Profilage phytochimique, chromatographie en phase gazeuse – analyse par spectrométrie de masse et activité in vivo de la mantalie de terminalia chez les rats

Résumé

Ici, nous présentons un protocole qui intègre l’analyse phytochimique, la chromatographie en phase gazeuse et la caractérisation par spectrométrie de masse, et des tests in vivo validés pour évaluer les activités anti-inflammatoires, analgésiques et antipyrétiques de Terminalia mantaly, fournissant un cadre reproductible pour l’évaluation pharmacologique des plantes médicinales.

Résumé

Les médicaments synthétiques pour l’inflammation, la douleur et la fièvre sont efficaces mais provoquent souvent des effets indésirables, ce qui suscite l’intérêt pour les alternatives thérapeutiques d’origine végétale. Terminalia mantaly H. Perrier, traditionnellement utilisée en médecine africaine, bénéficie d’une validation scientifique limitée. Cette étude présente un protocole expérimental intégré combinant dépistage phytochimique, analyse quantitative des composés phénoliques et flavonoïdes, caractérisation de la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), et des tests pharmacologiques in vivo pour évaluer le potentiel thérapeutique de l’extrait méthanolique de T. mantaly. Le criblage phytochimique a confirmé la présence de plusieurs classes bioactives, et l’analyse GC–MS a identifié vingt constituants, dont des acides gras, des phytostérols, des tocophérols et d’autres composés bioactifs aux propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes connues. Une évaluation pharmacologique in vivo chez les rats a démontré une activité anti-inflammatoire dépendante de la dose dans le modèle de l’œdème de pattes induit par la carragènene, une prolongation significative de la latence de sevrage de la douleur dans le test d’immersion de la queue, et une réduction de la pyrexie induite par la levure. À des doses plus élevées, l’extrait a montré des effets comparables à ceux des médicaments standards tels que le diclofénac et le paracétamol. Les évaluations de toxicité aiguë et cytotoxicité ont indiqué un profil de sécurité favorable dans la plage de dose testée. Ensemble, ces résultats valident l’utilisation ethnomédicinale de T. mantaly et démontrent un cadre expérimental reproductible pour lier la composition phytochimique à l’activité pharmacologique. Le protocole fournit une référence méthodologique pratique pour les chercheurs étudiant les plantes médicinales et soutient le développement d’agents d’origine végétale pour la prise en charge des affections inflammatoires et fiévreuses.

Introduction

L’inflammation, la douleur et la fièvre sont des processus pathologiques interconnectés qui sous-tendent un large éventail de maladies aiguës et chroniques. Bien que les médicaments synthétiques tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les corticostéroïdes et le paracétamol restent la base du traitement, leur usage à long terme est souvent associé à une irritation gastro-intestinale, des complications rénales, une hépatotoxicité et d’autres effets^{indésirables 1}. Ces limitations ont suscité un intérêt croissant pour les plantes médicinales comme alternatives plus sûres et plus durables pour la gestion des affections inflammatoires et fiévreuses. Les produits naturels sont bien connus pour leur grande diversité de molécules bioactives, dont beaucoup servent de pionniers au développement moderne de médicaments. Dans ce contexte, T. mantaly, membre de la famille des Combretaceae, a attiré l’attention en raison de son utilisation ethnomédicinale dans les systèmes traditionnels africains pour traiter les infections, les troubles gastro-intestinaux et les troubles inflammatoires ^2,3. Malgré sa pertinence traditionnelle, les études pharmacologiques systématiques validant son potentiel thérapeutique restent limitées. En particulier, il existe une pénurie d’investigations complètes intégrant le dépistage phytochimique, les évaluations biologiques in vivo et les méthodes avancées de profilage chimique, telles que GC–MS. Combler cette lacune est crucial pour étayer scientifiquement ses applications folkloriques et identifier les composés principaux potentiels pour un usage pharmaceutique⁴. Dans la présente étude, l’extrait méthanolique de T. mantaly a été soumis à une évaluation phytochimique et pharmacologique détaillée. Une analyse préliminaire a confirmé la présence de métabolites clés, notamment des phénoliques, des flavonoïdes, des tanins, des saponines et des terpénoïdes, tous connus pour contribuer à des effets anti-inflammatoires, analgésiques et^{antioxydants 5}. Les tests quantitatifs ont également révélé que l’extrait contenait des niveaux substantiels de composés phénoliques et flavonoïdes, avec des valeurs comparables aux standards de référence, suggérant un fort potentiel antioxydant.

Des modèles animaux ont été utilisés car les réponses pharmacologiques évaluées impliquent des voies inflammatoires, neuronales et thermorégulatrices intégrées qui ne peuvent pas être reproduites in vitro. Les tests in vivo ont fourni des preuves pharmacologiques claires de la bioactivité. Les propriétés anti-inflammatoires (œdème de patte induit par la carraghénane), analgésique (immersion de la queue) et antipyrétiques (pyrexie induite par la levure) ont été testées chez des rats, démontrant une activité anti-inflammatoire dépendante de la dose similaire à celle du diclofénac sodique à des doses plus élevées. De même, l’extrait a augmenté les latences d’immersion de la queue chez les rats, confirmant son efficacité analgésique, tandis que les modèles de pyrexie induite par la levure ont montré des effets antipyrétiques marqués, proches de ceux du^{paracétamol 6}. Le profilage chimique par analyse GC–MS a permis de mieux comprendre sa composition bioactive. Un total de 20 composés ont été identifiés, dont le 3,5-dihydroxy-6-méthyl-2,3-dihydro-4H-pyran-4-one, l’acide linoléique, le γ-sitotérol, le squalène et la vitamine E. Ces composés sont bien documentés pour leurs propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et cardioprotectrices, ce qui soutient les résultats pharmacologiques^{observés 7,8}. Il est important de noter que les évaluations de toxicité ont révélé des effets cytotoxiques négligeables, soulignant sa sécurité aux doses testées. Pris ensemble, cette étude comble une lacune critique en fournissant à la fois des preuves phytochimiques et pharmacologiques de la valeur médicinale de T. mantaly. Les résultats confirment non seulement ses applications traditionnelles, mais soulignent également son potentiel en tant que source naturelle de composés principaux pour développer de nouvelles thérapies contre l’inflammation et les troubles associés. Les modèles expérimentaux utilisés dans cette étude reflètent principalement des réponses inflammatoires aiguës et nociceptives et fournissent donc des preuves pharmacologiques préliminaires plutôt qu’une indication directe d’une efficacité thérapeutique chronique.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux directives internationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont respecté les recommandations de l’OCDE. Le protocole d’étude a été approuvé par le Comité de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Bahauddin Zakariya, Multan. (Approbation n° 3 /UREC/2025). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale et diminuer le nombre d’animaux utilisés.

1. Préparation de l’extrait méthanolique entier de T. mantaly (TMWM)

1. Collectez des tiges, racines et feuilles fraîches de T. mantaly, authentifiez la matière végétale et déposez un séncimen de référence dans un herbier reconnu.
   REMARQUE : Le matériel végétal utilisé dans cette étude a été collecté à la pépinière Punjab, Mattital Road, Multan, le 12 novembre 2023. Les coordonnées géographiques du site de collecte sont 30,2236° N, 71,4755° E. La plante a été authentifiée taxonomiquement par le taxonomiste Prof. Dr. Zafar Ullah Zafar, professeur de botanique à l’Université Bahauddin Zakariya de Multan, et un spique de référence (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) ont été déposés à l’herbier de l’Université Bahauddin Zakariya de Multan. La plante a été prélevée dans son habitat naturel dans des conditions environnementales appropriées, et le site de collecte a été documenté par des photographies.
2. Lavez la matière végétale avec de l’eau du robinet puis de l’eau distillée pour éliminer les contaminants, puis séchez à l’ombre à 25–30 °C pendant 7 à 10 jours jusqu’à atteindre un poids constant.
3. Broyez le matériau séché jusqu’à obtenir une poudre grossière et peser 500 g à l’aide d’une balance analytique. Transférez la poudre dans un récipient en verre propre et ajoutez 2,5 L de méthanol.
4. Macérez le mélange à température ambiante pendant 72 h avec des secousses intermittentes toutes les 6 à 8 heures. Filtrez à travers du papier filtre Whatman n°1.
5. Concentrez le filtrat à pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif à 39 °C, puis conservez l’extrait séché dans des contenants hermétiques à température ambiante jusqu’à utilisation.
   ATTENTION : Le méthanol est toxique et inflammable. Effectuez la manipulation à l’intérieur d’une hotte à fumée en portant des gants et des lunettes de protection. Éliminer les déchets solvants conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
   REMARQUE : L’extrait séché peut être conservé dans des contenants hermétiques à température ambiante pendant plusieurs semaines avant une analyse plus approfondie.

2. Estimation de la teneur en phénoliques totales (méthode de Folin–Ciocalteu)

1. Préparez une solution de bouillon d’acide gaurique (100 μg/mL) en dissolvant 10 mg d’acide galique dans 100 mL de méthanol et préparez des dilutions en série allant de 1 à 10 μg/mL.
2. Dissoudre un extrait de 10 mg dans 10 mL de méthanol pour obtenir une solution de 1 mg/mL. Transférez 0,5 mL de chaque étalon ou échantillon dans des tubes à essai.
3. Ajoutez 2,5 mL de réactif Folin–Ciocalteu dilué 1:1 avec de l’eau, puis ajoutez 2,0 mL de solution de carbonate de sodium à 7,5 %. Mélangez et éclovez à 25 ± 2 °C pendant 30 minutes.
4. Mesurez l’absorbance à 765 nm par rapport à un réactif blanc et calculez la teneur phénolique totale en mg d’équivalents d’acide galoi par g d’extrait.

3. Estimation de la teneur totale en flavonoïdes (méthode du chlorure d’aluminium)

1. Préparez une solution de réserve de rutine (1000 μg/mL) en dissolvant la rutine dans du méthanol, puis préparez des dilutions en série dans la plage de 10 à 80 μg/mL.
2. Transférez 0,5 mL de la solution standard ou à extrait dans des tubes à essai et ajoutez 1,5 mL de méthanol, 0,1 mL de solution de chlorure d’aluminium à 10 % (AlCl₃), 0,1 mL de solution d’acétate de potassium de 1 M et 2,8 mL d’eau distillée.
3. Incubez à température ambiante pendant 30 minutes et mesurez l’absorption à 415 nm. Exprimez les résultats en mg d’équivalents de rutine par g^{d’extrait 9}.

4. Analyse chromatographie en phase gazeuse et spectrométrie de masse (GC–MS)

1. Dissoudre un extrait de 10 mg dans 1 mL de méthanol HPLC et filtrer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm dans un flacon GC.
2. Effectuer l’analyse à l’aide d’un Agilent 7890B GC couplé à un 5977A MS équipé d’une colonne capillaire HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Utilisez l’hélium comme gaz porteur à 1,0 mL/min avec une température d’injecteur à 250 °C.
3. Maintenir la température de la source d’ions à 230 °C et la température quadrupôle à 150 °C. Programmez le four de 60 °C (2 min de tenue) à 180 °C à 10 °C/min, puis à 280 °C à 5 °C/min avec une dernière conservation de 10 min.
4. Injectez 1 μL de l’extrait filtré en mode split (10:1) et enregistrez les chromatogrammes sur une plage m/z de 40–600. Faites un traitement à blanc de solvant avant l’injection de l’échantillon.
5. Identifier les composés en comparant les spectres avec la bibliothèque spectrale de masse du NIST et confirmer les identités en utilisant le temps de rétention et la normalisation de la zone de pic.

5. Activité anti-inflammatoire (œdème de patte induit par la carrraghénine)

1. Utilisez des rats Wistar albinos en bonne santé pesant entre 180 et 220 g et acclimatez-vous pendant 7 jours. Des animaux jeûnant toute la nuit avant l’expérience avec un accès libre à l’eau.
2. Divisez les animaux au hasard en cinq groupes (n = 5 par groupe). Administrer une solution saline normale aux témoins ; administrer par voie orale 100, 200 et 300 mg/kg aux groupes de traitement ; et administrer du diclofénac sodique (40 mg/kg, par voie sous-cutanée) au groupe standard.
3. Après 1 heure, injectez 0,1 mL de carraghénine fraîchement préparée à 1 % dans la région sous-plantaire de la patte arrière droite.
4. Mesurez l’épaisseur de la patte à 0, 1, 2, 3 et 4 h à l’aide d’un étrier vernier numérique et calculez l’augmentation par rapport à la ligne de base.
5. Déterminer le pourcentage d’inhibition de l’œdème par rapport au groupe^{témoin 10}.
   ATTENTION : La poudre de carraghénine peut provoquer des irritations. Éviter l’inhalation et le contact cutané et éliminer les déchets biologiques conformément aux procédures institutionnelles de biosécurité.

6. Activité analgésique (test d’immersion de la queue)

1. Utilisez des rats Wistar albinos acclimatés maintenus sous un cycle clair/sombre de 12 heures avec un accès libre à la nourriture et à l’eau.
2. Divisez les animaux en cinq groupes (n = 5). Administrez de l’eau distillée aux groupes témoins, extraire par voie orale à 100, 200 et 300 mg/kg aux groupes traités, et paracétamol (20 mg/kg) au groupe standard.
3. Maintenez le bain-marie à 55 ± 1 °C. Immerger 1 à 2 cm de la queue distale et enregistrer la latence de retrait de base en utilisant un temps de coupure de 15 s.
4. Répétez les mesures à 30, 60, 90 et 120 minutes après le traitement, afin de garantir que la même portion de la queue soit immergée à chaque fois.
5. Calculez le pourcentage d’augmentation de la latence et exprimez les résultats en moyenne ± SD.

7. Activité antipyrétique

1. Utilisez des rats acclimatés et enregistrez la température rectale normale à l’aide d’un thermomètre numérique lubrifié.
2. Préparez une suspension de levure de brasseur à 20 % dans de l’eau distillée et injectez par voie sous-cutanée à 10 mL/kg dans le dos pour induire la pyrexie.
3. Après 18 h, mesurez à nouveau la température rectale et excluez les animaux qui ne présentent pas au moins 0,5 °C d’augmentation.
4. Divisez aléatoirement les rats fiévreux en cinq groupes (n = 5 par groupe). Administrez une solution saline normale au groupe témoin, de l’extrait végétal par voie orale à 100, 200 et 300 mg/kg aux groupes traités, et du paracétamol (150 mg/kg) au groupe standard.
5. Mesurez la température rectale à 0, 1, 2 et 3 h après le traitement et calculez la réduction par rapport au point^{de départ 11}.
   ATTENTION : Les suspensions de levure de brasseur sont des matériaux biologiques et doivent être manipulées selon les précautions de biosécurité standard. Éliminer les matériaux en suspension inutilisés et contaminés comme déchets biologiques.
   REMARQUE : Après l’injection de levures, les animaux peuvent être remis en cage et maintenus dans des conditions normales jusqu’à la mesure de la température.

8. Études sur la toxicité aiguë

1. Mener l’étude selon la directive 423 de l’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) en utilisant des rats Wistar albinos en bonne santé, de chaque sexe, pesant entre 180 et 220 g.
2. Jeûnez les animaux toute la nuit avant la dose et divisez-les aléatoirement en groupes (n = 5 par groupe).
3. Administrez une dose orale unique de 5 g/kg de poids corporel de l’extrait aux animaux traités et de l’eau distillée (1 mL/kg) aux animaux témoins.
4. Observez les animaux en continu pendant les 4 premières heures suivant la dose, périodiquement pendant les 24 premières heures, et quotidiennement pendant 14 jours.
   REMARQUE : Les critères d’observation incluent des modifications de la peau et du pelage, des yeux et des muqueuses, du schéma respiratoire, de la salivation, des tremblements, des convulsions, de l’activité locomotrice et des réponses comportementales générales.
5. Enregistrer les signes cliniques de toxicité, mortalité et poids corporel au jour 0, jour 7 et jour 14.
6. Évaluer la sécurité en fonction du taux de survie et des changements comportementaux ou physiques^{observés 12}.
   REMARQUE : Le score comportemental comprend la surveillance de la posture, de la démarche, du niveau d’activité, du comportement de toilettage, de la réponse aux stimuli externes et des signes de léthargie ou d’hyperactivité.

9. Analyse statistique

1. Compiler toutes les données expérimentales et exprimer les résultats en moyenne ± écart-type avec n = 5 animaux par groupe.
2. Entrez les données dans le logiciel GraphPad Prism au format colonne.
3. Évaluer la normalité des données à l’aide du test de Shapiro–Wilk avant d’appliquer l’analyse comparative.
4. Effectuez une analyse statistique à l’aide du logiciel GraphPad Prism en sélectionnant : Analyser → ANOVA unidirectionnelle → comparaisons multiples Tukey.
5. Effectuer une analyse unidirectionnelle de la variance suivie du test de comparaison multiple post hoc de Tukey pour déterminer la signification statistique entre groupes.
6. Considérons des différences statistiquement significatives à p < 0,05.

Résultats

Les approches expérimentales décrites dans cette étude ont généré des données reproductibles in vitro et in vivo qui ont permis d’évaluer à la fois la composition phytochimique et les activités pharmacologiques de l’extrait méthanolique de T. mantaly. Toutes les mesures expérimentales ont été effectuées en répliqués, et les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type (DS). La signification statistique entre les groupes a été déterminée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey, ave...

Discussion

Dans cette étude, une combinaison de caractérisation phytochimique et de modèles pharmacologiques établis in vivo a été utilisée pour évaluer le potentiel anti-inflammatoire, analgésique et antipyrétique de l’extrait méthanolique de T. mantaly. Les modèles expérimentaux utilisés sont largement utilisés dans la recherche sur les produits naturels et fournissent un cadre pratique pour l’évaluation préliminaire de l’activité biologique.

Les temps de réte...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rats Wistar albinos	Maison des animaux institutionnelles	N/A	Animaux expérimentaux
Chlorure d’aluminium	Sigma-Aldrich	237051	Essai des flavonoïdes
Brewer' levure s	Sigma-Aldrich	YSC2	Induction de pyrexie
Carrageenan	Sigma-Aldrich	C1013	Induction de l’œdème de la patte
Centrifugeuse	Eppendorf	5810R	Traitement des échantillons
Diclofénac sodique	Sigma-Aldrich	D6899	Norme anti-inflammatoire
Thermomètre rectal numérique	Omron	MC-246	Mesure de la température rectale
Étrier vernier numérique	Mitutoyo	500-196-30	Mesure de l’épaisseur de la patte
Eau distillée	En interne	N/A	Solvant
Folin&ndash ; Réactif de Ciocalteu	Sigma-Aldrich	F9252	Dosage phénolique
Acide gaulois	Sigma-Aldrich	G7384	Étalon phénolique
Système GC&ndash ; MS	Agilent Technologies	7890B&ndash ; 5977A	Profilage phytochimique
GraphPad Prism	Logiciel GraphPad	Version 8.0	Logiciels d’analyse statistique
Méthanol (qualité HPLC)	Merck	106009	Solvant d’extraction
Aiguille de gardien orale	Instech	FTP-20-38	Administration orale
Paracétamol	Sigma-Aldrich	P0300000	Norme analgésique et antipyrétique
Acétate de potassium	Merck	104820	Essai des flavonoïdes
Évaporateur rotatif	Bü ; chi	R-200	Concentration de l’extrait
Rutin	Sigma-Aldrich	R5143	Norme flavonoïde
Carbonate de sodium	Merck	106392	Dosage phénolique
UV&ndash ; Spectrophotomètre visible	Shimadzu	UV-1800	Mesure de l’absorbance
Bain marie (thermostatique)	Memmert	WNB14	Test d’immersion de queue