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Article de méthode

Microscopie de localisation à une seule molécule des protéines membranaires utilisant le marquage à anticorps unique

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DOI :

10.3791/69853

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20 mars 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit le marquage à anticorps unique (SAL) pour résoudre l’organisation spatiale à l’échelle nanométrique des protéines de la membrane plasmique. En tirant parti des interactions cumulatives anticorps-épitope au niveau de la molécule unique, le SAL membranaire (mSAL) cartographie les distributions locales des épitopes tout en capturant simultanément le comportement de liaison des anticorps dans l’environnement cellulaire natif.

Résumé

La membrane plasmique définit la forme cellulaire et sert d’interface qui régit la communication intercellulaire. Les protéines membranaires constituent une classe majeure de cibles thérapeutiques ; Par conséquent, la super-résolution de la membrane cellulaire à travers ses protéines constitutives présente un grand potentiel pour faire progresser la biologie cellulaire et la thérapie des anticorps. À cet égard, la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) permet la visualisation à l’échelle nanométrique des organisations protéiques sur des structures biologiques. Malgré son importance, l’application de la SMLM aux protéines membranaires plasmiques pose des défis uniques. Dans ce protocole, nous présentons une approche efficace utilisant le marquage à anticorps unique (SAL) en accéléré temporel appelé SAL membranaire (mSAL). Nous fournissons des instructions détaillées étape par étape, incluant l’optimisation de la concentration d’anticorps, la densité de puissance du laser, la durée des intervalles sans illumination, la reconstruction d’images et l’analyse de clusters basée sur la densité, afin de résoudre la distribution des protéines membranaires à l’échelle nanométrique et la morphologie membranaire. Nous utilisons la protéine tétraspanine CD81 comme protéine membrane modèle pour démontrer la capacité de la mSAL sur les cellules mammifères adhérentes et en suspension. En plus de la super-résolution de la membrane cellulaire et des distributions des protéines membranaires, notre technique permet d’étudier la pharmacodynamique des anticorps thérapeutiques interagissant avec leurs cibles membranaires dans l’environnement membranaire natif.

Introduction

La membrane plasmique contient une grande variété de protéines qui régulent la mobilité cellulaire, l’adhésion, la détection et la communication intercellulaire. Comprendre la distribution nanométrique des protéines membranaires plasmiques est important, car la fonction des protéines est souvent régie non seulement par les niveaux d’expression mais aussi par leur organisation spatiale sur la membrane 1,2. Notamment, de nombreux anticorps thérapeutiques ciblent les protéinesmembranaires 3,4, rendant les recherches à l’échelle nanométrique essentielles pour comprendre comment les interactions des anticorps sont influencées par l’organisation locale des protéines membranaires. Cependant, la cartographie précise de la distribution des protéines membranaires, le profilage de leur abondance par une seule molécule et la surveillance en temps réel de leurs interactions dynamiques avec leurs partenaires de liaison restent difficiles.

Les techniques de microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) largement utilisées, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)5,6 et l’accumulation de points basée sur l’ADN pour l’imagerie en topographie nanométrique (DNA-PAINT)7, utilisent la coloration par immunofluorescence (FI) pour le marquage des échantillons. Ils atteignent des résolutions latérales de ~ 10 nm et ont fourni des connaissances approfondies sur l’organisation nanométrique des cibles membranaires thérapeutiques, notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2)8,9, CD2010, les récepteurs des cellules T 11,12,13, le ligand de mort programmé1,14, les récepteurs des cellules B 15,16,17 et CD1917,18. Par exemple, des études dSTORM utilisant l’anticorps monoclonal thérapeutique Trastuzumab pour détecter directement HER2, un récepteur clé impliqué dans le cancer du sein, ont révélé des états distincts de regroupement chez les patientesHER2 positives 8, tandis que différents anticorps thérapeutiques ont montré qu’ils modulent le regroupementHER2 9. DNA-PAINT, combiné à la microscopie en feuille lumineuse en réseau, a permis d’élucider les états oligomériques et les profils d’interaction du CD20 dans les cellules B avec les anticorps monoclonaux thérapeutiques rituximab, ofatumumab et obinutuzumab10. Bien que la SMLM conventionnelle offre des informations précieuses sur l’organisation à l’échelle nanométrique, son plein potentiel est limité par les approches traditionnelles de coloration IF. La qualité de l’image SMLM dépend de la coloration FI, qui est à son tour régie par la spécificité et l’affinité de l’anticorps de marquage. La SMLM traditionnelle utilise des anticorps à haute affinité qui permettent généralement d’obtenir une coloration intermittente et une qualité d’image supérieures. Cependant, la plupart des anticorps thérapeutiques interagissent avec les récepteurs membranaires des cellules vivantes avec une affinité modérée afin de minimiser les effets secondaires hors cible19. Par exemple, les engageurs bispécifiques des lymphocytes T (TCE) présentent une affinité plus faible pour le CD3, ce qui empêche l’internalisation desTCR 20,21,22. De telles interactions ne peuvent pas être capturées avec précision par les techniques conventionnelles de FI.

Nous avons déjà développé une stratégie qui exploite directement les interactions anticorps-épitope à une seule molécule, appelée marquage à anticorps unique (SAL). Le SAL permet une cartographie à haute densité des interactions anticorps-épitope tout en préservant les équilibres de liaisonnatifs 23. Bien que nous ayons précédemment rapporté un protocole pour les protéines cytosquelettiques intracellulaires et mitochondriales, la SAL sur les protéines membranaires n’a pas été démontrée. Dans ce protocole, nous proposons un flux de travail étape par étape pour appliquer la SAL aux protéines membranaires, démontré par le marquage de la tétraspanine CD81, candidate candidate thérapeutiquerapportée 25,26,27,28, dans les cellules en suspension et en cellules adhérentes. En utilisant des anticorps anti-CD81 marqués fluorescentement pour sonder directement la distribution spatiale de CD81 sur les cellules U2OS et Jurkat T, nous démontrons l’application d’études à l’échelle nanométrique SAL des protéines membranaires. Nous avons appelé cette stratégie le SAL membranaire (mSAL). Enfin, nous décrivons une stratégie basée sur le regroupement pour réduire les détections isolées d’une seule molécule à l’extérieur de la cellule.

En somme, le SAL utilise un marquage en accéléré à molécule unique pour capturer les interactions individuelles anticorps-épitope, et la déconvolution à un seul émetteur produit une image en super-résolution basée sur le SMLM. En ajustant la concentration des anticorps et en sélectionnant un intervalle non éclairant (NII) approprié entre les images consécutives, le SAL fait correspondre le taux d’activation de l’anticorps au taux de détection d’une seule molécule, permettant la localisation d’une seule molécule. La SAL nécessite des NII plus longues en raison de la cinétique de liaison intrinsèquement lente des anticorps, qui prolonge la durée d’acquisition de l’image (~3-17 h). La SAL convient surtout aux applications nécessitant une cartographie précise à l’échelle nanométrique des épitopes et l’évaluation de la dynamique des interactions individuelles entre les anticorps et les épitopes. Malgré son débit plus faible, le SAL offre une compréhension unique de l’organisation des épitopes et de l’engagement des anticorps dans des conditions proches de la physiologie, ce qui le rend particulièrement précieux pour caractériser les anticorps thérapeutiques in situ.

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Protocole

Ce protocole utilise les lignées cellulaires Jurkat E6.1 et U2OS établies et n’implique pas de matières humaines ou animales vivantes primaires.

1. Ensemencement/atterrissage et fixation des cellules

REMARQUE : La préparation de l’échantillon suit les protocoles standards de coloration par immunofluorescence (IF), optimisés pour préserver l’organisation subcellulaire des protéines membranaires plasmiques à travers différents types cellulaires. Si un protocole d’immunocoloration établi existe pour la cible d’intérêt, les utilisateurs peuvent suivre ce protocole jusqu’à l’étape 1.2.14 de blocage d’échantillon. Le marquage à anticorps unique (SAL) repose sur la détection cumulative des anticorps marqués par fluorescence lorsqu’ils se lient à leur antigène au niveau de la molécule unique. Des anticorps marqués fluorescentement, dilués dans un tampon d’imagerie, sont ajoutés aux échantillons sur l’étage du microscope, et le marquage fluorescent se produit dynamiquement au fur et à mesure de l’acquisition de l’image. Aucun marquage fluorescent n’est effectué pendant la phase de préparation de l’échantillon.

  1. Préparez les cellules adhérentes, telles que la lignée cellulaire U2OS, comme décrit dans un protocole24 publié précédemment.
  2. Suspensions de cellules
    1. Maintenir les cellules T de Jurkat à une densité de 1 x10 5 à 1 x10 6 cellules/mL dans 10 mL de milieux RPMI complets (RPMI 1640 complétée avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à 37 °C dans un incubateur humidifié complété à 5 % deCO-2.
      REMARQUE : Les 10 mL recommandés de média complet s’appliquent aux flasques T25 ; Les utilisateurs doivent adapter le volume en conséquence lorsqu’ils utilisent différents récipients de culture.
    2. Préparez la surface du verre en ajoutant 200 μL de solution de poly-L-lysine (PLL) à 0,01 % dans les puits destinés à être utilisés dans un verre à 8 puits à couver. Couver toute la nuit à 4 °C ou pendant 2 heures à 37 °C.
    3. Comptez les cellules issues de la culture à l’aide d’un hémocytomètre, puis transférez 3,5 x 104 cellules dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      REMARQUE : Le nombre de cellules peut devoir être ajusté pour obtenir une bonne répartition des cellules individuelles. Une plage de semis de 30 000 à 60 000 cellules T Jurkat atteint une densité idéale où les cellules individuelles sont clairement séparées les unes des autres sans être trop dispersées. Le nombre de cellules peut devoir être ajusté pour un nouveau type cellulaire.
    4. Centrifugez à 300 x g pendant 3 minutes pour obtenir un pellet de cellule. Éliminez le surnageant et remettez la pellete en suspension dans 200 μL de solution pré-chauffée (37 °C) 1x solution de phosphate tamponnée de Dulbecco (DPBS). La granule cellulaire résultante sera visible sous forme d’un petit dépôt blanc au fond du tube de la microcentrifugeuse.
      REMARQUE : Éliminer les déchets bio-dangereux conformément aux directives de l’institution et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.
    5. Aspirez la solution PLL à partir du verre de recouvrement chambré préparé (étape 1.2.2). Si l’incubation du PLL a lieu toute la nuit à 4 °C, préchauffez le verre de couverture à 8 puits à 37 °C avant d’aspirer la solution.
    6. Ajoutez la suspension à cellules de l’étape 1.2.4. sur le puits de chambre recouvert de PLL. Incubez dans un incubateur humidifié à 37 °C complété avec 5 % deCO2 pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de s’attacher à la surface. Mélangez soigneusement la suspension des cellules avant de la plaquer et pipettez de haut en bas pour casser les amas cellulaires et assurer une distribution uniforme dans le puits.
    7. Vérifiez l’attache de la cellule à la surface du verre à l’aide d’un microscope optique. Sous un grossissement de 10x, concentrez le microscope sur le dessous du verre de couverture.
      REMARQUE : Tapoter doucement le verre de la chambre pendant l’observation au microscope peut aider à évaluer si les cellules se sont attachées à la surface ou flottent encore.
    8. Préparez 200 μL de tampon de fixation (4 % de paraformoldéhyde et 0,1 % de glutaraldéhyde dans le DPBS) et préchauffez-le à 37 °C dans un bain-marie.
      REMARQUE : Le tampon de fixation fourni est optimisé pour CD81 et est généralement adapté à la préservation des protéines membranaires. Pour de nouvelles cibles protéiques membranaires, la composition du tampon peut devoir être ajustée afin d’obtenir une préservation optimale. Les utilisateurs sont encouragés à consulter la littérature pour des conditions de fixation adaptées à de nouvelles cibles.
      ATTENTION : Le paraformoldéhyde est toxique et cancérigène. Le glutaraldéhyde est toxique et corrosif. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lors de la manipulation de ce réactif. En cas de contact cutané, lavez immédiatement soigneusement la zone affectée avec du savon et de l’eau. Éliminez le réactif conformément aux directives de l’établissement de l’utilisateur et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.
    9. Aspirez le DPBS de chaque puits d’échantillon (de l’étape 1.2.6) à l’aide d’une micropipette.
      REMARQUE : Il est crucial d’effectuer toutes les étapes d’échange de solution lentement afin d’éviter de déloger les cellules du verre de recouvrement. Éliminez les déchets bio-dangereux conformément aux directives de l’établissement de l’utilisateur et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.
    10. Ajoutez 200 μL de tampon de fixation préchauffé à 37 °C dans un coin du puits et incubez à température ambiante pendant 15 minutes.
      ATTENTION : Le paraformoldéhyde est toxique et cancérigène. Le glutaraldéhyde est toxique et corrosif. Portez des équipements de protection appropriés lors de la manipulation de ces réactifs. En cas de contact cutané, lavez immédiatement soigneusement la zone affectée avec du savon et de l’eau. Éliminez le réactif conformément aux directives de l’établissement de l’utilisateur et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.
    11. Lavez les cellules fixes 3 fois avec 500 μL de DPBS. Sauter cette étape si vous poursuivez l’étape 1.2.12.
    12. Optionnel : retirez lentement la solution de fixation et ajoutez 200 μL de borohydrure de sodium à 0,1 % fraîchement préparé dans un DPBS, puis incubez à température ambiante pendant 7 minutes. Saute cette étape et passe à l’étape 1.2.14 si tu n’utilises pas la réduction du borohydrure de sodium.
      REMARQUE : La réduction avec le borohydrure de sodium aide à atténuer l’autofluorescence générée par le glutaraldéhyde et neutralise les aldéhydes non réagis. La libération d’hydrogène gazeux résultant de la réaction du borohydrure de sodium avec la solution aqueuse se manifestera par la libération de bulles. Si la libération d’hydrogène n’est pas observée, utilisez une solution fraîchement préparée de borohydrure de sodium.
      ATTENTION : Le borohydrure de sodium est toxique et corrosif. Portez des équipements de protection appropriés lors de la manipulation de ce réactif. En cas de contact cutané, lavez immédiatement soigneusement la zone affectée avec du savon et de l’eau. Éliminez le réactif conformément aux directives de l’établissement de l’utilisateur et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.
    13. Aspirez la solution de borohydrure de sodium de chaque puits, puis lavez trois fois avec 500 μL de DPBS.
    14. Préparez 200 μL de tampon de blocage et ajoutez-les au puits. Incubez à température ambiante pendant 30 minutes. N’utilisez pas de réactif de perméabilisation (par exemple, TritonX-100, saponine), car il pourrait retirer des protéines membranaires. Le protocole membrane SAL (mSAL) présenté ici pour CD81 n’incluait pas d’étape de blocage.
      REMARQUE : Un tampon de blocage contenant 5 % (v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans le DPBS est recommandé pour le mSAL avec de nouvelles cibles. Lors de l’utilisation d’anticorps secondaires, le sérum correspondant est utilisé pour le blocage. Par exemple, un sérum de chèvre à 10 % (v/v) dans le DPBS lors de l’utilisation d’un anticorps secondaire chèvre-hôte. Si une recette de tampon de blocage établie et un protocole existent pour la cible, les utilisateurs peuvent suivre ce protocole. Le tampon bloquant peut être éventuellement complété par des anticorps témoins d’isotype ou des anticorps dérivés du sérum afin de réduire les liaisons hors cibledes anticorps 23,24. N’inclure un réactif de perméabilisation dans le tampon bloqueant que si l’anticorps cible un épitope intracellulaire de la protéine membranaire.
    15. Pour le mSAL avec anticorps primaires conjugués en colorant, il faut passer directement à l’étape 1.2.20.
    16. Préparez 150 μL de la solution primaire de coloration par anticorps (anticorps à la concentration désirée dilué dans le tampon bloquant). Sautez cette étape pour le mSAL avec des anticorps primaires conjugués au colorant.
      REMARQUE : Pour la coloration primaire des anticorps, consultez la fiche technique du fournisseur pour les conditions recommandées. Si les informations de concentration ne sont pas fournies, commencez par 4 μg/mL (27 nM) pour une IgG de longueurcomplète 23,24.
    17. Remplacez le tampon bloquant par la solution primaire d’anticorps. Incubez à température ambiante pendant 2 heures ou à 4 °C toute la nuit dans une chambre humide. Sautez cette étape pour le mSAL avec des anticorps primaires conjugués au colorant.
    18. Lavez l’échantillon deux fois avec 400 μL de DPBS. Ajoutez 200 μL de tampon de blocage au puits.
    19. Optionnel : Remplacer le tampon de blocage par 200 μL de tampon post-fixation (4 % de paraformodéhyde) et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : La post-fixation aide à préserver le blocage des échantillons pourSAL 23,24. Cependant, cette étape doit être omise si elle réduit l’accessibilité de l’épitope. Pour évaluer l’effet de la post-fixation sur la reconnaissance des épitopes par les anticorps, effectuer une coloration par immunofluorescence standard avec et sans post-fixation, et comparer la qualité de la coloration.
    20. Optionnel : Laver l’échantillon deux fois avec du DPBS.
    21. Ajoutez 200 μL de DPBS dans chaque puits et couvrez la chambre d’un film transparent pour éviter l’évaporation. Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois. Si vous effectuez la mSAL immédiatement après l’étape 1.2.14, ou 1.2.19 sans post-fixation, gardez l’échantillon dans le tampon de blocage et passez directement à l’étape 2.2.
      REMARQUE : Maintenir l’échantillon dans un DPBS complété avec 5 mM d’azide de sodium empêchera la croissance bactérienne pendant le stockage.
      ATTENTION : L’azide de sodium est extrêmement toxique et peut être fatale si elle est ingérée. Portez des équipements de protection appropriés lors de la manipulation de ce réactif. En cas de contact cutané, lavez immédiatement soigneusement la zone affectée avec du savon et de l’eau. Éliminez le réactif conformément aux directives de l’établissement de l’utilisateur et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.

2. Acquisition d’images

REMARQUE : La procédure d’imagerie pour les cellules adhérentes et suspendues est similaire et est réalisée à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). Cependant, les conditions d’imagerie doivent être optimisées pour chaque type cellulaire.

  1. Laissez les échantillons stockés (à 4 °C) atteindre la température ambiante avant l’imagerie afin d’éviter la condensation sur le verre. Sauter cette étape si vous passez directement à l’imagerie après la préparation de l’échantillon.
  2. Allumez le système de microscope : microscope, caméra sCMOS, unité laser et ordinateur avec le logiciel d’acquisition d’images. Laissez le système de microscope se stabiliser pendant 5 à 10 minutes après l’allumage afin de permettre aux composants du système d’atteindre la température de fonctionnement et de minimiser la dérive thermique.
    REMARQUE : le mSAL peut être réalisé avec n’importe quel microscope TIRF et un logiciel compatible. Allumez le système selon les instructions de l’instrument.
  3. Appliquez de l’huile d’immersion sur un objectif TIRF (par exemple, 100x/1,49) et montez le verre de couverture chambré sur l’étage du microscope.
    REMARQUE : Si l’objectif est équipé d’un collier de correction, assurez-vous qu’il est réglé à l’épaisseur correcte du verre de couverture à 23 °C. Le verre de couverture utilisé dans cette étude avait une épaisseur de 0,13 à 0,17 mm.
  4. Si équipé, activez le système de mise au point parfait (PFS), puis soulevez prudemment l’objectif vers la vitre de couverture et mettez l’échantillon au point.
  5. Préparez des colloïdes d’or comme marqueurs fiduciaux (dilution 1:2 dans de l’eau ultra-pure). Soniser les colloïdes d’or avant dilution pendant 3 minutes pour disperser les agrégats.
  6. Aspirez doucement le tampon de stockage (DPBS ou tampon de blocage) du puits d’échantillon et ajoutez 200 μL de solution colloïde d’or à l’échantillon. Incubez pendant 1 minute puis retirez la solution.
  7. Utilisez l’éclairage en champ clair pour vérifier qu’un nombre suffisant de colloïdes d’or ont été déposés avant d’aspirer la solution. Une densité idéale se compose de 5 à 10 colloïdes dorés dans la région d’intérêt désignée (ROI).
    REMARQUE : Alternativement, les microsphères fluorescentes (voir Tableau des matériaux) peuvent être utilisées avec une dilution de 1:1 000 en DPBS.
  8. Laver 1 fois avec 500 μL d’eau ultra-pure pour éliminer l’excès de colloïdes d’or, puis ajouter 200 μL de DPBS.
  9. Dans le logiciel d’imagerie, créez la configuration optique du fluorophore (de la sonde anticorps), incluant la dichroïque appropriée, la longueur d’onde d’excitation laser appropriée, la densité de puissance, le temps d’intégration de la caméra, le filtre d’émission et le binning des pixels de la caméra (le cas échéant). Une taille de pixel de 150 à 160 nm est recommandée pour obtenir une résolution optimale.
  10. Créez une configuration optique pour une étape de photoblanchiment. Une puissance laser de 380 W/cm2 ou plus avec un temps d’intégration de la caméra de 1 s est recommandée.
    REMARQUE : Le photoblanchiment lors de l’acquisition aide à minimiser le chevauchement entre les événements de liaison des anticorps fluorescents individuels. La lumière collectée peut être dirigée à travers un filtre d’émission avec une longueur d’onde non correspondante afin d’éviter la saturation de la caméra.
  11. Ajustez l’angle laser pour établir l’éclairage TIRF. En utilisant l’éclairage en champ clair, identifiez une cellule pour la mSAL. Assurez-vous qu’au moins 5 colloïdes dorés sont visibles dans le ROI pour corriger la dérive des étages lors de la reconstruction de l’image. Confirmez l’autofluorescence des colloïdes dorés à la densité de puissance du laser d’imagerie.
  12. Définissez les paramètres d’imagerie : intervalle non éclairant (NII), nombre d’images et fréquence de l’étape de photoblanchiment (si nécessaire) dans le logiciel d’acquisition d’image. Pour le mSAL de CD81 sur les cellules U2OS et Jurkat T avec anticorps CD81, les réglages optimaux étaient un NII de 5 s, 2 000 images au total, et une étape de photoblanchiment toutes les 5 images.
    REMARQUE : Ces paramètres doivent être optimisés pour chaque protéine d’intérêt, l’anticorps utilisé pour le mSAL et le type cellulaire. Consultez l’étape 3 pour plus de détails sur l’optimisation. Le nombre optimal de cadres peut varier selon la cible de l’anticorps ainsi que selon le type cellulaire. Pour les nouveaux systèmes cibles, il est recommandé de capturer entre 2 000 et 3 000 images comme point de départ. Les NII prolongent la durée d’acquisition des images. Par exemple, une acquisition mSAL de 3 000 images avec un NII de 20 s entraîne ~17 h de temps d’acquisition.
  13. Préparez le tampon d’imagerie en diluant l’anticorps CD81 à une concentration de 1 μg/mL dans 200 μL de 5 % de BSA (p/v) dans DPBS. Pour le mSAL de CD81, la concentration finale d’anticorps était de 0,5 nM pour les cellules Jurkat T et de 2 nM pour les cellules U2OS.
    REMARQUE : La concentration d’anticorps dépend de l’abondance locale du substrat et de l’affinité de l’anticorps. Il est essentiel d’optimiser les concentrations d’anticorps pour chaque cible protéique, chaque anticorps utilisé pour l’imagerie et chaque type cellulaire. Consultez l’étape 3.1 pour plus de détails sur l’optimisation.
  14. Ajoutez le tampon d’imagerie préparé au puits et commencez l’acquisition.

3. Optimisation des paramètres d’imagerie

REMARQUE : les paramètres d’imagerie du mSAL sont influencés par l’expression de la protéine, son organisation locale et le choix de l’anticorps utilisé pour l’imagerie. L’objectif d’optimiser les paramètres d’imagerie est d’identifier la concentration d’anticorps et les NII qui produisent des événements à molécule unique résolus spatialement tout en maintenant des densités suffisamment élevées pour maximiser l’échantillonnage épitopique.

  1. Concentration d’anticorps
    1. Diluez l’anticorps à 0,5 nM pour les cellules Jurkat et 2 nM pour les cellules U2OS dans 200 μL de 5 % (p/v) de BSA dans le DPBS et ajoutez la solution d’anticorps au puits. Pour un marquage optimal à un seul anticorps, utiliser une concentration d’anticorps à ou près de sa constante de dissociation d’équilibre (Kd) ; si Kd est inconnu, il est recommandé de commencer à 1 nM.
    2. Utilisez la fonction de vue en direct dans le logiciel d’imagerie configuré pour le mSAL afin de surveiller la liaison des anticorps.
    3. Ajustez l’angle TIRF et les paramètres d’imagerie pour obtenir un rapport signal/bruit (SNR) de ≥ 3.
      REMARQUE : Un angle TIRF optimal améliore le SNR en limitant la fluorescence hors focus due à la diffusion des anticorps dans le tampon d’imagerie. Une densité de puissance laser de 100-200 W/cm2 et un temps d’intégration caméra de 50 ms peuvent être utilisés au départ. Si le SNR est faible, augmentez progressivement la puissance du laser et/ou le temps d’intégration de la caméra et surveillez les changements du SNR jusqu’à atteindre une valeur optimale.
    4. Configurez les paramètres d’imagerie dans le logiciel d’acquisition d’image pour obtenir au moins une acquisition de 10 images avec un NII de 5 s (voir étape 2.12).
      REMARQUE : Un NII de 5 s est recommandé comme point de départ. Un scan de la NII doit être réalisé pour identifier la NII optimale pour un nouveau système anticorps-cible (étape 3.2).
    5. Commencez l’acquisition. Évaluer la rareté des localisations monomoléculaires du film enregistré.
      REMARQUE : Les étapes détaillées pour obtenir la densité de localisation sont décrites dans une publicationprécédente 24. Une densité de localisation d’une seule molécule entre 0,02 et 0,15 événement/μm 2 s’est avérée optimale pour le mSAL.
    6. Si plusieurs événements de liaison anticorps chevauchants sont observés immédiatement après l’ajout du tampon d’imagerie ou si des localisations sur une seule molécule s’accumulent au fil du temps au fil de l’enregistrement, l’acquisition est annulée. Réduisez la concentration d’anticorps de deux fois et répétez l’acquisition sur un nouvel échantillon. Répétez ce processus de réduction par deux la concentration d’anticorps et réévaluez le nombre d’événements par unité de surface jusqu’à atteindre la densité d’événements de localisation de la molécule unique souhaitée.
      REMARQUE : Les événements qui se chevauchent se manifestent par plusieurs grands points qui deviennent plus lumineux ou plus grands lors de la liaison d’un nouvel anticorps dans la limite de diffraction du premier anticorps.
    7. Si la densité d’événements est clairsemée, augmentez la concentration d’anticorps dans le tampon d’imagerie de deux fois et répétez l’acquisition sur un nouvel échantillon. Répétez ce processus d’augmentation par deux la concentration d’anticorps et réévaluez le nombre d’événements de liaison par unité de surface jusqu’à atteindre la densité souhaitée d’événements de localisation d’une seule molécule.
      REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un nouvel échantillon pour chaque essai d’optimisation de concentration afin d’éviter d’éventuelles interférences d’anticorps pré-liés lors des évaluations ultérieures de densité de localisation.
  2. Optimisation NII
    1. Configurez les paramètres d’imagerie dans le logiciel d’acquisition d’image pour obtenir une acquisition de 50 images (voir étape 2.12). Réglez le NII à 0 (sans délai).
    2. Préparez le tampon d’imagerie à la concentration optimisée d’anticorps de l’étape 3.1 et ajoutez-le au puits d’échantillon. Commencez l’acquisition.
    3. Répétez les étapes 3.2.1-3.2.2, en ajustant les NII à 1, 3, 5, 10 ou 20 s. Effectuez chaque acquisition sur un nouvel échantillon.
    4. Évaluer la densité et la rareté des localisations monomoléculaires du film enregistré (voir les étapes 3.1.5-3.1.7). Le NII le plus bas avec la densité optimale d’événements de molécule unique est déterminé comme le NII optimal.
      REMARQUE : La concentration d’anticorps peut devoir être optimisée davantage pour atteindre une densité optimale de localisation de molécule unique pour le NII correspondant. Référez-vous à l’étape 3.1. Des rapports précédents montrent que les NII plus longs (10-20 s) étaient plus sélectifs face aux événements de liaison à densité plus élevée, mais l’extension des NII au-delà de 20 s n’a pas apporté d’amélioration supplémentaire23,24. Si des événements de liaison qui se chevauchent spatialement surviennent au fil de l’acquisition de l’image, introduire une étape de photoblanchiment à intervalles suffisants pour éliminer la fluorescence des anticorps liés. Par exemple, si des événements qui se chevauchent apparaissent à la cinquième image, appliquez un photoblanchiment toutes les cinquième images. L’apparition d’événements qui se chevauchent spatialement est décrite dans la NOTE de l’étape 3.1.6.

4. Analyse des données

REMARQUE : la reconstruction d’image mSAL utilise le logiciel gratuit NIH, Fiji29, avec le plugin ThunderSTORM30 . Les versions Fiji v1.54r et ThunderSTORM version 1.3 ont été utilisées dans ce protocole. Une analyse d’image détaillée a été décrite dans un protocole précédent 24. Dans cette section, nous décrivons le flux de travail d’analyse utilisé spécifiquement pour le mSAL. L’analyse présentée dans ce protocole utilisait une caméra Prime95B sCMOS (numéro de série A18B203004) avec des photoélectrons par diamètre A/D de 0,98, et un niveau de base de la caméra de 100. La taille du pixel d’image est réglée à 147 nm.

  1. Définissez les paramètres de la reconstruction dans la fenêtre d’analyse de la course. Les paramètres utilisés pour les reconstructions d’images CD81 mSAL sont décrits ci-dessous. La fonction Aperçu doit être utilisée pour évaluer les événements de liaison à une seule molécule détectés dans le référentiel sélectionné avant d’exécuter l’analyse complète.
    Filtrage d’image :
    Filtre : Filtre à ondelettes (B-spline)
    Ordre des B-Splines : 2
    Échelle B-Spline : 4
    Localisation approximative des molécules :
    Méthode : Maximum local
    Seuil d’intensité maximale : STD (Onde.F1)
    Connectivité : 8-quartiers
    Localisation sous-pixel des molécules :
    Méthode : PSF : Gaussienne intégrée
    Rayon d’ajustement [px] : 2
    Méthode d’ajustement : Vraisemblance maximale
    Sigma initial [px] : 0,75
    Analyse de l’ajustement multiémetteur : non sélectionné
    Visualisation des résultats :
    Méthode : Gaussienne normalisée
    Grossissement : 7,3
    Fréquence de mise à jour [images] : 50
    Incertitude latérale : 20
    REMARQUE : Les paramètres de pré-filtrage sont utilisés pour améliorer la détection d’un seul émetteur sur le fond de fond. Ils servent de points de départ mais doivent être optimisés pour chaque jeu de données. Les paramètres approximatifs de localisation et de détection sont utilisés pour les événements de liaison à une seule molécule. L’utilisation de maxima d’intensité locale avec une connectivité à 8 voisinages s’avère fournir une performance fiablede 31. La méthode gaussienne intégrée avec ajustement à vraisemblance maximale a été choisie car elle est largement utilisée et fournit une approximation fiable de la fonction d’étalement ponctuel (PSF) dans les applications d’imagerie à moléculeunique 32,33,34,35. La méthode de visualisation utilisée dans ce protocole est la Gaussienne Normalisée. Les utilisateurs peuvent choisir la méthode de visualisation qui correspond le mieux à leurs données. Le grossissement a été réglé pour obtenir une taille de pixel reconstruite de 20 nm, ce qui convient à la précision de localisation attendue avec un marquage basé sur les anticorps, où l’erreur de liaison est de l’ordre de ~10 nm. Le facteur de grossissement de 7,3 a été calculé en divisant la taille du pixel limitée par la diffraction par la taille de pixel reconstruite souhaitée (147 nm / 20 nm = 7,3). La fréquence de mise à jour détermine la fréquence à laquelle l’image reconstruite est rafraîchie pendant le traitement, mais elle n’influence pas le résultat final. L’incertitude latérale est fixée à 20 (mais non forcée) afin que la reconstruction intègre les incertitudes de localisation calculées. Pour plus de détails sur les options disponibles, consultez le Guide utilisateur30 de ThunderSTORM ou cliquez sur le point d’interrogation à côté du champ de saisie.
  2. Commencez l’analyse ThunderSTORM avec un sigma initial de 1,6 pixel et un rayon d’adéquation de 3. Affinez les paramètres si nécessaire. Un raccord multi-émetteurs n’a pas été utilisé, car les densités d’événements étaient maintenues non chevauchantes dans les images limitées par la diffraction.
  3. Cliquez sur Ok pour lancer la reconstruction. Une fois terminé, la fenêtre des résultats s’ouvrira automatiquement.
  4. Utilisez la fonction histogramme Plot pour trouver le pic sigma. Convertir cette valeur (nm) en pixels en divisant par la taille brute des pixels, puis relancer l’analyse ThunderSTORM en utilisant la nouvelle valeur pour sigma initiale et le rayon d’ajustement fixé à un entier proche de 3x sigma30 initial.
  5. Déterminez la correction de dérive à l’aide du marqueur fiduciairesélectionné 24.
  6. Effectuez la reconstruction de l’image sur tout le champ de vision et appliquez la correction de dérive calculée.
  7. Pour le post-traitement de l’image, cliquez sur l’onglet Filtrer de la fenêtre des résultats. Appliquez des filtres pour supprimer les événements mal localisés. Dans les résultats affichés pour CD81, les événements avec un sigma supérieur à 200 nm et une incertitude supérieure à 20 nm ont été supprimés. Utilisez la fonction histogramme Plot pour examiner la distribution sigma et déterminer un seuil approprié.
    REMARQUE : Les localisations de molécule unique avec de grandes valeurs sigma proviennent généralement de fluorophores faibles avec un faible nombre de photons ou d’émetteurs qui se chevauchent. Les localisations avec une incertitude supérieure à 20 nm ont également été supprimées, car une incertitude dépassant la taille finale du pixel indique une faible précision de localisation. Pour des conseils supplémentaires sur les paramètres de filtrage, consultez le Guide utilisateur30 de ThunderSTORM.
  8. Sauvegardez la table des résultats avec les données de localisation d’une seule molécule pour les analyses en aval en sélectionnant Exporter. Le fichier exporté sera dans .csv format et désigné comme mSAL.csv dans ce protocole. Sauvegardez l’image Gaussienne normalisée résultante.

5. Analyse de cluster

REMARQUE : Lors du sondage de l’épitope, les anticorps interagissent avec leurs cibles visées (interactions spécifiques) ainsi qu’avec les molécules hors cible (interactions non spécifiques). Parce que le mSAL repose sur la détection cumulative d’événements de liaison anticorps-antigène uniques, certaines interactions non spécifiques contribuent inévitablement à la reconstruction de l’image. Les interactions anticorps-épitope présentent des empreintes cinétiques distinctes qui peuvent, en principe, distinguer la liaison spécifique de la non spécifique, où les événements spécifiques et non spécifiques sont différenciés par leur densité d’interaction locale, plutôt que par la présence d’une seule moléculemultipliée par 36. Ici, une analyse DBSCAN,37 basée sur la densité spatiale (regroupement spatial des applications avec bruit)37 est décrite pour éliminer les événements de faible densité, conservant ainsi les événements à haute densité plus susceptibles de refléter une liaison spécifique d’anticorps. De plus, le regroupement basé sur la densité peut également fournir des informations quantitatives sur l’organisation spatiale à l’échelle nanométrique des protéines, en particulier celles connues pour s’organiser naturellement en amas, comme CD81 dans les microdomaines enrichis entétraspanine 38,39,40,41,42. L’analyse DBSCAN fournie a été réalisée à l’aide de MATLAB 2025a. Pour les utilisateurs sans accès à MATLAB, il est recommandé de réaliser des analyses DBSCAN similaires avec des alternatives open source telles que Python ou R 43,44,45. Le code utilisé dans ce protocole peut être obtenu à partir de : https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Exécution du code
    1. Téléchargez le fichier MATLAB depuis le lien GitHub ci-dessus.
    2. Lance MATLAB et ouvre le code. Sur les lignes 37 et 38, fixez le nombre minimum de points (minPTS) et d’epsilon pour les paramètres de clusterisation. Les paramètres suivants ont été utilisés :
      Lymphocytes T Jurkat :
      minPTS : 7
      Epsilon : 60
      Cellules U2OS :
      minPTS : 7
      Épaule : 80
      REMARQUE : Voir l’étape 5.2 pour plus de détails sur l’optimisation de ces paramètres.
    3. Définissez le chemin du fichier dans le logiciel MATLAB vers le dossier contenant le fichier mSAL.csv reconstruit.
    4. Exécutez le code en cliquant sur Exécuter. Le code invitera l’utilisateur à sélectionner un fichier. Sélectionnez le fichier mSAL.csv et cliquez sur Ouvrir.
    5. Les données regroupées sont automatiquement sauvegardées dans le dossier nommé MATLAB Data dans le chemin de fichier désigné dans le code. Ouvrez ce fichier dans ThunderSTORM en cliquant sur Plugins > ThunderSTORM > Importer/Exporter > Importer résultats.
    6. Sauvegardez l’image résultante de la microscopie de localisation à une seule molécule.
  2. Optimisation des entrées de clustering
    REMARQUE : Les deux paramètres d’entrée pour l’algorithme DBSCAN sont le minPTS et l’epsilon. Epsilon définit le rayon autour d’un point pour établir son voisinage, tandis que minPTS spécifie le nombre minimum de points dans ce voisinage requis pour former une région dense. Les points qui satisfont à cette exigence de densité sont classés comme points centraux, et leurs voisinages sont ajoutés récursivement au groupe. Les points qui ne répondent pas à l’exigence de densité mais se situent dans le voisinage d’un point de noyau sont étiquetés comme points de bordure, tandis que tous les points restants sont considérés comme des points de bruit.
    1. Effectuez l’analyse en utilisant les entrées décrites ci-dessus (étape 5.1.2) comme point de départ. Choisissez une valeur minPTS supérieure au nombre de localisations du bruit mais inférieure au nombre de localisations sur la cellule. Après avoir sélectionné minPTS, ajustez l’épsilon afin que ce nombre de localisations puisse être capturé dans le rayon de voisinage pour les régions représentatives sur la cellule.
      REMARQUE : minPTS et epsilon peuvent être ajustés indépendamment. Une approche pratique pour sélectionner ces paramètres consiste d’abord à examiner le diagramme de points de bruit à l’extérieur de la cellule et à les comparer au nombre de localisations observées dans des zones de taille similaire sur la cellule.
    2. Évaluez la fenêtre intitulée Figure 2 représentant les données regroupées. Si les données conservent des regroupements sur la cellule contenant le phénotype attendu avec des localisations minimisées à l’extérieur de la cellule, les entrées de regroupement sont suffisantes.
      REMARQUE : Les données regroupées doivent conserver la structure des données acquises à l’aide de mSAL. Si les groupes paraissent petits, localisés uniquement aux régions à très haute densité des données originales, et excluent un nombre significatif d’événements de liaison corrélés au phénotype attendu, les paramètres de regroupement peuvent être trop restrictifs. Si la liaison non spécifique à l’extérieur de la cellule n’est pas suffisamment réduite avec de grands groupes, les paramètres de regroupement peuvent être trop inclusifs.
    3. Si les paramètres de regroupement sont trop restrictifs, diminuez le minPTS et augmentez l’epsilon pour inclure plus de points dans les données regroupées. Si les paramètres de regroupement sont trop inclusifs, augmentez le minPTS et diminuez l’epsilon.
    4. Après avoir ajusté le minPTS et l’epsilon, relancez le code. Répétez les étapes 5.2.2-5.2.3 jusqu’à ce que le clustering optimal soit atteint.

6. Validation de la liaison des anticorps à sa cible

REMARQUE : Pour les protéines membranaires sans morphologie bien définie, valider la précision des structures résolues peut être difficile. Pour valider la spécificité des anticorps, les utilisateurs peuvent exprimer une fusion protéique fluorescente (FP) de la protéine cible. À titre de premier contrôle, une coloration conventionnelle par immunofluorescence peut être réalisée sur les cellules exprimant la fusion FP. Pour une validation plus précise lors de l’évaluation de nouveaux anticorps, il est possible de réaliser un mSAL sur les cellules exprimant FP afin de confirmer que les événements de liaison localisés correspondent à la cible marquée par fluorescence. Ici, un protocole pour transfecter les cellules U2OS avec CD81-mStayGold est décrit comme exemple, permettant de confirmer que les localisations mSAL CD81 correspondent au CD81 marqué FP à la surface de la cellule. Les utilisateurs peuvent substituer n’importe quelle protéine fluorescente appropriée, à condition que son émission ne chevauche pas le canal de fluorescence de l’anticorps validé.

  1. Semez les cellules U2OS dans une diapositive à chambre à 8 puits et atteignent une confluence de ~70 %. Maintenir les cellules dans 200 μL de milieu de croissance complet (DMEM complété avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
  2. Combinez 100 ng du construct ADN codant pour la protéine avec un reporter fluorescent contenant 5 μL de Lipofectamine 2000. Vortex pendant 30 s et incubation pendant 30 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Cette étude a utilisé CD81 fusionné avec mStayGold. Des techniques standard de clonage moléculaire ont été employées pour générer des plasmides d’ADN, bien que celles-ci ne soient pas décrites dans ce protocole. Les rapports ADN : Lipofectamine fournis sont optimisés pour les cellules ensemencées sur des lames à 8 puits et peuvent nécessiter un ajustement selon les instructions du fabricant pour d’autres formats d’échantillons.
  3. Ajoutez 5 μL de solution d’ADN/lipofectamine aux cellules. Incubez la lame de chambre pendant 4 heures à 37 °C, complétée avec 5 % deCO2 dans un environnement humide.
  4. Remplacez le substrat par un média de croissance complet préchauffé. Incuber pendant > 8 heures à 37 °C complétés avec 5 % deCO2 dans un environnement humide afin de permettre des niveaux détectables d’expression protéique.
  5. Évaluer les niveaux d’expression de fluorescence sur les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence ou d’un imageur. Une efficacité de transfection de ≥ 30 % est recommandée. Si les niveaux d’expression fluorescente sont sous-optimaux, il faut optimiser le rapport ADN : Lipofectamine selon les directives du fabricant.
    REMARQUE : Les cellules à expression transitoire doivent être utilisées pour la validation des anticorps dans les 24 à 48 heures suivant la transfection.
  6. Pour réparer les cellules, veuillez suivre les étapes 1.2.8-1.2.13.
  7. Conservez les échantillons fixés dans 200 μL de DPBS avec 5 mM d’azide de sodium jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’imagerie. Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois.
    ATTENTION : L’azide de sodium est extrêmement toxique et peut être fatale si elle est ingérée. Portez des équipements de protection appropriés lors de la manipulation de ce réactif. En cas de contact cutané, lavez immédiatement soigneusement la zone affectée avec du savon et de l’eau. Éliminez le réactif conformément aux directives de l’établissement de l’utilisateur et à toutes les réglementations locales, étatiques et fédérales applicables.
  8. Suivez les étapes 2.1 à 2.12 pour installer le microscope et monter l’échantillon. Identifier une cellule exprimant la protéine d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence.
  9. Pour référence, capturez une image TIRF de la cellule. Si une protéine fluorescente dans le même canal d’imagerie que l’anticorps mSAL est utilisée, effectuez un photoblanchiment de la protéine fluorescente. Pour photoblancher la protéine, utilisez la puissance maximale du laser pendant > 10 minutes jusqu’à ce qu’aucun signal ne soit observé.
  10. Ajoutez le tampon d’imagerie préparé au puits et commencez l’imagerie. L’analyse doit être réalisée comme décrit précédemment (étape 4).
  11. Ouvrir à la fois l’image reconstruite et l’image TIRF de la protéine fluorescente acquise avant l’acquisition du mSAL. Évaluez les emplacements de liaison des anticorps mSAL en comparant l’apparence et les localisations de la protéine exprimée, représentée dans l’image TIRF limitée par la diffraction, à l’image mSAL.

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Résultats

La technique mSAL décrite dans ce protocole permet de visualiser des événements de liaison d’anticorps uniques à leurs cibles protéiques membranaires plasmatiques correspondantes, produisant une carte super-résolution de la distribution des protéines membranaires. CD81 est utilisé ici comme exemple représentatif, bien que l’approche soit facilement adaptable à d’autres protéines membranaires.

L’immobilisation des lymphocytes T de Jurkat avec un espacement suff...

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Discussion

L’organisation des protéines membranaires plasmiques joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction cellulaire. Les techniques conventionnelles de microscopie à fluorescence sont limitées par la limite de diffraction de la lumière, masquant ainsi leur organisation à l’échelle nanométrique. Le SMLM surmonte cette limitation en atteignant des résolutions spatiales de 10-20nm 47, permettant la caractérisation de leurs assemblages à l’échelle

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par le National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health sous le numéro de prix R35GM146786 et le College of Liberal Arts and Sciences de l’Université de l’Illinois Chicago. Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne reflète pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps Alexa Fluor 488 anti-CD81Thermo Fisher ScientificMA5-44132Anticorps d’imagerie
Centrifugeuse de laboratoireEppendorf5424
Albumine sérique bovineMilliporeSigmaA7906-100G
Verre à couvercle chambré, 8 puitsCellvisC8-1-N
Médias DMEMThermo Fisher Scientific11960069
Solution physiologique tamponnée au phosphate de DulbeccoThermo Fisher Scientific14190-144
Sérum bovin fœtalMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldéhyde, 10 %Sciences de la microscopie électronique16120
Colloïdes dorés, 100 nmTed Pella15711 et moins ; 20Marqueur fiduciaire
Huile d’immersion & nbsp ;Laboratoires Cargille16245
Microscope inversé   ; équipé du module TIRFNikon InstrumentsEclipse Ti2-EMicroscope
Lignée cellulaire Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLCellules de suspension
Lancement laser, 6 lignesOxxiusL6CC-CS8-1511Laser d’excitation
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Réactif de transfection
Tube à microcentrifuge, 1,5 mL  ;VWR89000-028
Logiciels d’imagerie microscopiqueNikon InstrumentsRecherche avancée sur les éléments du NISLogiciel d’acquisition d’images
Objective, 100x/1,49 CFI APO TIRF & nbsp ;Nikon InstrumentsMRD01991Objectif microscope
Paraformaldéhyde, 16 %Sciences de la microscopie électronique15710
Pénicilline-StreptomycineThermo Fisher Scientific15140-122Antibiotiques
Solution de poly-L-lysine, 0,01 % & nbsp ;MilliporeSigmaP4707-50ML
Caméra Prime 95B sCMOSTeledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-CCaméra
Médias RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093Supports pour cellules de suspension
Azidée de sodiumThermo Fisher Scientific19038-1000
Borohydrure de sodiumMilliporeSigma213462-25G
Fioles de culture T25Thermo Fisher Scientific169900
Microsphères TetraSpeckMarqueur fiduciaire
Plat de culture tissulaire, 100 mm  ;Corning353003
Gamme cellulaire U2OSATCCHTB-96Cellules adhérentes

Références

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

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