Article de méthode

Normalisation biologique de la biofabrication humaine basée sur les ASC pour des constructions tissulaires reproductibles à l’échelle macroscale

DOI :

10.3791/69839

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5 juin 2026

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1Laboratory of Eukaryotic Cell Biology (Labio), National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 2Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), UNIGRANRIO, 3Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 4Post-graduation Program in Science and Technology of Polymers, Laboratory of Catalysis for Polymerization, Recycling and Biodegradable Polymers (LCPRB), Institute of Macromolecules, Federal University of Rio de Janeiro, 5Post-graduation Program in Metrology and Technology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 6Campus of Duque de Caxias, Federal University of Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude présente un flux de travail de biofabrication reproductible utilisant des sphéroïdes de cellules souches dérivées de l’adipeux et des échafaudages GelMA imprimés en 3D. Il démontre le contrôle spatial, la capacité de fusion et des indicateurs de contrôle qualité, aboutissant à des constructions tissulaires à grande échelle transplantables avec des applications potentielles en médecine régénérative.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’absence de protocoles standardisés entre les laboratoires constitue un obstacle important à la comparabilité des résultats expérimentaux et au transfert efficace des technologies de biofabrication. Une standardisation biologique rigoureuse améliore non seulement la reproductibilité, mais facilite également l’alignement avec les cadres réglementaires nationaux et internationaux, essentiels à la traduction clinique des stratégies d’ingénierie tissulaire. Cette étude introduit un flux de travail standardisé de biofabrication comprenant la culture monocouche de hADSC, la formation de sphéroïdes, l’impression 3D d’échafaudages de méthacryloyle gélatine (GelMA) et le bioassemblage sphéroïde. Des indicateurs de contrôle qualité ont été intégrés pour garantir la reproductibilité. L’échafaudage GelMA imprimé en 3D a été conçu avec deux pores centraux, chacun capable d’abriter des centaines de sphéroïdes. La fidélité de l’impression a été confirmée en comparant les dimensions de l’échafaudage avec le modèle CAO, avec de légères déviations non significatives. Les hADSC formaient des sphéroïdes uniformes en moins de 24 heures dans des micromoules d’agarose. Lorsqu’ils sont ensemencés dans les pores de l’échafaudage, les sphéroïdes subissaient une fusion continue sur 72 heures, formant des constructions à l’échelle macroscale confirmées par imagerie confocale. La conception de l’échafaudage et la précision d’impression assuraient un soutien structurel, tandis que l’uniformité des sphéroïdes permettait une formation prévisible de la construction. La fusion des sphéroïdes dans les pores de l’échafaudage a permis de créer des constructions tissulaires adaptées à la transplantation, avec ou sans l’échafaudage, soulignant la polyvalence de cette approche de bioassemblage. Ces résultats soulignent le rôle central de la normalisation biologique dans l’avancement de méthodologies reproductibles pour la biofabrication de constructions tissulaires vivantes, avec des implications prometteuses pour de futures applications cliniques en médecine régénérative.

Introduction

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Le bioassemblage et la bioimpression sont des approches complémentaires de biofabrication en ingénierie tissulaire qui se concentrent sur la construction de tissus et d’organes complexes à l’échelle macroscopique à l’aide de technologiesautomatisées 1,2,3,4.

Les sphéroïdes ont été intégrés à la biofabrication comme éléments de construction principalement pour les approches debioassemblage 5. Les sphéroïdes sont considérés comme des microtissus qui reproduisent in vivo les interactions entre les cellules et le microenvironnement tissulaire environnant. Parmi les sources cellulaires utilisées pour la formation des sphéroïdes, les cellules souches dérivées de l’adipe (ADSC) se distinguent par leur facilité d’isolement, leur maintien à long terme de la culture et leur potentielde différenciation 6,7,8.

En raison de leur capacité intrinsèque à former des agrégats plus volumineux, les sphéroïdes peuvent générer des constructions tissulaires plus complexes lorsqu’ils sont soumis à des approches de bioassemblage. Cette organisation pilotée par la fusion renforce le potentiel de régénération et de différenciation des sphéroïdes des cellules souches 9,10.

Le bioassemblage sphéroïde peut être supporté ou même guidé par les biomatériaux11, ce qui rend cette stratégie adaptée à la biofabrication évolutive etautomatisée 12,13.

Les stratégies de biofabrication existantes peuvent être globalement catégorisées en approches d’assemblage sphéroïde sans échafaudage et en systèmes de bioimpression intégrésà hydrogel 2,5,14. Les méthodes sans échafaudage reposent exclusivement sur l’auto-assemblage cellulaire spontané et la fusion intersphéroïde, tirant parti des interactions intrinsèques cellule-cellule. Cependant, parce qu’elles se produisent sans guidage architectural externe ni confinement géométrique, ces approches présentent un contrôle spatial réduit et une prévisibilité structurellemoindre 5,15. En revanche, les approches d’encapsulation à base d’hydrogel englobent les cellules dans des matrices de masse pour fournir un support structurel et une architectureprédéfinie 16,17, ce qui peut en partie restreindre le contact direct cellule-cellule lors des premiers stades de fusion et influencer la dynamique de migrationcellulaire 18. Dans ce cadre, des biomatériaux imprimables tels que le gélatine méthacryloyle (GelMA) présentent des motifs d’adhésion cellulaire et peuvent servir d’échafaudages pour faciliter le bioassemblagesphéroïde 19. Un échafaudage GelMA imprimé en 3D est hypothétique pour fournir un confinement géométrique et un guidage spatial pour les sphéroïdes, favorisant ainsi la formation contrôlée des tissus par fusion en constructions plus grandes et structurellement définies. Cette approche vise à améliorer le contrôle spatial et la reproductibilité structurelle lors du bioassemblage sphéroïde en combinant l’organisation guidée par échafaudage avec la fusion sphéroïde au sein d’une architecture hydrogel définie. Cependant, le flux de travail actuel se concentre sur la normalisation des procédés et les paramètres de biofabrication structurelle et ne traite pas de la maturation tissulaire à long terme, de la différenciation fonctionnelle ou de la production automatisée à grande échelle.

La normalisation biologique est essentielle non seulement pour assurer la reproductibilité et la scalabilité, mais aussi pour préserver l’intégrité fonctionnelle des tissusbiofabriqués 19,20. Par conséquent, un contrôle précis des paramètres d’ingénierie, géométriques et structurelles est crucial, car ces facteurs influencent directement la performance biologique, y compris la fonction tissulaire et la maturation 5,21. Un flux de travail de biofabrication standardisé et reproductible est présenté, englobant les étapes clés suivantes : (1) culture monocouche ASC ; (2) formation sphéroïde ASC ; (3) impression 3D de l’échafaudage GelMA ; et (4) bioassemblage sphéroïde (Figure 1). Dans ce flux de travail, des indicateurs objectifs de contrôle qualité ont été établis, incluant l’uniformité et la sphéricité des sphéroïdes, la fidélité d’impression et l’intégrité des formes de l’échafaudage.

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Protocole

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Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de micromoules en agarose et fabrication d’échafaudages imprimés en 3D GelMA

  1. Production du micromoulant d’agarose à 2 % dans une solution de chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % (voir Figure 2A)
    REMARQUE : Tous les déchets chimiques doivent être traités et éliminés conformément aux réglementations institutionnelles sur la sécurité chimique et aux directives concernant les déchets dangereux.
    1. Préparez une solution de NaCl à 0,9 % dans de l’eau ultrapure et de l’autoclave pendant 30 minutes à 121 °C. Conserver dans des conditions stériles jusqu’à utilisation.
    2. Diluer 1 g d’agarose ultrapure stérile dans 50 mL de solution de NaCl à 0,9 %. Homogénéiser et dépolymériser l’agarose au micro-ondes à des intervalles de 10 s pendant 3 à 5 cycles, jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
    3. Dans un cabinet de sécurité biologique, placez un moule en silicone commercialement disponible contenant 81 creux circulaires sur une gaze stérile.
    4. Déposez soigneusement 600 μL d’agarose au centre du moule en silicone et laissez-le reposer 40 minutes pour assurer une polymérisation complète.
    5. Démoldez soigneusement le micromoule d’agarose entièrement polymérisé et transférez-le dans un puits d’une plaque microtitrée à 12 puits.
    6. Ajustez la position du micromoule d’agarose et fixez-le au fond du puits en remplissant 600 μL d’agarose.
    7. Pré-incuber le micromoule en l’incubant avec le Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM, 2 mL/puits) de Dulbecco pendant 15 minutes. Répétez cette procédure deux fois et, lors de la troisième incubation, remplacez-la par le milieu de culture tridimensionnel (3D), composé de DMEM complétée par de l’acide ascorbique (50 μg/mL), de l’albumine sérique humaine (1,25 μg/mL), de la pénicilline-streptomycine (PS, 1×, à partir d’une solution 100×), et d’un complément ITS (1×, à partir d’une solution à 100×).
      REMARQUE : Le milieu de culture 3D diffère du milieu d’expansion monocouche par l’absence de sérum bovin fœtal (FBS) et l’inclusion de compléments définis favorisant l’interaction cellule-cellule et le soutien de la matrice extracellulaire, favorisant un auto-assemblage et une stabilisation sphéroïdiques appropriés. Si la production de moisissures et le placage cellulaire sont effectués à des jours différents, la procédure peut être interrompue après la seconde incubation DMEM, et les moisissures doivent être stockées dans des conditions stériles dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant jusqu’à 5 jours. La troisième incubation avec un milieu de culture 3D doit être effectuée uniquement le jour du dressage. Avant d’ensemencer les cellules, retirez complètement le milieu à la fois du puits et du micromouleur.
  2. Préparation de l’hydrogel gélatine méthacryloyle (GelMA)
    REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être réalisé dans l’obscurité, car les réactifs sont photosensibles. Dans cette étude, GelMA (force de gel 300 g Bloom, degré de substitution 60 %) et le photoinitiateur lithium phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate (LAP) ont été utilisés. Pour préparer 10 mL d’une solution de GelMA à 10 % en poids ou en va, contenant 0,5 % en poids par v de LAP :
    1. Dissoudre 50 mg de poudre LAP dans 1 mL de DMEM, en mélangeant doucement avec une pipette jusqu’à obtenir une solution claire et homogène.
    2. Transférez la solution LAP dans un tube centrifugeuse contenant 9 mL de DMEM et mélangez soigneusement.
    3. Dans un cabinet de sécurité biologique, stérilisez la solution résultante par filtration à travers un filtre de 0,22 μm.
    4. Ajoutez 1 g de GelMA à la solution et homogénéisez en remuant magnétiquement à 50 °C pendant environ 3 heures, ou jusqu’à obtenir une solution claire et homogène. Tenez la fiole à la lumière pour vous assurer que la solution est exempte de particules visibles et de turbidité.
    5. Chargez l’hydrogel obtenu dans une seringue de 10 mL pour une impression ultérieure ou, si elle n’est pas utilisée immédiatement, conservez-la à 2–8 °C, protégée de la lumière, jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Les solutions GelMA et LAP ont été utilisées environ 24 heures après la préparation. Un stockage prolongé de cette solution n’est pas recommandé. Les poudres GelMA et LAP doivent toutes deux être stockées à 2–8 °C, selon les instructions du fabricant. Le photoinitiateur LAP est classé comme non dangereux selon des normes telles que l’ABNT NBR 14725 et le règlement (CE) n° 1272/2008. Cependant, le fabricant recommande d’utiliser un équipement de protection individuelle pour prévenir les irritations respiratoires, cutanées et oculaires. L’utilisation de lunettes de sécurité testées et approuvées conformément aux normes gouvernementales pertinentes, telles que NIOSH (National Institute for Occupational Safety and Health - US) ou EN 166 (EU), ainsi que des gants en caoutchouc nitrile d’une épaisseur minimale de 0,11 mm, est recommandée. La protection respiratoire n’est requise que lorsque la poussière est générée. Les recommandations du fabricant concernant la protection respiratoire avec un filtre sont basées sur des normes telles que DIN EN 143, DIN EN 14387, et d’autres normes complémentaires liées au système de protection respiratoire spécifique utilisé. Le fabricant recommande d’utiliser un filtre de type P1.
  3. Conception de modèles 3D, découpage et génération du fichier G-code
    REMARQUE : Le modèle d’échafaudage 3D a été conçu à l’aide du logiciel en ligne de conception assistée par ordinateur (CAO) Tinkercad. Pour ce protocole, un échafaudage cylindrique a été généré d’un diamètre de 15 mm, d’une épaisseur de fond de 1 mm, et de deux pores circulaires, chacun d’un diamètre de 5,50 mm et d’une profondeur de 2 mm.
    1. Une fois la conception du modèle 3D terminée, exportez-le en fichier *.stl (Fichier supplémentaire 1).
    2. Ouvrez le logiciel Repetier-Host V2.3.2, qui servira à découper le modèle conçu.
    3. Dans l’onglet « Trancheur », sélectionnez l’option de trancheur désirée. Dans cette étude, le CuraEngine a été utilisé.
    4. Configurez le profil de paramètres approprié. Dans ce travail, vitesse 10 mm/s ; Hauteur de couche 0,2 mm ; Motif de remplissage : Grille ; Un diamètre de buse de 0,41 mm a été utilisé.
    5. Chargez le fichier *.stl du modèle 3D à imprimer.
    6. Dans l’onglet « Slicer », sélectionnez la configuration créée précédemment.
    7. Cliquez sur « Découper avec CuraEngine ». Le modèle 3D tranché sera ensuite visualisé dans l’interface logicielle.
    8. Cliquez sur « Enregistrer dans le fichier » pour enregistrer le fichier G-code à l’emplacement souhaité.
  4. Impression 3D d’échafaudages hydrogel gélatine méthacryloyle (GelMA) pour bioassemblage sphéroïde
    REMARQUE : L’impression 3D doit être réalisée dans des conditions stériles. Par conséquent, avant de commencer le processus d’impression, vérifiez que l’armoire de sécurité biologique abritant l’imprimante est allumée et que le flux d’air fonctionne correctement. Confirmez que la hauteur du verre de protection de l’armoire est à la même hauteur que le marquage du capteur d’équipement.
    1. Retirez les verrous de sécurité de la bioimprimatrice.
    2. Retirez la plaque de verre du lit d’impression en libérant les clips métalliques.
    3. Fixez un guide acrylique de forme appropriée pour soutenir la fixation de la plaque de culture sur la plateforme d’impression, à l’aide des clips métalliques.
    4. Connecte l’imprimante à la source d’alimentation. Notez que cet équipement supporte la double tension (110/220 V).
    5. Connecte le câble USB de l’imprimante à l’ordinateur.
    6. Appuyez sur le bouton marche/arrêt pour allumer l’imprimante.
    7. Ouvre le logiciel Repetier-Host V2.3.2, qui sera utilisé pour visualiser le modèle 3D et l’imprimer.
    8. Cliquez sur l’option « Connecter » dans l’interface logicielle.
    9. En utilisant le contrôle manuel logiciel, sélectionnez l’extrudeur (1 ou 2) et envoyez la tête d’impression à la position d’origine (X = 0, Y = 0, Z = 0).
    10. Ajustez l’extrudeuse sélectionnée pour un bon ajustement de la seringue en utilisant l’outil approprié du contrôle manuel dans Repetier.
    11. Insérez soigneusement la seringue dans l’extrudeur, déjà chargée d’hydrogel et fixée à une buse d’extrusion (dans cette étude, nous avons utilisé une buse conique en polypropylène d’un diamètre interne de 0,41 mm).
    12. Fixez la plaque de culture dans le guide acrylique fixé au plateau d’impression.
    13. Ajustez la position d’accueil Z (Z = 0) à l’aide de la vis d’arrêt Z située sur le côté gauche de la bioimprimante. C’est-à-dire qu’il faut régler la distance souhaitée entre la buse d’extrusion et la surface d’impression. Idéalement, la buse devrait toucher légèrement le substrat, qui dans cette étude était la plaque de culture.
    14. Ramenez la tête d’impression à la position d’origine.
    15. Chargez le fichier G-code généré précédemment.
    16. À l’aide de l’outil de contrôle manuel approprié dans le logiciel, extrudez une partie de l’hydrogel de la seringue pour garantir le passage du matériau à travers la buse.
    17. Commencez le processus d’impression.
    18. Après l’impression, effectuez la photoréticulation de l’échafaudage résultant à l’aide du système de lumière UV de la bioimprimante 3D, équipé de deux LED à 395-400 nm. Exposez l’échafaudage à la lumière UV pendant 5 minutes (intensité lumineuse de 20 mW/cm2).
    19. Utilisez la même solution d’agarose dépolymérisée à 2 % utilisée pour fabriquer les micromoules afin de fixer les échafaudages imprimés en 3D aux puits d’une plaque de culture à 12 puits. Fixer les échafaudages au fond des puits est nécessaire pour offrir une plus grande stabilité et éviter le déplacement lors de l’ensemencement des sphéroïdes et tout au long de la période de culture.
      REMARQUE : Lors de l’étape 4.16, vérifiez si l’hydrogel forme un filament continu lors de l’extrusion. En général, la solution de gélatine est chargée dans la seringue alors qu’elle est encore à l’état liquide (environ 37 °C). En quelques minutes à température ambiante (22–25 °C), ce biomatériau commence à adopter une consistance gélatineuse. Le matériau ne doit pas goutter lors de l’extrusion, car cela nuirait à la qualité d’impression. La formation continue de filaments lors de l’extrusion indique que l’hydrogel a atteint une consistance optimale pour l’impression. La solution GelMA et LAP diluée dans le DMEM présente une coloration légèrement orangée. Après la réticulation photo-interconnectée induite par les UV, un changement de couleur est fréquemment observé, le matériau devenant blanchâtre ou translucide, comme montré à la Figure 3D,E. Lors de l’utilisation du système UV, les lunettes de sécurité sont obligatoires pour assurer une protection oculaire adéquate contre les rayons ultraviolets.
  5. Analyse de la fidélité d’impression
    REMARQUE : L’analyse de fidélité de l’impression 3D des échafaudages GelMA prend en compte les paramètres suivants : diamètre de l’échafaudage, diamètre des pores et épaisseur de l’échafaudage. Le logiciel ImageJ version 1.54 a été utilisé pour effectuer les mesures.
    1. Premièrement, capturez des images des échafaudages observés au stéréomicroscope. Utilisez une règle ou un étrier comme référence.
    2. Avant d’analyser les images, calibrez et réglez l’échelle dans ImageJ pour effectuer les mesures.
    3. Utilisez l’outil de ligne droite pour effectuer les mesures.
    4. Puisque l’échafaud et les pores sont circulaires, on utilise la moyenne arithmétique des diamètres de l’échafaud et des pores pour l’analyse statistique.
    5. Pour l’analyse de la fidélité d’impression, comparez les mesures obtenues par ImageJ à partir des échafaudages imprimés avec les valeurs définies dans le modèle 3D généré par Tinkercad.
      REMARQUE : L’épaisseur mesurée de l’échafaudage imprimé est comparée à la somme des valeurs de profondeur des pores et d’épaisseur du fond projetées dans Tinkercad.
    6. Effectuer une analyse statistique des données obtenues. Dans ce cas, pour comparer les valeurs mesurées de l’échafaudage avec les valeurs attendues, le test Mann-Whitney U (non paramétrique) peut être utilisé. Le test de Shapiro-Wilk est utilisé pour évaluer la normalité. Les différences sont considérées comme statistiquement significatives lorsque p < 0,05.

2. Préparation des hADSC et de la formation des sphéroïdes

REMARQUE : Les cellules souches mésenchymateuses dérivées de l’adipe humain (hADSC) disponibles commercialement ont été cultivées dans un milieu de croissance spécifique à chaque cellule et ont été transmises à une confluence de 80 % à 90 % selon les recommandations du fabricant. Des cellules ont été utilisées jusqu’au passage 7 pour ce protocole. Tous les déchets biologiques doivent être correctement décontaminés ou stérilisés avant leur élimination et manipulés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Pour une visualisation confocale ultérieure, la monocouche doit être marquée avec un colorant fluorescent avant la formation des sphéroïdes et incubée selon les recommandations du fabricant. La formation des sphéroïdes peut être initiée 30 minutes après l’étiquetage.

  1. Trypsinisation de la monocouche ASC
    1. Dans un armoire de sécurité biologique, ouvrez la fiole de culture et transférez son contenu dans un contenant à déchets.
    2. Lavez la monocouche deux fois avec 1× de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) et jetez la solution.
    3. Ajoutez une solution de trypsine/EDTA à 0,125 % suffisante pour recouvrir la monocouche. Fermez la fiole et faites écouver dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant jusqu’à 5 minutes.
    4. Inactivez la trypsine/EDTA en ajoutant un volume égal de DMEM complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS).
    5. Collectez la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique ou transférez dans des tubes centrifugeuses. Centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes à température ambiante (20–25 °C).
    6. Jetez soigneusement le surnageant.
    7. Resuspendez la granulation cellulaire dans le DMEM et homogénéisez. Prenez un aliquote pour le comptage cellulaire et l’évaluation de la viabilité.
  2. Culture sphéroïde (voir Figure 2B)
    1. Séparez le nombre approprié de cellules à plaquer pour chaque moule dans un tube centrifugeuse de 15 mL. Pour les hADSC, chaque moule d’agarose contenant 81 creux devrait recevoir 1 × 106 cellules — un sphéroïde se forme dans chaque micropuits, produisant 81 sphéroïdes par micromouleur.
    2. Ajoutez 1× PBS et centrifugez à 500 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Supplantez le surnageant et ajoutez 1× PBS. Répétez cette étape deux fois.
    3. Après la troisième centrifugation, jetez soigneusement le surnageant et séchez l’ouverture du tube avec une gaze stérile avant de la remettre en position verticale.
    4. Résuspendez le pellet cellulaire dans 120 μL de milieu de culture 3D pour la culture sphéroïde et homogénéisez. Ajustez le volume de suspension à 200 μL avec un milieu de culture 3D supplémentaire si nécessaire.
      REMARQUE : Chaque moule avec 81 résections a une capacité de 200 μL.
    5. Aspirez 200 μL et placez-le soigneusement au centre du moule, évitant la formation de bulles.
      REMARQUE : Cette étape peut être automatisée à l’aide d’un système de pipetage robotique, comme décritprécédemment 22.
    6. Laissez la plaque dans l’armoire de sécurité biologique pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se déposer dans les résections.
    7. Placez l’assiette dans un incubateur humidifié pendant 40 minutes.
    8. Après cette période, ajoutez soigneusement 2 mL de medium 3D à chaque puits. Remet la plaque dans l’incubateur humidifié à 37 °C.
  3. Mesure des sphéroïdes et analyse statistique
    1. Capturez des images des sphéroïdes positionnés le long des deux diagonales du micromoule d’agarose, formant un motif en « X », à l’aide d’un microscope optique inversé équipé d’un appareil photo numérique et d’un objectif de 10×. Utilisez la barre à l’échelle de 100 μm pour calibrer l’échelle de l’image avant de mesurer les diamètres.
    2. Pour déterminer les diamètres majeurs et mineurs des sphéroïdes, utilisez l’outil « ligne » du logiciel et effectuez deux mesures perpendiculaires pour chaque sphéroïde photographié, avec un angle d’environ 90° entre eux.
    3. Calculez le diamètre moyen de chaque sphéroïde comme la moyenne arithmétique des deux diamètres perpendiculaires précédemment mesurés. Calculez la sphéricité comme le rapport entre le plus grand et le plus petit diamètre de chaque sphéroïde, avec des valeurs plus proches de 1 indiquant une plus grande uniformité et une forme plus sphérique.
    4. Effectuer des analyses statistiques en utilisant les valeurs de diamètre et de sphéricité obtenues.

3. Ensemencement de sphéroïdes sur des échafaudages GelMA pour la fusion et le bioassemblage des sphéroïdes

  1. Après 24 heures de formation sphéroïde, prélevez-les des micromoules d’agarose à l’aide d’une pipette à bouts larges et transférez-les dans des microtubes de 2 mL.
  2. Lorsque les sphéroïdes se déposent au fond des microtubes, jetez le surnageant.
  3. Resuspendez les sphéroïdes dans 50 μL de médium 3D.
  4. À l’aide d’une pipette à bouts larges, collectez les sphéroïdes et enfonzez-les délicatement dans les pores de l’échafaudage GelMA.
    REMARQUE : Dans un pore de support GelMA d’environ 5,50 mm de diamètre et 2 mm de profondeur, semez environ 480 à 640 sphéroïdes (correspondant à 6 à 8 micromoules d’agarose, chacun générant 81 sphéroïdes de diamètres allant de 200 à 400 μm) en 50 μL. Cette estimation était basée sur le volume des pores et le diamètre moyen des sphéroïdes, la quantification étant effectuée par le nombre de micromoules complets transférés plutôt que par un comptage sphéroïde individuel, assurant ainsi une estimation pratique et reproductible de la densité sphéroïde dans le pore.
  5. Après avoir déposé les sphéroïdes dans le pore de support GelMA, attendez 20 à 40 minutes pour laisser les sphéroïdes se stabiliser. Ajoutez 1 mL de médium 3D à chaque puits.
  6. Après 24 heures, ajoutez 1 mL de substrat 3D à chaque puits.
  7. Surveiller la fusion des sphéroïdes dans les pores des échafaudages GelMA par microscopie à contraste de phase et stéréomicroscopie. Prenez les images toutes les 24 heures, du jour 0 (immédiatement après le semis) au jour 3 (72 heures).
  8. Fixer la construction biologique dans du paraformoldéhyde à 4 % après 72 heures pour visualisation par microscopie confocale. Manipuler le paraformaldéhyde dans une hotte chimique certifiée en utilisant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire) en raison de ses propriétés toxiques et irritantes, et éliminez les déchets conformément aux directives de sécurité chimique institutionnelles. Pour l’observation confocale, les cellules doivent être pré-marquées dans la monocouche avec un colorant fluorescent avant la formation des sphéroïdes.
    REMARQUE : Si l’extraction du construct du pore GelMA est nécessaire pour une analyse ou une application in vivo , récupérez-la soigneusement à l’aide d’une pince de précision ou d’une perforatrice de biopsie de taille appropriée.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches humaines dérivées de l’adipeux (hASC) cultivées en monocouche (Figure 2C) ont été réussies à former des sphéroïdes en moins de 24 heures après avoir été ensemées dans des micromoules d’agarose (Figure 2D). Les sphéroïdes résultants présentaient une morphologie compacte et bien définie. L’analyse morphométrique a révélé un diamètre moyen de 239,8 μm ± 87,0 μm à 24 h (Figure 2E) e...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats présentés dans cette étude mettent en lumière l’intégration réussie des indicateurs de contrôle qualité dans un flux de travail standardisé de biofabrication afin d’assurer la reproductibilité. L’utilisation d’échafaudages imprimés en 3D basés sur des conceptions préétablies fournit un support structurel pour le bioassemblagesphéroïde 19,23. En guise de preuve de concept, un échafaudage solide a été conçu avec deux ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) pour les illustrations dans les figurines.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Préparé au laboratoire-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead593iCAN--
AgaroseSigma-Aldrich16500-500-
Acid Ascorbic Sigma-Aldrich A4544-100MG-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert Zeiss-415510-1101-000
Celldiscover Zeiss-LSM 900 with Airyscan 2
CelltrackerInvitrogen C7025-
CentrifugeEppendorf -5702
Class II Biological Safety CabinetStreamline-Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell cultureThermo Fisher Scientific-Series 8000 WJ 
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose Sigma-Aldrich D2902-10L-
EDTASigma-Aldrich E9884-
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco 12657-029-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%Sigma-Aldrich900622Numéro de lot/numéro de batch: MKCS2673. La documentation pour chaque lot, y compris la fiche de données de sécurité (SDS) et le certificat d'analyse (CoA), peut être obtenue sur le site Web du fabricant’s.
GraphPad Prism 6.0 softwareGraphPad Inc--
Hot plate magnetic stirrerIKAZ671797Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/mlFUJIFILM Irvine Scientific9988-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x Sigma-AldrichI3146-5ML-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope Labomed--
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroidsSigma-AldrichZ764019-
Penicillin-streptomycin 100xSigma-Aldrich15140122-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)Lonza PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich71382-500G-
Trypsin/EDTAGibco 27250018-

Références

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Cellules souches adipeuses humainesflux de travail de biofabricationing nierie tissulaireformation de sph ro deschafaudage de GelMAimpression 3Dbioassemblage de sph ro desconception d chafaudagem decine r g n rative

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