Microscopie de localisation à une seule molécule des protéines membranaires utilisant le marquage à anticorps unique

Summary

Ce protocole décrit le marquage à anticorps unique (SAL) pour résoudre l’organisation spatiale à l’échelle nanométrique des protéines de la membrane plasmique. En tirant parti des interactions cumulatives anticorps-épitope au niveau de la molécule unique, le SAL membranaire (mSAL) cartographie les distributions locales des épitopes tout en capturant simultanément le comportement de liaison des anticorps dans l’environnement cellulaire natif.

Abstract

La membrane plasmique définit la forme cellulaire et sert d’interface qui régit la communication intercellulaire. Les protéines membranaires constituent une classe majeure de cibles thérapeutiques ; Par conséquent, la super-résolution de la membrane cellulaire à travers ses protéines constitutives présente un grand potentiel pour faire progresser la biologie cellulaire et la thérapie des anticorps. À cet égard, la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) permet la visualisation à l’échelle nanométrique des organisations protéiques sur des structures biologiques. Malgré son importance, l’application de la SMLM aux protéines membranaires plasmiques pose des défis uniques. Dans ce protocole, nous présentons une approche efficace utilisant le marquage à anticorps unique (SAL) en accéléré temporel appelé SAL membranaire (mSAL). Nous fournissons des instructions détaillées étape par étape, incluant l’optimisation de la concentration d’anticorps, la densité de puissance du laser, la durée des intervalles sans illumination, la reconstruction d’images et l’analyse de clusters basée sur la densité, afin de résoudre la distribution des protéines membranaires à l’échelle nanométrique et la morphologie membranaire. Nous utilisons la protéine tétraspanine CD81 comme protéine membrane modèle pour démontrer la capacité de la mSAL sur les cellules mammifères adhérentes et en suspension. En plus de la super-résolution de la membrane cellulaire et des distributions des protéines membranaires, notre technique permet d’étudier la pharmacodynamique des anticorps thérapeutiques interagissant avec leurs cibles membranaires dans l’environnement membranaire natif.

Introduction

La membrane plasmique contient une grande variété de protéines qui régulent la mobilité cellulaire, l’adhésion, la détection et la communication intercellulaire. Comprendre la distribution nanométrique des protéines membranaires plasmiques est important, car la fonction des protéines est souvent régie non seulement par les niveaux d’expression mais aussi par leur organisation spatiale sur la membrane ^1,2. Notamment, de nombreux anticorps thérapeutiques ciblent les protéines^{membranaires 3,4}, rendant les recherches à l’é....

Protocol

Ce protocole utilise les lignées cellulaires Jurkat E6.1 et U2OS établies et n’implique pas de matières humaines ou animales vivantes primaires.

1. Ensemencement/atterrissage et fixation des cellules

REMARQUE : La préparation de l’échantillon suit les protocoles standards de coloration par immunofluorescence (IF), optimisés pour préserver l’organisation subcellulaire des protéines membranaires plasmiques à travers différents types cellulaires. Si un protocole d’immunocoloration établi existe pour la cible d’intérêt, les utilisateurs peuvent suivre ce protocole jusqu’à l’étape 1.2.1....

Results

La technique mSAL décrite dans ce protocole permet de visualiser des événements de liaison d’anticorps uniques à leurs cibles protéiques membranaires plasmatiques correspondantes, produisant une carte super-résolution de la distribution des protéines membranaires. CD81 est utilisé ici comme exemple représentatif, bien que l’approche soit facilement adaptable à d’autres protéines membranaires.

L’immobilisation des lymphocytes T de Jurkat avec un espacement suff.......

Discussion

L’organisation des protéines membranaires plasmiques joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire. Les techniques conventionnelles de microscopie à fluorescence sont limitées par la limite de diffraction de la lumière, masquant ainsi leur organisation à l’échelle nanométrique. Le SMLM surmonte cette limitation en atteignant des résolutions spatiales de 10-20^{nm 47}, permettant la caractérisation de leurs assemblages à l’échelle

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps Alexa Fluor 488 anti-CD81	Thermo Fisher Scientific	MA5-44132	Anticorps d’imagerie
Centrifugeuse de laboratoire	Eppendorf	5424
Albumine sérique bovine	MilliporeSigma	A7906-100G
Verre à couvercle chambré, 8 puits	Cellvis	C8-1-N
Médias DMEM	Thermo Fisher Scientific	11960069
Solution physiologique tamponnée au phosphate de Dulbecco	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Sérum bovin fœtal	MilliporeSigma	F0926-500ML
Glutaraldéhyde, 10 %	Sciences de la microscopie électronique	16120
Colloïdes dorés, 100 nm	Ted Pella	15711 et moins ; 20	Marqueur fiduciaire
Huile d’immersion & nbsp ;	Laboratoires Cargille	16245
Microscope inversé   ; équipé du module TIRF	Nikon Instruments	Eclipse Ti2-E	Microscope
Lignée cellulaire Jurkat E6.1	MilliporeSigma	88042803-1VL	Cellules de suspension
Lancement laser, 6 lignes	Oxxius	L6CC-CS8-1511	Laser d’excitation
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Réactif de transfection
Tube à microcentrifuge, 1,5 mL  ;	VWR	89000-028
Logiciels d’imagerie microscopique	Nikon Instruments	Recherche avancée sur les éléments du NIS	Logiciel d’acquisition d’images
Objective, 100x/1,49 CFI APO TIRF & nbsp ;	Nikon Instruments	MRD01991	Objectif microscope
Paraformaldéhyde, 16 %	Sciences de la microscopie électronique	15710
Pénicilline-Streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140-122	Antibiotiques
Solution de poly-L-lysine, 0,01 % & nbsp ;	MilliporeSigma	P4707-50ML
Caméra Prime 95B sCMOS	Teledyne Vision Solutions	01-PRIME-95B-R-M-16-C	Caméra
Médias RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093	Supports pour cellules de suspension
Azidée de sodium	Thermo Fisher Scientific	19038-1000
Borohydrure de sodium	MilliporeSigma	213462-25G
Fioles de culture T25	Thermo Fisher Scientific	169900
Microsphères TetraSpeck			Marqueur fiduciaire
Plat de culture tissulaire, 100 mm  ;	Corning	353003
Gamme cellulaire U2OS	ATCC	HTB-96	Cellules adhérentes