Un protocole pour la récolte de la suspension unicellulaire sur les cornées de souris

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris par digestion séquentielle avec collagénase A et trypsine. Cette méthode permet de produire des cellules uniques viables avec une grande intégrité ARN, les rendant compatibles avec des applications en aval telles que le séquençage à ARN monocellulaire et le cytomètrey en flux.

Résumé

En tant que couche la plus externe du globe oculaire, la cornée joue un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie de la surface oculaire et de la vision. Les avancées récentes dans le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont permis une analyse à haute résolution de l’hétérogénéité cellulaire cornéenne, pourtant la préparation de suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de tissu cornéen reste difficile en raison de sa structure dense et complexe. Dans cette étude, nous établissons un protocole robuste pour générer des suspensions unicellulaires à partir de cornées entières de souris. La procédure consiste à réduire les cornées en fragments fins suivies d’une digestion enzymatique séquentielle à l’aide de collagénase A et de trypsine. La suspension cellulaire résultante a été évaluée pour la qualité à l’aide de plusieurs indicateurs : la coloration au bleu de trypan a été utilisée pour évaluer la viabilité et le nombre cellulaires ; la coloration par immunofluorescence pour la pancytokératine et le kératocan a permis d’identifier et de quantifier les principaux types cellulaires cornéens ; et l’intégrité de l’ARN a été vérifiée à l’aide d’un bioanalyseur. Ce protocole produit systématiquement des préparations unicellulaires avec un nombre élevé de cellules, une excellente viabilité (≥ 94,6 %) et une forte proportion de cellules uniques (96,3 %), répondant aux exigences compatibles avec des applications en aval exigeantes, y compris scRNA-seq.

Introduction

La cornée, située à la couche la plus externe du globe oculaire, est essentielle pour ses fonctions barrières et réfractives, grâce à une architecture très organisée comprenant cinq couches distinctes : l’épithélium, la couche de Bowman, le stroma, la membrane de Descemet et l’endothélium¹. L’épithélium cornéen est une structure squameuse stratifiée non kératinisée qui constitue une barrière physique contre les agents pathogènes externes et présente de robustes capacités antimicrobiennes et régénératrices. Le stroma, composé de fibrilles de collagène précisément alignées, maintient une transparence cornéenne et un indice de réfraction^{uniforme de 2}. L’endothélium, une couche monocellulaire, régule le transfert de liquide entre le stroma et l’humeur aqueuse, préservant ainsi l’hydratation cornéenne et l’apport en^{nutriments 3}. Néanmoins, cette complexité structurelle et cellulaire complexe a historiquement posé des défis importants pour l’étude des fonctions biologiques cornéennes et des mécanismes sous-jacents⁴.

Pour étudier les interactions intercellulaires et identifier les marqueurs spécifiques au type cellulaire, des techniques telles que le tri par cytométrie^{en flux 5} et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq⁾⁶ sont largement employées. Un obstacle technique majeur commun aux deux approches est cependant la préparation de suspensions monocellules de haute qualité. Des paramètres tels que le rendement total des cellules (yield total cellulaire), la proportion de cellules individuelles et la viabilité cellulaire sont essentiels pour la fiabilité des applications en aval visant à caractériser la fonction des cellules cornéennes et l’expression des marqueurs^{de surface 7}. Malgré son importance, il manque encore des protocoles standardisés et efficaces pour générer des suspensions unicellulaires à partir de cornées entières de souris.

Plusieurs méthodes ont été mises en place pour obtenir des suspensions unicellulaires à partir du tissu cornéen. La digestion enzymatique séquentielle utilisant la collagénase A, la trypsine ou la trypLE a été utilisée pour isoler des cellules uniques provenant de cornées humaines et^{murines 8}. La trypsinisation répétée a également été utilisée pour la dissociation cornéenne⁷. De plus, des kits commerciaux de dissociation multitissulaire, tels que ceux de Miltenyi Biotec, ont été utilisés avec succès pour générer des suspensions unicellulaires^{cornéennes 9}. Dans notre étude comparative précédente sur différentes méthodes de digestion cornéenne, nous avons démontré que le traitement séquentiel par collagénase et trypsine constitue l’approche optimale. Cette méthode donne systématiquement un nombre élevé de cellules élevées, une excellente viabilité (≥94,6 %), un pourcentage élevé de cellules uniques (96,3 %) et une intégrité de l’ARN^{bien préservée 10}.

Dans ce protocole, nous proposons une procédure détaillée étape par étape pour générer des suspensions unicellulaires de haute qualité à partir de cornées entières de souris en utilisant cette stratégie de digestion enzymatique optimisée, basée sur notre expérience établie et nos résultats antérieurs.

Protocole

Des souris femelles C57BL/6 (B6), âgées de 6 à 8 semaines, ont été fournies par le Centre Expérimental des Animaux de l’Université Médicale du Guizhou. Les animaux étaient hébergés sous un cycle de 12 heures de lumière et de 12 heures d’obscurité avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université médicale du Guizhou (Approbation n° 2305185) et menées conformément à la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Préparation

1. Préparation des instruments chirurgicaux : nettoyez deux paires de ciseaux ophtalmiques, deux paires de pinces ophtalmiques, une paire de pinces tissulaires et un tube centrifuge de 2 mL en rinçant deux fois avec de l’eau double distillée (DDW). Stérilisez les instruments et les tubes à l’aide d’un autoclave à vapeur. Faites sécher tous les aliments toute la nuit dans un four conventionnel à 65 °C.
2. Préparation de la solution
   1. Milieu épithélial hormonal supplémentaire (SHEM) : Préparez SHEM en complétant le milieu DMEM/F12 avec les composants suivants : sérum bovin fœtal (FBS) à 5 % (v/v), 0,5 % (v/v) de sulfoxyde de diméthéthyle (DMSO), 10 ng/mL facteur de croissance épidermique de souris, 5,5 μg/mL de transhértine, 0,5 μg/mL d’hydrocortisone, 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine).
      REMARQUE : SHEM est utilisé pour maintenir la viabilité des cellules pendant le traitement. Elle peut être remplacée par des milieux alternatifs tels que le DMEM basal ou la solution sérigène tamponnée phosphate (PBS) contenant au moins 10 % (v/v) de FBS.
   2. Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)
      1. Dissoudre 22,4 g de poudre PBS dans 2 L d’eau double distillée (DDW) sous brassage à l’aide d’un agitateur magnétique pour obtenir 1× PBS.
      2. Autoclave la solution PBS un jour à l’avance et laisse-la refroidir.
      3. En conditions stériles, transférez 47,5 mL de PBS stérile 1× dans un tube centrifuge de 50 mL et ajoutez 2,5 mL de pénicilline-streptomycine à 1 % (v/v).
         REMARQUE : La formulation 1× PBS (2 L) contient 137 mM de NaCl, 8 mM_{Na 2HPO 4}, et 2 mM NaH₂PO₄, pH 7,2.
   3. Solutions de collagénase A
      1. Solution d’origine : dissoudre 1 g de collagénase A en poudre dans 40 mL de DDW. Filtrez à travers un filtre de 0,2 μm et conservez à -20 °C.
      2. Solution de travail : Diluer 1 mL de collagénase A solution stock dans 4 mL de DDW stérile pour obtenir une concentration finale de 5 mg/mL.
   4. Solution de trypsine : Décongeler une solution de trypsine/EDTA disponible dans le commerce à 0,25 % (en v) (contenant 0,91 mM d’EDTA) sur glace avant utilisation.
   5. Solution de bleu de Trypan (0,4 %) : Dissoudre 0,4 g de bleu de Trypan dans 100 mL de DDW. Filtrez avec du papier filtre et conservez à 4 °C.
      REMARQUE : La solution à 0,4 % de bleu de Trypan est utilisée pour évaluer le nombre total de cellules, la proportion de cellules individuelles et la viabilité. Il peut être remplacé par des kits commerciaux de coloration vivants/morts ou par des systèmes automatisés de comptage cellulaire.

2. Préparation des cornées de souris

1. Stérilisez le microscope de dissection et la zone de travail en essuyant avec 75 % d’éthanol, puis exposez la zone à la lumière UV dans un meuble de sécurité biologique pendant 30 minutes.
2. Préparez les éléments suivants en conditions stériles : une boîte de Petri de 60 mm avec 5 mL de milieu STEM, trois boîtes de Petri de 60 mm contenant chacune 5 mL de 1× PBS complétées avec 5 % de pénicilline-streptomycine (P-S), trois boîtes de Petri de 60 mm chacune contenant 5 mL de PBS simple à 1×, et un tube centrifuge stérile de 2 mL
3. Euthanasiez la souris par asphyxie au CO₂ , suivie d’une luxation cervicale.
4. Rincez soigneusement la tête de la souris et les paupières fermées par immersion trois fois dans du PBS contenant 5 % de P-S avant de procéder à l’énucléation.
5. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, réalisez une incision le long du pôle postérieur de chaque globe oculaire et placez soigneusement les yeux isolés dans la boîte de Petri contenant un milieu SHEM glacé (Figure 1A).
   REMARQUE : Pour maximiser la viabilité cellulaire, toutes les solutions doivent être pré-refroidies à 4 °C et toutes les étapes de dissection doivent être effectuées sur de la glace.
6. Transférez immédiatement la boîte de Petri avec les yeux dans un armoire de sécurité biologique. Lavez les globes oculaires trois fois dans 1× PBS contenant 5 % de P-S, en incubant pendant 5 minutes par lavage.
7. Au microscope disséqueur, séparez soigneusement le tissu cornéen : à l’aide de ciseaux ophtalmiques et de pinces, effectuez une incision du pôle postérieur vers le limbus cornéen. Détachez doucement la cornée de la sclère et de la conjonctive le long de la bordure limbaire. Retirez complètement le cristallin et l’iris à l’aide de deux paires de pinces (Figure 1B).
8. À l’aide de pinces ophtalmiques, transférez le tissu cornéen dans une boîte de Petri contenant 1× PBS et lavez trois fois (5 minutes chacun) pour retirer tout tissu non cornéen résiduel et les antibiotiques.
   REMARQUE : L’iris adhère souvent fermement à la cornée. Assurez-vous qu’elle soit retirée doucement et complètement à l’aide de pinces pour éviter toute contamination, ne laissant que le tissu cornéen clair.
9. À l’aide de pinces ophtalmiques, transférez le tissu cornéen nettoyé dans un tube centrifuge de 2 mL et ajoutez 1 mL de solution active de collagénase A (5 mg/mL).
10. À l’aide de ciseaux ophtalmiques, réduisez le tissu cornéen en fragments d’environ 0,5 mm × 0,5 mm directement à l’intérieur du tube.
11. Incubez le tube contenant les fragments cornéens et la solution de collagénase A dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 1 h (Figure 2A-C).
12. Pendant la digestion de la collagénase A, surveillez le tissu toutes les 10 minutes. Arrêter la digestion lorsqu’il ne reste plus de gros fragments de tissu en procédant à la centrifugation. Centrifugez l’échantillon à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante à l’aide d’une centrifugeuse. Aspirez soigneusement le surnageant.
13. Resuspendez la pellete dans 200 μL de solution à 0,25 % de trypsine/EDTA.
14. Incubez le tube dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 10 minutes pour digérer les fragments de tissu restants.

3. Isolement des cellules uniques cornéennes

1. Triturez doucement le mélange (tissu et solution de trypsine/EDTA) à plusieurs reprises à l’aide d’une pipette P1000 à extrémité large pour dissocier le tissu en une suspension unicellulaire.
2. Centrifugez la suspension à 300 x g pendant 5 minutes et jetez le surnageant. Resuspendez le pellet cellulaire dans 1 mL de PBS contenant 0,04 % d’albumine sérique bovine (BSA) pour obtenir une suspension unicellulaire.
   REMARQUE : Pour les cellules destinées au séquençage ou à la cytométrie en flux, resuspendez dans un PBS sans sérum. Pour les cellules qui seront cultivées, utilisez 1x PBS complétée par 0,04 % de BSA.
3. Filtrez la suspension de cellules à travers une tamis de cellule préhumidifiée de 40 μm dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 mL pour éliminer les amas et débris cellulaires.
   REMARQUE : Préhumidifier la tamoire cellulaire avec du PBS pour minimiser la perte cellulaire. Si nécessaire, les cellules filtrées peuvent être centrifugées à nouveau et remises en suspension dans un volume désiré pour la concentration.

4. Comptage des cellules

1. Mélangez 9 μL de la suspension à cellules avec 1 μL de solution de bleu de Trypan à 0,4 % et mélangez doucement.
2. Chargez lentement le mélange dans une chambre d’hémocytomètre via le canal de charge désigné. Comptez les cellules en utilisant la méthode des quatre quadrants pour déterminer le nombre total de cellules, la viabilité et la proportion de cellules individuelles. Effectuez au moins deux réplications techniques.

Résultats

La qualité des suspensions monocellulaires a été évaluée en fonction du rendement total des cellules, de la proportion de cellules uniques et de la viabilité cellulaire. La suspension a été colorée avec du bleu de Trypan et analysée à l’aide de microscopie à contraste de phase sur plusieurs champs (Figure 3). À partir de quatre yeux de souris (huit cornées), un total de 1,05 × 10^{cellules de 5} a été obtenu, avec une viabilité cellulaire moyenne de ...

Discussion

L’introduction du séquençage à ARN unicellulaire a considérablement accru l’utilisation des technologies génomiques, transcriptomiques, épigénétiques et protéomiques dans la recherche oculaire 9,10,11,12. Par conséquent, la préparation de suspensions unicellulaires de haute qualité est devenue de plus en plus cruciale, car elle permet de détecter les variation...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 594 anti-lapin pour l’âne	Abcam	ab150064
Antikératine	Abcam	ab230175
Anti-pancytokératine	Thermo Fisher Scientific	AE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Stérilisateur d’autoclave	An Shen	LDZH-100KBS
Albumine sérique bovine V	Solarbio	A8020
Filtre cellulaire	NEST	258369	40 & mu ; m
Machine centrifuge	Eppendorf AG	22331 Hambourg
Collagénase A	Roche	10103578001
Microscope confocal	; Oberkochen	Zeiss LSM 880
Plaque de comptage	MARIENFELD	M407859
Tube centrifuge	NEST	620611	2 mL, 50 mL
Couverture	MARIENFELD	M407859
DAPI	Solarbio	C0065
Microscope disséquant	Carl ZEISS	VISU150
DMEM/F12  ; Médias	Gibco	11320033
DMSO	Solarbio	D8371
Fœtal  ; bovin  ; Sérum	Gibco	16140071
Hydrocortisone	Solarbio	IH0100
ITS	Gibco	23337619
Facteur de croissance épidermique de la souris	Invitrogen	PMG8041
chirurgie ophtalmique   ; Pinces	Dumot	0208-5-PO
ciseaux chirurgicaux ophtalmiques	FST	15021-15
Four	AISITE	DH6000 II
Pénicilline & Strepttomycine	Gibco	15070063	100 mL
Boîte de Petri	NEST	705201	60mm
Solution physiologice tamponnée au phosphate	Solarbio	P1010
Incubateur thermostatique	Thermo Fisher Scientific	3111
Triton-X 100	Solarbio	T8200
Bleu de Trypan  ;	Solarbio	T8070
Trypsine/EDTA  ;	Gibco	R001100
Table ultra-nettoyante	You Qi	VS-840-2
4 % de paraformaldéhyde	Solarbio	P1110