Essais de clonalité par séquençage de nouvelle génération : validation clinique pour le suivi de la maladie résiduelle minimale dans le myélome multiple

Résumé

Cette étude a évalué un nouvel essai de clonalité BCR/TCR basé sur le séquençage à haut débit (NGS) (OriMIRACLE LTM) pour la détection de la maladie résiduelle minime (MRD) dans les malignités lymphoïdes, y compris le myélome multiple (MM). À l’aide de lignées cellulaires et de frottis cliniques, elle a montré une >Taux de détection de 90 % et concordance de 81,36 % avec la cytométrie en flux. Le test offre une haute sensibilité, permet de prédire les rechutes et appuie les décisions thérapeutiques.

Résumé

La détection de la maladie résiduelle minimale (MRD) est cruciale pour la prise en charge des malignités lymphoïdes. Cette étude présente OriMIRACLE LTM, un nouvel essai d'analyse de la clonalité des récepteurs des cellules B (BCR) et des récepteurs des cellules T (TCR) basé sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) pour la détection de la MRD. Nous avons validé cet essai à l'aide de lignées cellulaires et d'échantillons cliniques, y compris des frottis résiduels, provenant de patients atteints de myélome multiple (MM). L'essai de clonalité BCR/TCR a démontré un taux de détection positive supérieur à 90 % dans les malignités lymphoïdes. Des études de validation chez des patients atteints de MM ont montré un taux de concordance de 81,36 % (48/59) entre la cytométrie en flux multicolore (MFC) et l'évaluation de la réponse clinique dans la détection des cellules tumorales. Notamment, 61,11 % (11/18) des patients atteints de MM positifs à la MRD par NGS et MFC ont présenté une progression de la maladie ou une rechute. Les patients chez qui la MRD a été détectée uniquement par NGS présentaient des taux de réponse clinique complète plus faibles, et certains patients initialement répondeurs ont rechuté après l'arrêt du traitement. Ces résultats indiquent que cet essai basé sur NGS offre une détection de la MRD hautement sensible et spécifique dans les malignités lymphoïdes, même dans des échantillons de frottis résiduels provenant de patients atteints de MM. Il présente des avantages par rapport à la MFC et s'avère utile pour le suivi de la MRD. En conclusion, les données actuelles soutiennent l'utilisation du NGS comme outil complémentaire à la MFC, en particulier chez les patients MFC⁻/NGS⁺, car le NGS permet une stratification du risque plus fine. Toutefois, le seuil optimal d'intervention reste à déterminer par des études prospectives.

Introduction

Le myélome multiple (MM) est une malignité hématologique caractérisée par la prolifération de cellules plasmatiques clonales anormales dans la moelle osseuse¹. En Chine, environ 22 450 nouveaux cas de MM ont été diagnostiqués et 17 360 décès liés ont été recensés en 2022². Malgré les progrès considérables réalisés dans le traitement du MM au cours de la dernière décennie, ayant nettement prolongé la survie médiane des patients, la majorité d'entre eux finissent par connaître une rechute^3,4. Cette augmentation marquée souligne le besoin crucial d'une surveillance précise de la rémission, d'une prédiction précoce des rechutes et d'interventions thérapeutiques rapides.

Des preuves cliniques ont fermement établi la signification pronostique du statut de maladie résiduelle minimale (MRD) dans les hémopathies malignes^5,6,7. Reconnaissant son importance, le groupe international de travail sur le myélome (IMWG) a intégré l'évaluation de la MRD dans ses critères d'évaluation de la réponse en 2016⁸. Les méthodes actuelles d'évaluation de la MRD dans la moelle osseuse incluent la réaction en chaîne par polymérase avec oligonucléotides spécifiques d'allèle (ASO-PCR), la PCR numérique (dPCR), la cytométrie en flux multiparamétrique (MFC) et les tests de séquençage à haut débit (NGS)⁸. Bien que l'ASO-PCR permette une détection sensible, elle est longue et difficile à standardiser en raison de la nécessité d'utiliser des amorces spécifiques à chaque patient^9,10. De même, la dPCR est limitée par sa conception spécifique à l'allèle^10,11. La MFC a joué un rôle essentiel dans la détection de la MRD¹², fournissant rapidement des informations au niveau cellulaire, mais elle fait face à des difficultés en matière de standardisation et de reproductibilité.

Le séquençage à haut débit (NGS) constitue une approche reproductible et hautement sensible qui élimine le besoin d'amorces spécifiques au patient. Il permet une identification et une quantification fiables des réarrangements uniques des immunoglobulines dans les hémopathies malignes¹³. La Food and Drug Administration (FDA) a approuvé ClonoSEQ d'Adaptive Biotechnologies pour les tests de MRD chez les patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA), de myélome multiple (MM) et de leucémie lymphoïde chronique (LLC)^14,15,16. De nombreuses lignes directrices cliniques internationales incluent désormais le NGS comme méthode recommandée pour la surveillance de la MRD. Les Lignes directrices chinoises pour le diagnostic et le traitement du myélome multiple (version révisée 2020) recommandent également l'évaluation de la MRD chez les patients atteints de MM à l'aide de méthodes telles que la cytométrie en flux de nouvelle génération (NGF) et le NGS¹⁷.

À notre connaissance, la technologie de séquençage à haut débit (NGS) n'est pas la méthode privilégiée pour la détection de la maladie résiduelle minime (MRD) dans les malignités lymphoïdes en pratique clinique, en raison des contraintes de coût et de temps. Lorsque les résultats de cytométrie en flux multiparamétrique (MFC) sont négatifs, un prélèvement supplémentaire de moelle osseuse est souvent nécessaire pour détecter la MRD. Cette procédure supplémentaire peut imposer des fardeaux physiques et psychologiques importants aux patients, limitant potentiellement son application clinique généralisée.

Dans cette étude, nous avons développé, caractérisé et validé les performances d'un test de clonalité des récepteurs des cellules B ou T (BCR/TCR) basé sur le séquençage à haut débit (NGS) (OriMIRACLE LTM). Les objectifs principaux de cette étude étaient de valider la sensibilité et la spécificité de ce test pour le suivi de la maladie résiduelle minimale (MRD) dans les malignités lymphoïdes, même à partir d'échantillons de frottis résiduaires. Cette méthode peut utiliser directement les frottis de moelle osseuse résiduels conservés après le diagnostic de routine, contournant ainsi les limitations inhérentes aux échantillons de frottis. Même lorsque l'ADN présent dans les frottis est fragmenté en raison de la fixation, de la coloration ou d'un stockage prolongé, qu'il est présent en quantités extrêmement faibles ou partiellement dégradé, des profils fiables du répertoire immunitaire peuvent être obtenus grâce à une extraction optimisée des acides nucléiques et à une amplification par PCR multiplex. Elle permet un suivi clonal à haute sensibilité, avec une sensibilité de 10⁻⁵ à 10⁻⁶, dépassant la limite de détection inférieure de la cytométrie en flux conventionnelle utilisée pour la détection de la MRD. Ce travail met en évidence le potentiel de l'évaluation de la clonalité des BCR/TCR basée sur le NGS pour améliorer le suivi de la MRD et orienter les décisions thérapeutiques chez les patients atteints de myélome multiple (MM), offrant ainsi une réponse potentielle aux limites actuelles de la pratique clinique.

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d'Helsinki et approuvée par le comité d'éthique de l'Hôpital affilié n°1 de l'Université médicale de Gannan (numéro d'approbation éthique : 22SC-2023011201). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant leur inclusion dans l'étude.

Sélection des échantillons
Des échantillons cliniques ont été obtenus auprès de 40 patients diagnostiqués avec diverses hémopathies malignes, incluant la LAL, le MM, la LLC et le lymphome. En outre, des échantillons appariés en phase chronique et en phase blastique provenant de patients atteints de leucémie myéloïde chronique ont été recueillis. Les échantillons ont été prélevés à l'Hôpital Affilié de l'Université Médicale de Gannan, Jiangxi, Chine, entre décembre 2016 et août 2022. Ces spécimens provenaient d'aspirats médullaires (AM) ou de sang périphérique. Quatre lignées cellulaires de malignités lymphoïdes ont également été utilisées : les lignées de LAL-B REH et NALM6, la lignée de LAL-T Jurkat et la lignée de lymphome H9, toutes obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC ; Manassas, VA).

Pour l'étude de validation analytique, un sous-ensemble de frottis appariés de moelle osseuse résiduelle clinique, prélevés avant et après traitement chez 30 patients nouvellement diagnostiqués ou en rechute de myélome multiple (MM), a été inclus. Des tests de cytométrie en flux multicolore (MFC) ont été réalisés sur des échantillons de moelle osseuse (BMA) aux moments correspondants, en utilisant une cytométrie en flux à 4 couleurs.

Les échantillons ont été marqués avec six combinaisons d'anticorps différentes à quatre couleurs (dilutions conformes aux instructions du fabricant) : CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR, et K/L/CD45/CD38. Le marquage a été effectué pendant 30 minutes à 4 °C à l'abri de la lumière, suivi de deux lavages avec du PBS (centrifugation à 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C). Dans les laboratoires d'immunohématologie, la positivité de la LMC-IRM dans la moelle osseuse est actuellement définie à l'aide d'un seuil de 10^-4 (1 cellule sur 10 000). La qualité de l'acquisition en cytométrie en flux a été vérifiée en visualisant la diffusion directe/latérale et en confirmant la présence d'au moins 10 000 événements CD45⁺ par tube.

Détection de la clonalité et suivi de la MRD par un dosage de clonalité basé sur le séquençage à haut débit (NGS)
L'ADN génomique (gDNA) a été extrait à partir de 200 µL de MO, de sang périphérique ou de la totalité de la lame résiduelle (resuspendue dans 200 µL de PBS) à l’aide du kit approprié, conformément aux instructions du fabricant. Une concentration minimale d’ADN génomique de 20 ng/µL et un rendement total ≥ 1 µg étaient requis. Un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0 a été vérifié. Ce dosage amplifie l’ADN génomique par PCR multiplex spécifique de locus à l’aide d’amorces, suivie de l’ajout d’un code-barres d’index de spécificité de réaction à la séquence réceptrice amplifiée afin d’identifier l’échantillon. L’ADN amplifié et porteur du code-barres est ensuite regroupé pour préparer les bibliothèques de séquençage, qui sont soumises à un séquençage à haut débit (NGS) sur plateforme Illumina. La taille finale de la bibliothèque (350–450 pb) et la concentration (≥ 5 nM) ont été vérifiées sur un Bioanalyzer. Les données de séquençage sont traitées à l’aide de pipelines bioinformatiques personnalisés et de mesures rigoureuses de contrôle qualité. Les lectures sont attribuées aux récepteurs BCR ou TCR réarrangés pour chaque échantillon, puis regroupées en séquences réceptrices clonales. Ces séquences sont ensuite évaluées quant à leur potentiel de relation à la maladie et à leur adéquation pour un suivi ultérieur. Pour être considérée comme appropriée, une séquence doit représenter au moins 10 % de l’ensemble des séquences BCR au locus concerné et présenter une unicité suffisante. Lors de l’évaluation d’une séquence pour le suivi de la MRD, son unicité est déterminée en la comparant à une base de données exhaustive du répertoire des lymphocytes B ou T, telle que la base de données ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org). La fréquence de la séquence dans cette base de données est utilisée pour évaluer son caractère distinctif. Une fois les séquences pertinentes liées à la maladie identifiées, elles sont comparées à des échantillons ultérieurs afin de surveiller la MRD. Les échantillons sont classés comme MRD-positifs (+) si des correspondances de séquence sont détectées, ou MRD-négatifs (-) en l’absence de correspondance. La concentration de chaque séquence suivie est quantifiée, permettant ainsi le calcul du nombre consensus de cellules malignes et du nombre total de cellules nucléées au niveau de l’échantillon. Le rapport entre ces deux valeurs fournit une estimation de la fréquence des cellules tumorales dans un échantillon, offrant des informations précieuses sur l’évolution de la maladie ou la rémission. Une séquence clonale était considérée comme valide pour le suivi si au moins 50 lectures supportant étaient détectées et si la séquence représentait ≥10 % du répertoire total BCR/TCR au moment du diagnostic.

Tous les échantillons d'origine humaine ont été manipulés comme des agents biologiques dangereux dans une hotte de sécurité biologique de classe II (HSB) en portant des équipements de protection individuelle (EPI). Les consommables contaminés ont été stérilisés en autoclave (121 °C, 20 min) avant élimination ; les déchets liquides ont été traités avec de l'eau de Javel à 10 %.

Études de précision et de sensibilité
La limite de détection (LOD) a été déterminée à l’aide d’échantillons cliniques et de lignées cellulaires, en présence d’un fond d’ADN génomique (gDNA) de sang périphérique provenant de donneurs sains. Afin d’établir la linéarité de détection, de l’ADN génomique de lignées cellulaires a été ajouté à de l’ADN génomique normal pour créer une gamme de fréquences clonales couvrant plusieurs ordres de grandeur. Plus précisément, des cellules malignes ont été ajoutées à partir de 10 cellules, suivies de dilutions sérielles d’un facteur 10 : 10, 100, 1 000 et 10 000 cellules. La LOD a été calculée comme le nombre attendu de cellules malignes d’entrée auquel la courbe probit ajustée atteignait une probabilité de détection de 95 %. La concordance entre les fréquences observées et attendues a été analysée par régression linéaire. Ces paramètres fournissent une base solide pour l’estimation du MRD au niveau des échantillons dans les études d’évaluation ultérieures. Cette version améliorée conserve le ton académique tout en renforçant la clarté et la concision. Elle garantit également l’usage correct de la terminologie scientifique et respecte les conventions de l’écriture savante dans le domaine des sciences de la vie et de la médecine.

Analyse statistique
Une valeur de p bilatérale < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. La linéarité a été évaluée et calculée à l'aide du coefficient de corrélation de Pearson (r) dans GraphPad Prism. L'analyse statistique a été réalisée avec le langage R (version 3.6.1). Le calcul de la survie sans progression (PFS) commence au moment où le patient atteint une réponse complète (CR), une réponse partielle (PR) ou une très bonne réponse partielle (VGPR), et se poursuit jusqu'à l'apparition d'une maladie progressive (PD) ou au décès pour toute cause. La courbe de Kaplan-Meier a été utilisée pour analyser la survie, et le test du log-rank a été employé pour comparer les différences de survie entre les sous-groupes. L'analyse de Cox a été effectuée à l'aide d'analyses univariées et multivariées.

Résultats

Traitement, linéarité et précision de la détection de la clonalité
Les tests de clonalité des BCR/TCR étaient basés sur deux tours de PCR multiplex suivis de séquençage à haut débit (NGS) (Figure 1). Les tests de clonalité des BCR permettaient d'identifier les réarrangements IGH (VH-DH-JH ou DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde et intronRSS-Kde), et IGL (Vλ-Jλ), ainsi que les translocations BCL1-IGH et BCL2-IGH, soit par des réactions séparées, soit par une réaction mixte unique ajustée. Les tests de clonalité des TCR permettaient de détecter les réarrangements TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) et TCRG (Vγ–Jγ). La clonalité des BCR dans les malignités lymphoïdes B présentait un taux de détection de 93,94 %, et la clonalité des TCR dans les malignités lymphoïdes T présentait un taux de détection de 90,91 % (Table 1).

La linéarité a été démontrée sur une large gamme d'entrées d'échantillons (0,2 µg, 2 µg et 20 µg) selon les résultats des tests sur des lignées cellulaires, couvrant plusieurs ordres de grandeur. Pour établir la linéarité, des cellules malignes ont été ajoutées à de l'ADN génomique normal par des dilutions sérielles d'un facteur 10 (10, 100, 1 000 et 10 000 cellules). La linéarité a été observée avec des pentes estimées comprises entre 0,93 et 1,06, pour des fréquences clonales allant de 1 à 10^-6 (Figure 2A). La DL a été estimée entre 1 et 2 cellules malignes, tant pour les tests de clonalité BCR que TCR (Figure 2B). En outre, les tests de clonalité BCR/TCR ont permis de détecter la clonalité dans le lymphome à l'aide d'échantillons tissulaires (BMA) et de sang périphérique apparié (Supplementary Table 1).

Patients et échantillons utilisés pour la validation de la détection de la maladie résiduelle mesurable
La validation de la détection de la maladie résiduelle mesurable a inclus un total de 29 patients atteints de myélome multiple, un patient ayant été exclu en raison d'un échantillon endommagé. La population étudiée comprenait 65,52 % (19/29) d'hommes et 34,48 % (10/29) de femmes, avec un âge médian de 65 ans (intervalle 33–82) (Tableau 2). Parmi la cohorte, 31,03 % (9/29) des patients ont été classés comme à haut risque, 24,14 % (7/29) comme à risque standard et 37,93 % (11/29) comme à bas risque selon les critères du groupe international du myélome (IMWG)¹⁸. Les stades du système international de stadification du myélome multiple révisé (R-ISS) I, II et III représentaient respectivement 10,34 % (3/29), 48,28 % (14/29) et 20,69 % (6/29) des patients¹⁹.

Comparaison des tests NGS et MFC
Une comparaison directe par paires a été réalisée afin d'évaluer la précision quantitative des tests OriMIRACLE LTM et MFC. Les résultats ont montré une précision quantitative similaire sur l'ensemble de la plage testée, particulièrement pour les fréquences de MRD supérieures à 10⁻⁴, avec une valeur de corrélation de Pearson R de 0,73 (Figure 3). Les cellules tumorales ont été détectées par les deux tests MFC et NGS dans 59 échantillons provenant de 29 patients atteints de MM, et la concordance atteint 81,36 % (48/59). Cette concordance reflète la présence de cellules tumorales détectables à différents moments, plutôt qu'une véritable concordance entre les méthodes. Parmi les échantillons, 62,07 % (18/29) étaient MRD+ selon les deux tests NGS et MFC, un patient était MRD− par les deux méthodes, et 11 patients étaient MRD+ par NGS mais MRD− par MFC. Parmi les patients présentant des résultats de détection discordants, trois avaient une fréquence de détection inférieure à 10^-4, tandis que huit présentaient une fréquence de détection comprise entre 10^-2 et 10^-4 (Figure 3). L'extraction de l'ADN à partir d'échantillons résiduels de frottis de moelle osseuse est effectuée afin d'obtenir le plus grand volume d'ADN possible. Pour la détection de la clonalité avant le traitement, une quantité moyenne de 91,95 ng (jusqu'à 100,0 ng) d'ADN a été analysée. Une quantité moyenne de 1623,39 ng (variant de 50,1 à 17400,0 ng) d'ADN a été extraite pour les tests ultérieurs de MRD (Supplementary Table 2). Ces résultats montrent que la NGS peut détecter la MRD même lorsque l'échantillon résiduel est insuffisant, alors que la MFC n'a pas pu détecter la MRD dans certains cas.

Validité clinique de la détection de la MRD par test NGS pour l'intervalle principal
Des séquences clonales ont été détectées au moment de l'inclusion chez tous les patients atteints de MM, suivies par l'évaluation de la MRD (Figure 4). Dix-huit patients ont été confirmés MRD+ par détection NGS et MFC. Parmi les patients présentant une MRD+ selon les deux méthodes MFC et NGS, 61,11 % (11/18) ont ultérieurement présenté une progression de la maladie (PD) ou une rechute. Chez 38,89 % (7/18) des patients, la maladie est restée stable (SD) ou une réponse partielle (PR) a été obtenue au cours de l'étude. Parmi les patients confirmés MRD+ par NGS mais MRD− par MFC, 36,36 % (4/11) n'ont pas pu atteindre une réponse complète clinique (CR) lors de la dernière évaluation clinique (Tableau supplémentaire 2). De plus, parmi tous les patients dont la réponse clinique était une CR, 37,50 % (3/8) ont présenté une rechute après l'arrêt du traitement. Nous avons également examiné les caractéristiques cliniques initiales et les résultats de la MFC en lien avec l'évolution de la SFP (Figure supplémentaire 1). Les analyses univariée et multivariée de la SFP ont révélé qu'elles n'étaient pas significativement associées. Dans cette étude, aucune différence significative n'a été observée concernant la SFP lors de l'analyse des seuls résultats de MRD obtenus par MFC.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES
En raison des restrictions relatives à la confidentialité des patients et des politiques institutionnelles, les données brutes ne sont pas accessibles au public. Un résumé des données recueillies est fourni dans le fichier supplémentaire 1.

Figure 1 : Le test de clonalité BCR/TCR impliquait une PCR multiplex suivie d'une séquençage à haut débit (NGS). La première PCR amplifiait la région CDR3 des gènes de récepteurs immunitaires réarrangés à l'aide d'amorces spécifiques du locus et d'index spécifiques aux échantillons, et les adaptateurs de NGS étaient ajoutés lors de la deuxième PCR. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : La linéarité de la détection de la clonalité a été évaluée en ajoutant de l'ADN génomique (ADNg) de lignée cellulaire à de l'ADNg normal selon une gamme de fréquences clonales. (A) Linéarité des tests de clonalité des récepteurs de cellules B (BCR) et T (TCR). (B) Limite de détection (LOD) estimée à l’aide d’échantillons cliniques et de lignées cellulaires ajoutées à de l’ADNg de sang périphérique de donneurs sains. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Comparaison par paires des mesures de fréquence de MRD entre la cytométrie en flux multiparamétrique (MFC) et le test de MRD par séquençage à haut débit (NGS). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Dynamique de la MRD chez les patients atteints de MM et différents statuts cliniques des patients. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Types d'échantillons		No.	Type de maladie	Clonotype dominant
Lignées cellulaires	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	Lymphome	TCRB, TCRG
Malignités lymphoïdes B cliniques		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	Non détecté
		9	LLC	IGH, IGK
		10	LLC	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	Lymphome	IGH, IGK
		24	Lymphome	IGH, IGK, IGL
		25	Lymphome	IGH, IGK, IGL
		26	Lymphome	IGH, IGK, IGL
		27	Lymphome	IGH
		28	Lymphome	IGH
		29	Lymphome	IGH, IGK, IGL
		30	Lymphome	IGH, IGK
		31	Lymphome	IGH, IGK
		32	Lymphome	IGH, IGK, IGL
		33	Lymphome	IGK
		34	Lymphome	IGH
		35	Lymphome	Non détecté
Malignités lymphoïdes T cliniques		36	Lymphome	TCGR
		37	Lymphome	TCRB, TCRG
		38	Lymphome	TCRB, TCRG
		39	Lymphome	TCRB, TCRG
		40	Lymphome	TCRB, TCRG
		41	Lymphome	TCRB, TCRG
		42	Lymphome	TCRB, TCRG
		43	Lymphome	TCRB, TCRG
		44	Lymphome	Non détecté

Tableau 1 : Détection de la clonalité à l'aide des tests de clonalité des récepteurs B (BCR) et T (TCR) dans 4 lignées cellulaires et 40 échantillons cliniques. B-ALL : leucémie lymphoïde aiguë à cellules B ; T-ALL : leucémie lymphoïde aiguë à cellules T ; CP-CML : leucémie myéloïde chronique en phase chronique ; BP-CML : leucémie myéloïde chronique en phase blastique ; CLL : leucémie lymphoïde chronique ; MM : myélome multiple.

Caractéristique	Total (N = 29)
Âge médian, années (intervalle)	65 (33-82)
Sexe, n (%)
Homme	19 (65,52)
Femme	10 (34,48)
Type de chaîne lourde, n (%)
IgG	14 (48,28)
IgA	7 (24,14)
IgE	1 (3,45)
Type de chaîne légère, n (%)
k	19 (65,52)
λ	8 (27,59)
Anomalie cytogénétique, n (%)
del17p	2 (6,90)
del13q14	9 (31,03)
Gain/amplification 1q21	12 (41,38)
t (4;14)	2 (6,90)
Aucune anomalie	9 (31,03)
Stade ISS, n (%)
I	4 (13,79)
II	13 (44,83)
III	12 (41,38)
Stade R-ISS, n (%)
I	3 (10,34)
II	14 (48,28)
III	6 (20,69)
Données manquantes	6 (20,69)
IMWG, n (%)
Risque élevé	9 (31,03)
Risque standard	7 (24,14)
Risque faible	11 (37,93)
Données manquantes	2 (6,90)

Tableau 2 : Caractéristiques de base des 29 patients atteints de MM inclus dans cette étude. k : kappa ; λ : Lambda ; DS : Durie-Salmon ; ISS : système de stadification international ; R-ISS : système de stadification international révisé ; IMWG : Groupe international de travail sur le myélome

Figure supplémentaire 1 : Analyse de survie basée sur les caractéristiques cliniques et les résultats de la cytométrie en flux multiparamétrique. (A) Analyses univariée et multivariée de la survie sans progression. (B) Courbe de Kaplan-Meier selon le résultat de la cytométrie en flux multiparamétrique. (C) Courbe de Kaplan-Meier selon le résultat du séquençage à haut débit. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Détection de la clonalité du lymphome à l'aide des tests de clonalité des récepteurs BCR/TCR sur des échantillons tissulaires et du sang périphérique apparié. NHL : lymphome non hodgkinien ; HGBL : lymphome à grandes cellules B de haut grade ; FL : lymphome folliculaire ; DLBCL : lymphome diffus à grandes cellules B ; ITLPD-GI : troubles lymphoprolifératifs T indolents du tube digestif. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Résultats de la détection de la MRD basés sur les tests MFC et NGS. ND : non détecté ; Réponse partielle : PR ; Réponse complète : CR ; Maladie stable : SD ; Très bonne réponse partielle : VGPR. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Résumé des données brutes recueillies dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ces dernières années ont été témoins d'améliorations significatives des résultats cliniques dans les hémopathies lymphoïdes, stimulant ainsi la recherche de marqueurs alternatifs capables de prédire plus précocement les critères de survie et d'accélérer l'évaluation de nouveaux traitements²⁰. Une méta-analyse exhaustive portant sur 8 098 patients a réaffirmé la valeur pronostique solide de la négativité de la MRD pour améliorer la survie à long terme chez les patients atteints de myélome multiple²¹. Par ailleurs, les réarrangements clonaux des gènes du BCR et du TCR se sont imposés comme des marqueurs diagnostiques et de suivi de la MRD essentiels, orientant les décisions thérapeutiques dans les hémopathies du système lymphatique²².

Des preuves croissantes soutiennent la supériorité de l'évaluation de la clonalité des BCR/TCR par séquençage à haut débit (NGS) par rapport aux analyses par cytométrie en flux (MFC) et par PCR, en particulier lorsque des échantillons d'ADN en quantité suffisante sont disponibles. Le NGS offre une sensibilité plus élevée et une standardisation plus simple^{10,23,24,25,26} et a été identifié comme un facteur pronostique puissant pour la survie sans progression (PFS) et la survie globale au début d'un traitement d'entretien²⁷.
Dans cette étude, nous avons développé un test fondé sur le NGS, qui présente un taux de détection positif supérieur à 90 % pour la clonalité des BCR et des TCR dans les hémopathies lymphoïdes. La limite de détection (LOD) du test est estimée entre 1 et 2 cellules malignes, tant pour les analyses de clonalité des BCR que des TCR, ce qui est comparable à la haute sensibilité du test clonoSEQ, dont la LOD est de 1,903 cellule maligne¹⁶. Nous avons observé une linéarité avec des pentes estimées comprises entre 0,93 et 1,06 sur des fréquences clonales allant de 1 à 10^-6, indiquant une forte proportionnalité entre les fréquences clonales observées et attendues. Après la mise en place de méthodes de détection standardisées et l'achèvement de la validation en laboratoire, nous avons réalisé une validation clinique afin de garantir l'adéquation du test au suivi clinique de la maladie résiduelle minimale (MRD).

Cette étude a révélé une concordance de 81,36 % (48/59) entre le test basé sur le séquençage à haut débit (NGS) et la cytométrie en flux multiparamétrique (MFC). Les deux méthodes ont démontré une sensibilité de 100 % pour l'identification des cellules tumorales dans les cas nouvellement diagnostiqués ou en rechute. Pour la surveillance post-traitement, aucune corrélation significative n'a été observée entre le statut de maladie résiduelle minimale (MRD) évalué par MFC et la survie sans progression (PFS), probablement en raison de la taille limitée de l'échantillon. Par conséquent, nous avons réalisé une analyse complète de tous les cas.

Parmi les 18 patients identifiés comme positifs pour la MRD par les deux méthodes, les résultats de la MRD étaient concordants avec les évaluations de la réponse clinique. Neuf de ces patients ont présenté une progression de la maladie (PD) ou une rechute, quatre ont atteint une stabilité de la maladie (SD), quatre ont atteint une réponse partielle (PR), et un est décédé. Cela suggère que chez les patients testés positifs pour la MRD par les deux méthodes, une progression de la maladie ou une rechute est presque inévitable. Ces données indiquent que la positivité de la MRD aux deux tests, NGS et MFC, reflète majoritairement une efficacité limitée ou un pronostic défavorable chez ces patients. Parmi les 11 patients qui étaient positifs pour la MRD par NGS mais négatifs par MFC, 36,36 % n'ont pas atteint une réponse complète (CR). Ces résultats soulignent la capacité du NGS à détecter la MRD à des fréquences allant de 10^-2 à 10^-6, même avec des échantillons résiduels limités, tandis que la MFC n'a pas détecté la MRD dans certains cas. Cela renforce davantage la sensibilité et la spécificité supérieures du NGS par rapport à la MFC pour la détection de la MRD.

Des recherches antérieures ont démontré que le statut de MRD évalué par cytométrie en flux multiparamétrique (MFC) est un puissant prédicteur de la survie sans progression (PFS) et de la survie globale chez les patients atteints de myélome multiple (MM), soulignant l'importance de la surveillance de la MRD pour guider les décisions thérapeutiques et évaluer le pronostic après une greffe autologue de cellules souches hématopoïétiques²⁸. Les résultats présentés ici mettent davantage en évidence l'importance des tests par séquençage à haut débit (NGS), comme le montrent deux cas (patients 11 et 14) où les patients étaient en MRD négative selon la MFC mais en MRD positive selon le NGS. Il est essentiel de noter qu'interrompre le traitement dans de tels cas pourrait entraîner un risque de rechute, ce qui souligne la nécessité d'une évaluation attentive de la réponse au traitement lorsque des résultats discordants de MRD sont observés.

Cette étude rompt la dépendance des méthodes NGS et MFC vis-à-vis des prélèvements médullaires frais ou des cellules congelées et, pour la première fois, valide systématiquement que les frottis médullaires résiduels, même colorés, restants après un diagnostic de routine peuvent servir de matériau de départ fiable pour la détection de MRD à haute sensibilité. Cela répond directement aux lacunes cliniques et méthodologiques suivantes : (1) cela évite la nécessité de prélever de grands volumes de liquide médullaire pour la surveillance de la MRD, notamment chez les patients âgés ou ceux chez qui l'échantillonnage est difficile ; (2) cela permet une analyse rétrospective de frottis archivés, exploitant ainsi les ressources pathologiques existantes afin d'établir des preuves pronostiques fondées sur la MRD dans des cohortes historiques ; et (3) avec une sensibilité de détection de 10^-5-10^-6, elle est nettement supérieure à la MFC conventionnelle (généralement 10^-4-10^-5) et contourne les faux négatifs causés par des problèmes de qualité d'échantillon en MFC, offrant ainsi un outil d'évaluation de la MRD basé sur l'ADN et traçable pour la pratique clinique.

Plusieurs étapes critiques ont été identifiées pour assurer la réussite et la fiabilité du test. Le raclage doux des frottis résiduels suivi d'une application immédiate du tampon était essentiel pour obtenir un rendement adéquat d'ADN génomique. Une quantité précise d'ADN en entrée (100 ng par réaction, avec une tolérance de ±10 %) était requise afin d'éviter la perte allélique ou une amplification biaisée. Le regroupement équimolaire des produits barcodés (2 nM) a permis d'obtenir une profondeur de séquençage uniforme, tandis qu'une application constante des seuils bioinformatiques (fréquence clonale ≥10 % au diagnostic et ≤5 % de désappariements pour le suivi) a aidé à prévenir les faux positifs dans la détection de la maladie résiduelle mesurable. En outre, plusieurs modifications du protocole standard ont été introduites pour résoudre des problèmes expérimentaux fréquents. Lorsque la concentration finale de la banque était inférieure à 5 nM, un second cycle de PCR comprenant 2 à 4 cycles supplémentaires était ajouté avec précaution afin d'éviter un biais d'amplification excessive. Pour les échantillons où le suivi clonal échouait en raison d'un trop grand nombre de désappariements (>5 %), la base de données de référence IMGT était mise à jour et la tolérance aux désappariements était temporairement assouplie à 8 % pour l'analyse exploratoire, bien que le seuil de 5 % reste la valeur standard pour les rapports cliniques. Si la profondeur de séquençage tombait en dessous de 50 000 lectures par échantillon, un nouveau regroupement et un nouveau séquençage étaient effectués sans répéter l'étape de PCR.

Dans l'ensemble, cette validation dans des conditions réelles démontre que les échantillons résiduels de frottis de moelle osseuse fournissent des résultats d'analyse cohérents et fiables dans divers contextes thérapeutiques. Dans les régions défavorisées sur le plan économique où la biopsie de moelle osseuse et la cytométrie en flux multiparamétrique (MFC) sont couramment réalisées au lieu du séquençage de nouvelle génération (NGS), les résultats suggèrent que le NGS pourrait être envisagé pour une évaluation moléculaire complémentaire lorsque les résultats initiaux sont négatifs. L'utilisation d'échantillons résiduels est appropriée dans de telles situations, car elle élimine la nécessité de répéter la ponction de moelle osseuse, réduisant ainsi la charge pour le patient.

Bien que notre étude en cours dans un contexte réel vise à élargir la taille de l'échantillon pour des analyses supplémentaires, nous reconnaissons plusieurs limites. Des faux négatifs peuvent survenir, en particulier lorsque la quantité d'ADN extrait est insuffisante, comme observé lors de la deuxième détection de MRD chez le patient 10. De plus, la proportion de clones détectés par le séquençage à haut débit (NGS) est influencée par la quantification cellulaire, ce qui peut entraîner une surestimation des proportions de cellules MRD. La validation se concentre principalement sur les échantillons de moelle osseuse. Toutefois, la signification à long terme de la MRD par NGS réside dans les suivis multiples après le traitement, où le sang périphérique pourrait être plus approprié. La validation sur des échantillons de sang périphérique n'a pas encore été réalisée. Étant donné le nombre limité d'échantillons de validation clinique, l'inscription aléatoire des patients et les approches thérapeutiques variées dans cette étude en contexte réel, la collecte d'échantillons MRD consécutifs s'est révélée difficile. Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur l'évaluation de la signification des réponses précoces en MRD par rapport à la progression ultérieure, sans pouvoir démontrer l'impact du statut persistant de MRD sur les résultats à long terme. En outre, la cytométrie en flux de nouvelle génération (NGF) n'a pas été incluse dans l'analyse comparative. Bien que le NGS et la cytométrie en flux conventionnelle (MFC) aient été comparés de manière systématique, la NGF, étant l'une des deux méthodes de détection de la MRD recommandées par l'IMWG (l'autre étant le NGS), aurait permis d'obtenir des informations supplémentaires sur les performances du test. Enfin, la taille de l'échantillon est relativement faible (n = 40) et la cohorte est hétérogène, incluant diverses hémopathies malignes. Des études futures multicentriques, à grande échelle, intégrant la NGF et se concentrant sur une seule malignité, telle que le myélome multiple, sont nécessaires pour confirmer et étendre nos conclusions.

Après avoir caractérisé et validé de manière approfondie les performances du test de clonalité BCR/TCR basé sur le séquençage à haut débit (NGS), nous avons démontré qu'il constitue une méthode hautement sensible, précise et pratique pour quantifier et surveiller la maladie résiduelle minimale (MRD) dans les frottis médullaires résiduels provenant de patients atteints de myélome multiple (MM).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-CD19	Abcam	AB134114	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD20	Abcam	AB64088	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD22	Abcam	AB32123	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD33	Abcam	AB134115	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD34	Abcam	AB81289	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD38	Abcam	AB183326	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD45	Abcam	AB40763	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD56	Abcam	AB75813	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-CD9	Abcam	AB2215	Dilution selon les instructions du fabricant
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	Dilution selon les instructions du fabricant
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
Base de données ImMunoGeneTics (IMGT)	Base de données ImMunoGeneTics (IMGT)	http://www.imgt.org/
Lignées cellulaires de malignités lymphoïdes	ATCC	https://www.atcc.org/	Lignées B-ALL REH et NALM6, lignée T-ALL Jurkat et lignée de lymphome H9 (DSMZ)
Cytométrie en flux multiparamétrique	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
Test OriMIRACLE LTM	Origimed Co., Ltd., Shanghai, Chine
Langage R	Fondation R pour l'informatique statistique	version 3.6.1