboratoire.
8. Transférez des échantillons individuels au réfrigérateur pour maintenir des conditions de refroidissement de 4 °C. Conservez les échantillons au réfrigérateur jusqu’à l’imagerie numérique du nectaire. Les feuilles peuvent être stockées jusqu’à 2 jours pour l’imagerie numérique, mais il est préférable de prendre des images le même jour ou le lendemain.
9. Pour le dépistage d’un grand nombre d’échantillons de feuilles, prélever les échantillons par lots afin de terminer l’imagerie dans un délai d’un jour suivant leur récolte. Prélève des échantillons par lots de 10 à 20 ou utilise plusieurs refroidisseurs pour éviter les dommages tissulaires ou le repliement des tissus. Il convient de faire attention à la collecte d’échantillons pour obtenir de bonnes images numériques.

2. Échantillonnage de fleurs en serre/champs (Figure 1)

1. Suivez les étapes 1.1 à 1.6. Récoltez des fleurs d’une serre de 8 à 12 semaines ou d’une plante de coton cultivée sur le champ. Collectez au moins 2 fleurs par échantillon de plante.
   1. Récoltez généralement des fleurs sur les branches du haut lorsque les plantes sont en pleine floraison. Le trait nectaire montre la plus forte expression au stade de floraison moyenne.
2. Cueillez des fleurs saines. Placez chaque sac d’échantillon scellé avec au moins deux fleurs dans la glacière. Transportez la glacière au laboratoire.
3. Transférez des échantillons individuels au réfrigérateur pour maintenir des conditions de refroidissement de 4 °C. Conservez les échantillons au réfrigérateur jusqu’à l’imagerie numérique des nectaires bractéaux.
   1. Traiter les échantillons le jour même ou le lendemain après la collecte. Prélevez des échantillons de fleurs, conservez-les à 4 °C et traitez les nectaires bractéaux le jour même. Collectez les fleurs produites plus tard le lendemain ou plus tard dans la semaine et procédez à l’imagerie numérique des nectaires bractéaux le jour même.

3. Installation initiale du microscope numérique (Figure supplémentaire 1)

REMARQUE : D’autres microscopes comparables peuvent être utilisés pour capturer et stocker numériquement les images.

1. Allumez le microscope (VHX 600) et effectuez les premières étapes. Placez une feuille blanche A4 à moitié pliée qui correspond à la taille de l’étage du microscope.
2. Ajustez la lumière sur la plateforme/la scène du microscope en utilisant les petits boutons lumineux présents sur la manette de la console.
3. Tournez l’interrupteur (petit bouton de la console) au maximum pour obtenir un maximum de lumière et de luminosité (gros bouton de la console) en moyen haut en tournant le bouton de la console aux trois quarts.
4. Le logiciel intégré VHX 600 montre des options pour ajuster l’objectif sur l’écran de l’ordinateur. Ajustez l’objectif à un grossissement de 10x en sélectionnant l’option 10x sur l’écran. Activez l’interrupteur d’alimentation du moniteur sur l’écran avant de l’ordinateur, et le menu principal apparaîtra, affichant les options d’objectif et d’enregistrement d’image.
5. Prélève un petit nombre d’échantillons (3 à 5) du réfrigérateur dans le refroidisseur pour l’imagerie numérique. Placez la glacière avec des échantillons à côté du microscope.
6. Gardez la planche à découper et la lame stérile sur le plan de travail près du microscope. Prenez un échantillon dans la glacière et retirez le tissu échantillon pour procéder à l’imagerie numérique (Figure 1).

4. Imagerie numérique et notation du nectaire des feuilles (Figure 2)

1. Suivez les étapes 1 et 3. Ouvrez le sac ziplock pour échantillons et placez l’échantillon de feuilles sur la planche à découper. Coupez le pétiole de la feuille à l’aide d’une lame stérile.
   REMARQUE : Pour une utilisation sûre des lames, portez des gants et gardez les bords tranchants de la lame tournés à l’opposé de vos doigts, le tissu étant positionné entre les doigts lors des incisions.
2. Transférez le tissu foliaire sur la feuille blanche prédécoupée placée sur la scène. Retournez le tissu foliaire au centre de l’étage du microscope avec le côté abaxial vers le haut.
3. Concentrez-vous sur la nervure centrale de la feuille en faisant légèrement tourner les réglages grossiers et fins des boutons du microscope. Continuez à ajuster jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de flou dans l’image.
4. Comme le nectaire est présent à l’extrémité inférieure de la nervure centrale, maintenez-le centré là où la nervure centrale et les nervures ultérieures divergentes ont été observées. Gardez la feuille centrée dans la mise au point sur la scène.
   REMARQUE : Un seul nectaire de feuille est observé dans le coton domestique, tandis que les types sauvages présentent trois nectaires, un sur la nervure centrale et un sur chaque nervure latérale de chaque côté de la nervure centrale (nectaires totaux :3).
5. Ajustez les ajustements grossiers et fins du microscope pour améliorer la clarté de l’image numérique. Faites tous les ajustements d’image pour capturer et sauvegarder l’image nectaire de la feuille.
   1. Pour éviter la réflexion de la lumière sur l’image numérique, éteignez toutes les lumières et enregistrez l’image sur l’écran de l’ordinateur. Éteignez toutes les lumières de la pièce et utilisez une lampe de table pour traiter chaque échantillon. Après toutes les étapes, éteignez la lampe et laissez allumée uniquement la lumière du microscope pour enregistrer l’image.
6. Sauvegardez l’image dès que le programme affiche une fenêtre montrant plusieurs options à sauvegarder. Sauvegardez l’image (en étiquetant chaque image) avec le numéro d’identification de l’échantillon. Notez l’image numérique du nectaire foliaire à 1, 2, 3 et 4 en fonction du phénotype du nectaire. Mettez à jour votre fiche de notation pour chaque identification d’échantillon.

5. Imagerie numérique et évaluation du nectaire bractéal (Figure 3)

1. Suivez les étapes 2 et 3. Transférez un petit nombre d’échantillons de fleurs (2-3) pour imagerie. Sortez l’échantillon de fleur du sac zip-lock.
2. Retirez les bracteées de la fleur à l’aide de pinces ou manuellement. Posez la fleur sur la planche à découper propre. Utilisez une lame stérile pour couper la tige de la fleur. Utilisez une lame stérile pour faire une incision droite le long du bord des bractées retirées.
3. Placez le tissu à l’envers (avec le pétiole vers le haut) sur la feuille blanche prédécoupée posée sur l’étage du microscope.
4. Utilisez des réglages grossiers et fins pour améliorer la clarté de l’image affichée à l’écran. Effectuez tous les ajustements d’image et cliquez sur le bouton d’enregistrement de la manette de la console pour capturer l’image de la feuille.
   1. Ajustez l’image en mettant le petit bouton ou l’interrupteur au maximum et le bouton grand ou l’interrupteur de luminosité sur moyen haut (en tournant le bouton à 3/4^{de e}). Ensuite, améliorez la résolution de l’image en faisant pivoter les réglages grossiers et fins du microscope. Gardez ces ajustements constants et changez d’échantillons jusqu’à ce que les images soient enregistrées pour l’ensemble des échantillons. Pour éviter la réflexion de la lumière sur l’image numérique, éteignez toutes les lumières et enregistrez l’image sur l’ordinateur.
5. Ensuite, le programme invite une fenêtre affichant tous les emplacements de l’ordinateur pour enregistrer l’image. Enregistrez l’image numérique dans l’ordinateur avec le numéro d’identification de l’échantillon.
6. Notez les nectaris bractéaux (Figure supplémentaire 2) avec 1, 2, 3 et 4 en fonction du phénotype observé dans les images numériques acquises. Mettez à jour la feuille de notation avec l’identifiant de l’échantillon et le score correspondant pour une analyse future

Results

Des plants de coton cultivés dans le champ pendant 8 à 12 semaines ont été sélectionnés pour cette étude. Au moins deux répliques techniques ont été collectées pour chaque plante par type de tissu. Des échantillons de jeunes feuilles en bonne santé sont prélevés sur les branches supérieures avec des lames de 5 à 7 cm de long. Des échantillons de fleurs saines sont prélevés sur des fleurs ouvertes ou des bourgeons qui s’ouvriront le même jour. Des échantillons de feuilles et de fleurs ont été prélevés sur le terrain à partir de différentes lignées de plantes, et des images numériques ont été générées pour les deux types de tissus en laboratoire à l’aide d’un microscope (Figure 1). Toutes les étapes ont été suivies comme décrit ci-dessus dans la procédure, de la collecte de l’échantillon à l’imagerie (comme expliqué dans les figures 2 et 3). Les résultats représentatifs pour les nectaires foliaires et bractéaux montrent généralement l’absence de nectaire (1), la présence de nectaire avec des phénotypes intermédiaires (2, 3), et un nectaire pleinement développé produisant du nectar (4). Les données générées dans la Figure 4 sont les images numériques acquises auprès de deux plants de coton différents (nectariés et sans nectari). Les résultats de l’évaluation numérique de la surface abaxiale de la feuille (sur le côté inférieur de la nervure centrale) ont montré deux phénotypes avec des scores 1 (sans nectaires sur la nervure centrale) et 4 (avec nectaire entièrement développé avec nectar ; Figure 4A, B). De même, lorsque des échantillons de fleurs ont été analysés pour des nectaires bractéaux, ils ont montré deux phénotypes de 1 (sans nectaire) et 4 (nectar producteur de nectaire entièrement formé ; Figure 4C,D). Idéalement, les feuilles et les fleurs récoltées sur la même plante devraient suivre le même schéma, ce qui signifie que la feuille sans nectari et la fleur sans nectari devraient appartenir à une seule plante, tandis que la feuille nectariée et la fleur nectariée devraient appartenir à la même plante. La figure 5 est produite en collectant des images numériques des nectaires foliaires et bractéaux des plantes nectariées à 10x, 20x et 40x pour visualiser clairement les traits nectaires. De plus, pour comprendre comment ce score est donné dans la ségrégation des populations F₂ de parents coton nectariés et sans nectari, des tissus foliaires ont été prélevés sur l’une de ces populations, et des images numériques ont été produites pour chaque échantillon de nectaire foliaire. Des images numériques feuilles sélectionnées correspondant au format standard de notation 1, 2, 3 et 4 sont mises en évidence dans la Figure 6¹³. Le schéma courant et facile à identifier est l’absence de nectaire et la présence de nectaire. L’absence de nectaire reçoit le score le plus bas, tandis qu’un nectaire pleinement développé reçoit le score le plus élevé de 4. La plage des scores entre 1 et 4, soit 2, 3, est sous-développée et plus faible que les nectaires ordinaires. Ce schéma peut être observé dans les homozygotes sans nectaires, qui sont 1 (absent), en condition hétérozygote comme en 2 et 3 scores (nectaires réduits), et 4 (entièrement développés). De plus, des lignées parentales nectariées et sans nectari peuvent être cultivées avec les populations afin de comparer et comprendre ces différences.

Figure 1 : Aperçu des étapes de visualisation des nectaires foliaires et bractéaux depuis l’échantillonnage jusqu’à la microscopie numérique. (A) Sélectionner les plants de coton au stade de floraison intermédiaire pour la collecte des échantillons de feuilles et de fleurs. (B) Prélever des échantillons de feuilles sur le terrain pour observer les caractéristiques nectaires sur la feuille. (C) Retournez la feuille de sorte que le côté abaxial de la feuille soit orienté vers le haut et observez le trait nectaire dans la région de la boîte noire mise en évidence. (D) Placer la feuille sur l’étage du microscope et garder la mise au point dans la zone de la boîte noire mise en évidence pour enregistrer des images numériques du nectaire foliaire. (E) Cueillir des fleurs au stade de pleine floraison dans le champ (A). (F) Faire une incision en plaçant la fleur sur une planche à découper et inciser en ligne droite dans la zone de la boîte blanche dans la direction de la flèche, séparant la base de la fleur. (G) Placez la section incisée sur la scène du microscope pour l’imagerie numérique des nectaires bractéaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Procédure étape par étapes pour l’imagerie numérique et le scoring des nectaires foliaires dans le coton. 1. Collecter le matériau feuillaire du champ dans des sacs d’échantillons étiquetés et le placer dans une glacière 2. Transportez le refroidisseur avec les échantillons au laboratoire 3. Prélève des échantillons individuels du refroidisseur 4. Ouvrez le sac d’échantillon individuel et sortez la feuille 5. Coupez le pétiole de la feuille manuellement ou utilisez une lame. 6. Placer la feuille sur l’étage prédéfini du microscope avec le côté abaxial (inférieur) vers le haut 7. Ajustez le zoom à 10x dans le programme VHX 600 de l’écran d’ordinateur. Ajustez les réglages grossiers et fins du microscope pour obtenir la meilleure résolution de l’image. 8. Regardez l’écran de l’ordinateur pour voir s’il y a des ajustements de l’image observés (ajustez la lumière et la luminosité contrôlées par des boutons petits et grands en les faisant tourner, utilisez les boutons fins et grossiers du microscope pour la meilleure résolution d’image, et éteignez d’autres lumières pour éliminer la réflexion, etc.) dans le nectaire de feuilles 9. Sauvegardez l’image numérique pour le pointage. Un cercle en tiret autour du nectaire dans la feuille met en lumière la région du nectaire foliaire sur les images 8 et 9. Observez les nectaires foliaires au microscope à un grossissement de 10x (100 μm). Un seul nectaire de feuille est observé dans le coton domestique (comme on le voit sur cette image). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Procédure étape par étapes pour l’imagerie numérique et le scoring des nectaires bractéaux dans le coton. 1. Prélever des échantillons de fleurs dans les sacs d’échantillons étiquetés et les conserver dans la glacière 2. Retirez un échantillon du refroidisseur 3. Retirez une fleur 4. Enlever manuellement les bractées en les coupant de la fleur 5. Effectuer une incision à l’aide d’une lame stérile en coupant le long du bord bractéal en ligne droite (boîte blanche illustrée à la Figure 1 avant de procéder à l’imagerie numérique des nectaires bractéaux) 6. Retourne la section 7 incisée. Placez la coupe incisée avec le côté du pétiole vers le haut sur la scène du microscope, étape 8. Ajustez la lumière en utilisant les interrupteurs de lumière et de luminosité sur la console fixée au microscope. Utilisez des réglages grossiers et fins au microscope pour collecter des images avec une bonne résolution. Toutes les images sont observées au microscope à un grossissement de 10x (100 μm). Collectez des images numériques pour noter les nectaires bractéaux. Les cercles dans les images numériques du nectaire bractéal mettent en évidence la présence de nectaire, et il y a 3 nectaires bractéaux dans le coton domestique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Images numériques de nectaire de feuilles de coton et de nectaire de bractée. (A) Feuille avec nectaire ; (B) Feuille sans nectaire ; (C) Fleur présentant 3 nectaires bractéaux, et (D) Fleur sans nectaires bractéaux. Observez les nectaires des feuilles et des fleurs au microscope à un grossissement de 10x (100 μm). Les cercles en tiret montrent la présence et l’absence de nectaire dans les nectaires foliaires et les nectaires bractéaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Les nectaires foliaires et bractéaux ont été zoomés à 10x, 20x et 40x pour une identification claire des nectaires dans les images numériques. (A) Collectez des échantillons de feuilles pour observer la caractéristique nectaire sur la nervure centrale. (B) Observer le nectaire de la feuille sur la nervure centrale au microscope à un grossissement de 10x. (C) Observer le nectaire foliaire sur la nervure centrale au microscope à un grossissement de 20x. (D) Observer le nectaire foliaire sur la nervure centrale au microscope à un grossissement de 40x. (E) Inciser la section florale pour les nectaires bractéaux. (F) Observer les nectaires bractéaux au microscope à un grossissement de 10x. (G) Observer les nectaires bractéaux au microscope à un grossissement de 20x. (H) Observer les nectaires bractéaux au microscope à un grossissement de 40x. Les barres d’échelle sur chaque image représentent le grossissement auquel les images du nectaire foliaire ou du nectaire bractéal ont été prises (comme montré ici en 10x, 20x et 40x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Motif standard de notation du nectaire foliaire suivant les motifs 1, 2, 3 et 4. (A) Échantillon de feuilles sans nectaire tel que mis en évidence dans les cercles pointillés (Note 1 pour l’absence de nectary). (B) Le nectaire de petites feuilles observé présente un motif d’une des conditions hétérozygotes (image en cercle pointillé du nectaire noté 2). (C) Nectaire foliaire avec score 3, un autre motif de l’hétérozygote. (D) Nectaires entièrement formés avec un score de 4. L’échelle 10x représente le grossissement auquel les images ont été prises. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Nectaire foliaire et nectaires bractéaux sans utiliser de microscope. La figure illustre l’apparence des nectaires avec des incisures traditionnelles. Cette figure a été adaptée de¹³. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Génotypes possibles de la population La figure montre les génotypes des populations F₂ résultant d’un croisement de parents divers, nectariés et sans nectari. Ce tableau a été adapté à^{partir de 13}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Installation du microscope numérique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Nombre différent de nectaires bractéaux observés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les nectaires sont des trichomes glandulaires spécialisés qui produisent du nectar dans les plantes pour une pollinisation croisée réussie. Les nectaires végétaux et reproducteurs sont présents chez les plantes. Le genre Gossypium (coton) compte plus de 50 espèces, dont la majorité contient¹⁶ nectaires foliaires. Cependant, ce trait dans le coton attire également les nuisibles, entraînant des pertes de rendement supplémentaires¹⁷. Les éleveurs ont sélectionné des traits naturellement sans nectari (absence de nectaries) découverts pour la première fois chez G. tomentosum afin de résoudre ce problème. Pour cette raison, ils ont introduit ce trait sans nectari dans le coton cultivé des terres^{hautes 17}. Finalement, plusieurs populations ont été générées en sélectionnant des lignées nectariées et sans nectari comme parents. Comme les populations homozygotes sans nectari et hétérozygotes sans nectari ne montrent aucune différence lorsqu’elles sont observées à l’œil nu, il faut un outil spécial pour différencier ces plantes. Ainsi, cette méthode de notation par microscopie numérique, contrairement à la notation traditionnelle (comme montré à la Figure 7), visualise non seulement la réduction des nectaires, mais empêche aussi une évaluation inexacte des plantes hétérozygotes sans nectari en tant que plantes homozygotes sans nectari.

Le notation phénotypique à l’aide d’images numériques dépend de plusieurs facteurs clés, tels que le moment précis de collecte de l’échantillon, la sélection de l’échantillon, l’utilisation d’une échelle de notation standard pour les nectaries foliaires et bractéaux, le génotype possible, et la manière dont les données de notation peuvent être interprétées pour des applications en aval. Tout d’abord, il est important de récolter les feuilles et les fleurs pendant la saison de croissance, lorsque la sécrétion nectaire est la plus élevée, généralement au milieu de la floraison en juillet. Deuxièmement, le choix des feuilles ou des fleurs à la bonne taille et à la bonne étape joue un rôle crucial dans le score du phénotype. Pour les feuilles, les branches supérieures avec des lames de 5 à 7 cm de long étaient préférées pour l’entaillage des nectaires foliaires. De même, pour les nettaires de bractées, des fleurs saines provenant des branches supérieures ont été choisies. La sélection de l’échantillon à des stades spécifiques du développement aidera, même en comparant toutes les plantes d’une population en excluant les expressions de caractères dépendantes du stade de développement (comme montré à la Figure 8). Pour vérifier si la notation est reproductible, des images numériques ont été générées pour au moins deux échantillons par tissu et par plante. Collecter plusieurs répliques d’une même plante aide à une collecte de données cohérente.

La limite possible de la méthode est de conserver les plantes exemptes de nuisibles jusqu’à la collecte des échantillons. Les zones infestées par des ravageurs peuvent être identifiées par des plaques de tissus ou d’œufs pondus dans les tissus ou par des dommages aux zones nectaires avec des zones noires sans apparence visible de nectaire en raison de leur consommation par les pucerons ou d’autres insectes. Cela a été observé lors du criblage de centaines d’échantillons. Dans de tels cas, des feuilles et des fleurs saines ont été de nouveau collectées et analysées pour obtenir des données cohérentes à partir de ces échantillons. Cela peut être résolu en maintenant des calendriers réguliers de lutte antiparasitaire et en complétant de l’engrais pour obtenir des plantes en bonne santé. Suivre toutes les étapes critiques décrites aidera à dépanner le score de phénotype.

Cette technique a plusieurs applications, telles que la cartographie pour identifier des marqueurs ADN qui aident les sélectionneurs à identifier les génotypes pour la sélection assistée par marqueurs. Cette évaluation du phénotype nécessite une confirmation par des marqueurs ADN en raison des influences environnementales et du stade développemental, en plus des gènes qui contrôlent ce trait. Ainsi, le phénotypage de ce trait par microscopie numérique sera un point de départ pour réduire un grand nombre de plantes issues de plusieurs populations à un petit nombre de lignées suspectées sans nectarie. Grâce à des marqueurs d’ADN, ces lignées sont ensuite validées pour être utilisées dans des programmes de sélection visant à développer une résistance aux maladies médiée par les traits sans nectari dans des variétés nouvellement développées. Cette méthode peut également aider les chercheurs à comprendre le rôle du trait nectaire chez les plantes et les interactions bénéfiques avec les insectes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope numérique	Keyence VHX	VHX 600	D’autres microscopes peuvent être utilisés
Planche à découper Farberware	Farberware	Modèle n° 78892-10	14''L x 11''Wide X 0,5''Th, n’importe quelle marque peut être utilisée, celle-ci est disponible à amazon.com
Petit refroidisseur Igloos Laguna 9 QT	Igloo	Numéro de pièce 00043567	N’importe quelle marque ou toute taille selon les besoins du projet peut être utilisée
; Sacs plastiques (400 pièces), 3 x 4 pouces	Marque Aubeco	NA	4''L x 3''Wide x 0,01''H, n’importe quelle marque peut être utilisée, préférable les marques transparentes en plastique
Single & nbsp ; Lames de rasoir à tranchant, pack de 100	Weupe	NA	N’importe quelle marque peut être utilisée, celle-ci est disponible en amazon.com