Le séquençage du transcriptome a identifié des chimiokines pathogènes centrales dans les plaques athérosclérotiques

Résumé

Cette étude vise à analyser les mécanismes sous-jacents des facteurs inflammatoires associés aux plaques athérosclérotiques (AP) à l’aide du séquençage à ARN. Les résultats ont identifié CCL3, CCL4 et CXCL1 comme principaux gènes inflammatoires dans la PA. Ces chimiokines peuvent favoriser l’athérosclérose en favorisant l’accumulation de macrophages M0 tout en supprimant les cellules immunitaires protectrices, révélant ainsi des cibles thérapeutiques potentielles.

Résumé

La plaque athérosclérotique (AP) est un type de maladie inflammatoire proliférative des tissus fibreux après la lésion des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses dans la paroi artérielle, ce qui peut entraîner différents degrés d’obstruction du flux sanguin cardiovasculaire et cérébrovasculaire. Cependant, les approches thérapeutiques efficaces ciblant l’inflammation ont largement échoué à ce jour, ce qui suggère que d’autres connaissances restent nécessaires. Dans cette étude, il visait d’analyser les modifications transcriptomiques liées aux facteurs inflammatoires dans l’AP à l’aide du séquençage de l’ARN (RNA-seq). L’RNA-seq a été réalisé sur des échantillons de patients atteints de PA (n = 11) et d’individus témoins (n = 3). Des gènes différenciellement exprimés (DEG) ont été identifiés via Metascape, suivis d’une analyse d’enrichissement des voies KEGG via le package clusterProfiler dans le logiciel R, d’une analyse d’infiltration immunitaire via CIBERSORT, et d’un réseau d’interaction protéine-protéine (PPI) via la base de données STRING. Les gènes hub au sein du réseau PPI ont été identifiés à l’aide du plugin CytoHubba. Un total de 3713 DEG ont été identifiés dans le groupe AP, dont 2097 gènes à la hausse et 1616 à la baisse. Les résultats ont montré que les DEG étaient principalement enrichis dans les voies immunitaires et liées à l’inflammation. Trois facteurs liés à l’inflammation — CCL3, CCL4 et CXCL1 — ont été considérés comme des gènes centraux majeurs dans le processus pathologique de l’AP. L’analyse d’infiltration immunitaire a révélé un microenvironnement distinct dans l’AP, caractérisé par une augmentation significative des macrophages M0 ainsi que des réductions des cellules T CD8⁺, des cellules NK activées et des mastocytes au repos dans l’AP. En conclusion, ces résultats procéduraux décrivent l’expression différente de CCL3, CCL4 et CXCL1 ainsi que leur association avec une composition cellulaire immunitaire modifiée dans l’AP, mettant en lumière les trois chimiokines comme candidates potentielles pour une investigation mécanistique plus approfondie.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) représentent une menace sérieuse pour la santé humaine dans le^{monde 1}. À mesure que la tendance mondiale au vieillissement de la population s’intensifie, l’incidence des MCV est également en hausse². Parmi elles, la plaque athéroscléreuse (AP) est l’une des principales causes de la^{MCV 3}. La PA est une maladie inflammatoire chronique, caractérisée par l’accumulation progressive de lipides dans l’intimité des artères et la formation de^{plaques 4}. La PA est la cause courante des événements cardiovasculaires et cérébrovasculaires et concerne principalement des artères de grande et moyenne taille, conduisant à l’ischémie et à des lésions, et constitue un facteur majeur causant des maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires ainsi que la mort⁵. En raison de l’absence de symptômes évidents aux premiers stades, la PA est généralement avancée au moment du diagnostic, ce qui entraîne un taux de létalité^{élevé 6}. Le traitement de la PA se concentre sur ses facteurs de risque, incluant des facteurs modifiables tels qu’une faible activité physique, un comportement sédentaire, le tabagisme, des troubles de santé^{mentale 7}, ainsi que l’obésité et le diabète de type 2 dû à un régime riche en graisses, ainsi que des facteurs non modifiables tels que les gènes, l’âge et^{le sexe 8}. Des études récentes ont montré que le syndrome métabolique, l’homocystéinémie, l’hyperuricémie et la résistance pancréatique sont des facteurs de risque importants pour l’apparition et le développement de l’athérosclérose ^9,10.

Les théories liées à la pathogenèse de la PA incluent principalement celles de l’infiltration lipidique, de l’inflammation, de la réponse au stress oxydatif, de l’infection, et de l’interaction entre facteurs génétiques et environnementaux^11,12. Parmi eux, l’inflammation et le stress oxydatif sont reconnus comme la pathogenèse centrale de la PAA et participent à tous les processus, de l’apparition au développement et à la détérioration de la^PA13. Les dommages soudains de la plaque instable de la PA, de l’activation des plaquettes et de la thrombose sont des pathogènes importants de l’infarctus du myocarde et de l’AVC^{hémorragique 14}. Grâce à des recherches continues, il a été constaté que l’AP contient non seulement des lipides mais aussi de nombreuses cellules^{inflammatoires 15}. Le tabagisme, l’hypertension, les troubles lipidiques, l’hyperinsulinémie, l’hyperglycémie, l’acide urique élevé et d’autres stimuli nocifs induisent les globules blancs et les cellules endothéliales à libérer en continu des molécules d’adhésion solubles et diverses cytokines, et favorisent l’adhésion des monocytes aux cellules endothéliales vasculaires. Les chimiokines accumulées entraînent en outre la migration des monocytes vers l’espace subendothélial et leur différenciation en macrophages, qui phagocytosent ensuite la lipoprotéine oxydée de basse densité (LDL) riche en cholestérol dans le tissu, se transformant ainsi en cellules mousseuses et initiant la formation de stries^{lipidiques 16}. Les dommages pathologiques précoces de la SA, à savoir les stries lipidiques, sont principalement composés de macrophages et de lymphocytes T, qui constituent une lésion inflammatoire^{typique 17}. Par conséquent, diverses cellules inflammatoires et leurs produits sont impliqués dans l’initiation et la progression de l’AP¹⁸. Cependant, le paysage inflammatoire de la PA est complexe et implique plusieurs facteurs connus et potentiellement inconnus. Les approches traditionnelles du gène candidat peuvent ne pas parvenir à capturer l’ensemble de ces facteurs inflammatoires.

Pour remédier à cette limitation, nous avons utilisé le séquençage de l’ARN (RNA-seq), une méthode transcriptomique à haut débit et impartiale. Cette approche est particulièrement appropriée pour les études génératrices d’hypothèses où les principaux moteurs moléculaires ne sont pas prédéfinis. Contrairement aux méthodes basées sur les gènes candidats ou microarrays, RNA-seq offre une plage dynamique plus large, une sensibilité plus élevée et la capacité de détecter de nouveaux transcrits sans conception préalable de la^{sonde 19,20}. Ces caractéristiques le rendent particulièrement adapté à la découverte de signatures liées à l’inflammation dans la PA, où la base moléculaire reste incomplètement caractérisée.

Dans cette étude, l’RNA-seq a été réalisé pour analyser les mécanismes sous-jacents des facteurs inflammatoires associés à la PA. Des outils bioinformatiques utilisant différents algorithmes ont été utilisés pour dépister une série de DEG. Par la suite, une analyse d’enrichissement (WGCNA, voie KEGG, mcode, GSEA, analyse génique centrale) et une analyse des interactions protéine-protéine (PPI) ont été réalisées. Les résultats de cette étude contribuent à une meilleure compréhension du mécanisme pathologique moléculaire sous-jacent à l’AP provoquée par l’inflammation et jouent un rôle important dans la recherche de nouveaux biomarqueurs.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital populaire de Liaocheng (numéro d’approbation : 2023014) et a respecté les principes de la Déclaration d’Helsinki. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants. Des formulaires de consentement éclairé ont été signés par tous les patients ou leurs familles.

Patients et échantillons

Cette étude a analysé rétrospectivement 11 patients atteints de sténose sévère de l’artère carotide ayant subi une endartériectomie carotide au Département de neurochirurgie vasculaire de l’hôpital populaire de Liaocheng, province du Shandong, Chine, de janvier 2023 à décembre 2023. Ces patients ont été inscrits dans le groupe AP. Le diagnostic de la sténose de l’artère carotide était basé sur des données d’imagerie telles que l’ATC ou l’angiographie cérébrale. Les critères d’inclusion pour le groupe AP étaient : (1) âge entre 50 et 80 ans ; (2) la tomodensitométrie : l’angiographie par soustraction numérique a confirmé la sténose de l’artère carotide interne intracrânienne ≥70 % ; (3) score modifié de l’échelle de Rankin avant le début ≤ 1 ; (4) consentement éclairé obtenu du patient ou de son représentant légal. Les critères d’exclusion étaient : (1) maladies inflammatoires ou immunitaires ; (2) la présence de troubles psychiatriques ; (3) présence de tumeurs malignes ; (4) la grossesse, l’allaitement ou le potentiel de procréation. Âge correspondant Les patients atteints de traumatismes crâniens sévères ayant subi un don d’organes dans le même hôpital durant la même période ont été sélectionnés comme groupe témoin (AN ; Contrôle normal, n = 3). Les sujets des deux groupes ont été appariés pour leur âge, leur sexe et leur indice de masse corporelle afin d’éliminer les facteurs de confusion. Les critères d’inclusion pour le groupe témoin étaient : (1) âge entre 50 et 80 ans ; (2) aucun antécédent de maladie coronarienne, de sténose carotide ou d’autres maladies vasculaires systémiques ; (3) le consentement éclairé obtenu du représentant légal du patient. Des échantillons d’intima et de plaque de l’artère carotide ont été prélevés dans le groupe AP lors de l’endartectomie carotide, tandis que des échantillons d’intime aortide ont été prélevés dans le groupe témoin après le don d’organes. Les tissus vasculaires et de plaque étaient stockés dans des réservoirs d’azote liquide pour des tests ultérieurs. Les caractéristiques de référence des patients atteints de PA sont présentées dans le tableau 1.

Préparation de l’échantillon

L’extraction totale d’ARN a été extraite à l’aide d’un réactif TRIzol conformément aux instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l’ARN ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ND-2000 à 260 nm et 280 nm (rapport A260/A280 entre 1,8 et 2,0). L’intégrité de l’ARN a été évaluée à l’aide d’électrophorèse en gel d’agarose à 2 % à 100 V pendant 30 minutes. Les valeurs d’intégrité de l’ARN (RIN) ont été obtenues à l’aide du bioanalyseur Agilent 2100 (des échantillons avec RIN ≥ 7,0 ont été utilisés pour l’analyse en aval). Toutes les procédures de manipulation des échantillons et d’extraction d’ARN ont été effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Le réactif TRIzol a été éliminé conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets chimiques dangereux.

Séquençage de l’ARN

Après le traitement par DNase I de l’ARN total, l’ARNm a été enrichi à l’aide de billes magnétiques Oligo D (T) puis fragmenté en petits morceaux à 94 °C pendant 5 minutes. Les fragments d’ARNm résultants servaient de modèle, avec un oligonucléotide aléatoire comme amorce. L’ADNc de première brin a été synthétisé via le système de transcriptase inverse M-MuLV à 42 °C pendant 50 minutes, suivi de la dégradation des brins d’ARN médiée par RNase H. La synthèse du second brin a été réalisée à l’aide de dNTP au sein du système ADN polymérase I. L’ADNc double brin a été purifié, les extrémités réparées, et placées avec un surplomb en forme de « A » pour faciliter la ligature de l’adaptateur. Les billes XP d’AMPure ont été utilisées pour sélectionner des fragments d’ADNc de 250 à 300 pb, qui ont ensuite été amplifiés par PCR. Par la suite, les produits amplifiés ont été purifiés pour générer la bibliothèque finale. Le séquençage de bibliothèque était effectué sur la plateforme Illumina HiSeq avec une longueur de lecture à extrémités jumelées de 150 pb. Pour le contrôle de la qualité des données (QC), les données brutes contenant des séquences d’adaptateurs ou des bases de faible qualité ont été filtrées à l’aide de scripts internes. En raison des erreurs de séquençage pouvant découler de l’instrument, la qualité des données a été évaluée en analysant la distribution des taux d’erreur de séquençage (le taux d’erreur < 1 % était considéré comme acceptable). De plus, la distribution du contenu du GC a été déterminée. Toutes les procédures de séquençage étaient effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les réactifs contenant des produits chimiques dangereux (par exemple, les tampons de DNase I) ont été éliminés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.

Seuils de contrôle qualité et dépannage

Seuls des échantillons avec RIN ≥ 7.0 et des bibliothèques de fragment de taille 250–300 bp ont été utilisés. Un minimum de 14 millions de lectures brutes par échantillon avec 98 % au Q30 ≥ était requis. Le faible rendement de la bibliothèque a été résolu en augmentant les cycles PCR à 18, mais 15 cycles ont été préférés pour maintenir les taux de doublons en dessous de 15 %.

Dépistage des DEG

Nous avons évalué la répartition des niveaux d’expression génique à travers différents échantillons. La corrélation inter-échantillons des niveaux d’expression génique a été utilisée pour vérifier la fiabilité expérimentale et la pertinence de la sélection de l’échantillon. L’analyse en composantes principales (ACP) a été appliquée pour évaluer les différences intergroupes et la reproductibilité intra-groupe. Les DEG ont été identifiés à l’aide de la base de données en ligne Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). Les DEG étaient définies comme celles avec |log₂(changement de pliage) | > 1 et une valeur p. < 0,05, considérées comme statistiquement significatives. Toutes les analyses bioinformatiques étaient réalisées en utilisant des paramètres par défaut, sauf indication contraire. En tant que point de contrôle de reproductibilité intermédiaire, des graphiques PCA ont été générés pour confirmer que les échantillons se regroupaient par groupe plutôt que par lot.

Analyse d’enrichissement de l’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG)

L’analyse KEGG (http://www.genome.jp/) est une approche systématique pour évaluer la fonction génique afin de découvrir des voies régulatrices biologiques. Cet article a d’abord obtenu l’identifiant officiel du gène de conversion symbolique du gène différentiel à partir de org.Hs.eg (version 3.12.0). L’analyse du chemin KEGG a été réalisée à l’aide du package clusterProfiler dans le logiciel R (version 4.2.0). Un p. < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. Un résultat intermédiaire a été la génération d’une liste classée de voies enrichies avec le nombre de gènes correspondant et les valeurs p ajustées.

Analyse du réseau PPI

Pour construire le réseau PPI et le gène clé d’écran, la base de données STRING (version 11.0, https://string-db.org/) a été utilisée. Seules les interactions avec un score composite supérieur à 0,9 ont été conservées comme statistiquement significatives. Le réseau a été visualisé et analysé à l’aide de Cytoscape (version 3.10.1), un outil bioinformatique open source conçu pour explorer les réseaux d’interactions moléculaires. Les gènes hub du réseau PPI ont été identifiés à l’aide du plugin CytoHubba (version 0.1).

Gène hub

Les 20 gènes clés principaux ont été sélectionnés par le plugin CytoHubba. Le rouge indique des niveaux élevés du gène. L’analyse bioinformatique des gènes hub par la base de données en ligne Metascape (version 3.5, http://metascape.org/gp/index) a permis d’analyser 20 gènes hub auparavant. L’enrichissement génétique a été identifié dans les classes d’ontologie suivantes : WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Tous les gènes du génome servent de fond d’enrichissement. Les items avec p. < 0,05, le nombre minimum 3 et le facteur d’enrichissement > 1,5 ont été sélectionnés.

Méthode d’analyse statistique

Le logiciel statistique SPSS 25.0 a été utilisé pour analyser les données. Les données de comptage étaient exprimées en fréquence ou en pourcentage, et la comparaison entre groupes a été testée par le test du chi-carré. Les données de mesure étaient cohérentes avec la moyenne ± l’écart-type de la distribution normale, et le test T a été utilisé pour la comparaison entre les groupes. p. < 0,05 était considéré comme une différence significative.

Résultats

Analyse des données ARN-seq des gènes différentiels dans les plaques athérosclérotiques

Seuls les échantillons avec RIN ≥ 7.0 ont été utilisés pour la préparation à la bibliothèque. Les 14 échantillons (11 AP, 3 témoins) ont tous franchi ce seuil. Tous les échantillons étaient séquencés en un seul lot ; par conséquent, aucun ajustement de l’effet de lot n’était nécessaire. En moyenne, 16,8 millions de lectures brutes par échantillon ont été générées ; Après filtrage de qualité, 16,5 millions de lectures propres (98 %) ont été conservées, dont 91 % sont correspondues de manière unique au génome de référence humain (HG38). L’analyse des DEG a montré qu’il y avait 2097 gènes à la hausse et 1616 à la baisse (|log2FC| >1, P <0,05) chez les patients présentant des plaques d’athérosclérose comparés aux témoins sains (Figure 1A). La carte thermique des 20 gènes différenciellement exprimés à la hausse et à la baisse a été présentée à la Figure 1B. Le séquençage de l’ARN transcriptomique a révélé des corrélations d’échantillons (Figure 1C). La corrélation entre les modules géniques co-exprimés et les phénotypes a été analysée par WGCNA (Figure 1D). L’analyse PCA a montré qu’il y avait une différence significative entre le groupe NA et le groupe AP (P.< 0,05) (Figure 1E).

Analyse d’enrichissement KEGG des gènes différentiels

L’analyse d’enrichissement des voies KEGG utilisant le package clusterProfiler dans le logiciel R (version 4.2.0) a été réalisée séparément sur les gènes exprimés différemment à la hausse et à la baisse dans le groupe de la maladie (Figure 2A,B). Les résultats ont montré que ces gènes étaient significativement enrichis dans des voies liées à l’immunité et à l’inflammation, telles que la lignée cellulaire hématopoïétique, la polyarthrite rhumatoïde, l’adhésion focale, la signalisation de l’intégrine et la voie de signalisation des chimiokines.

Analyse GSEA

L’analyse GSEA a montré que les gènes principaux du groupe expérimental étaient principalement enrichis en haut, montrant une tendance à la hausse (Figure 3A). Les gènes centraux du groupe témoin étaient principalement enrichis en bas, montrant une tendance à la baisse (Figure 3B). En résumé, les gènes inflammatoires ont été augmentés dans le groupe expérimental (ASA) et baissés dans le groupe témoin (NA).

Analyse des réseaux PPI

Dans le réseau PPI analysé à l’aide de la base de données STRING (version 11.0), les nœuds partageant le même identifiant de cluster ont tendance à être positionnés proches les uns des autres. Comme montré à la Figure 4A, ce regroupement a révélé que les gènes correspondants sont principalement impliqués dans la régulation de l’activation cellulaire, de la réponse inflammatoire et de l’activation cellulaire. La figure 4B présente le même réseau coloré par des valeurs p, où les groupes contenant plus de gènes présentent des valeurs p plus significatives.

Identification des gènes centrals et analyse de l’infiltration des cellules immunitaires

Les DEG ont été sélectionnés pour l’analyse mcode et les résultats d’analyse sont principalement liés aux récepteurs de l’acétylcholine (Figure 5 et Tableau 2). L’analyse des gènes hub utilisant le plugin CytoHubba dans Cytoscape a identifié les 20 principaux gènes hub, dont la plupart étaient associés à l’immunité et à l’inflammation (Figure 6A, panneau de gauche). Les 10 principaux gènes du hub comprenaient CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 et CCR5 (Figure 6A, panneau de droite). L’intersection des gènes hubs avec les gènes du panel inflammatoire olink 92 a révélé 5 gènes communs, dont CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 et CCL4 (Figure 6B). L’analyse CIBERSORT a révélé des différences significatives dans l’infiltration des cellules immunitaires entre le groupe pathologique et les témoins sains. Comparé au groupe témoin, le groupe des maladies présentait une proportion significativement plus élevée de macrophages M0 (p < 0,05) (Figure 6C). Inversement, les proportions de cellules T CD8, de cellules NK activées et de la plupart des cellules au repos étaient significativement plus faibles dans le groupe de la maladie (p. < 0,05 pour toutes) (Figure 6C).

Analyse fonctionnelle des gènes hubs

Nous avons ensuite analysé la fonction biologique du gène Hub à l’aide de la base de données Metascape, révélant que ces gènes sont principalement associés à la voie de signalisation médiée par les cytokines et à la signalisation médiée par le calcium (Figure 7A et Tableau 3). Les signatures de type cellulaire ont ensuite été utilisées pour enrichir les facteurs régulateurs transcriptionnels du gène central, montrant que les gènes du hub étaient principalement liés à la cellule paneth 24W C11 du gros intestin gao, au macrophage C8 du cœur développeur de cui, et aux neurotypes du manno au mésencéphale hmgl (Figure 7B). L’analyse d’enrichissement de la maladie dans la base de données DisGeNET a démontré que les gènes hub étaient associés à des lésions cutanées, des infections au virus d’Epstein-Barr et à l’encéphalite tick-bome (Figure 7C). L’analyse d’enrichissement des caractéristiques tissulaires de la base de données PaGenBase a montré que les gènes du hub étaient principalement enrichis dans la rate, le sang et les poumons (Figure 7D). De plus, l’analyse de la base de données TRRUST a révélé que RELA et NFKB1 sont les principaux facteurs de transcription régulant les gènes hub (Figure 7E).

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

La matrice de comptage traitée est fournie sous forme de fichiers supplémentaires (Fichier Supplémentaire 1 et Fichier Supplémentaire 2). Toutes les autres données sont entièrement présentées dans l’article. Les données brutes de séquençage sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

Figure 1 : Analyse des DEG. (A) plaques saines et plaques athéroscléreuses, carte différentielle des volcans génétiques, régulée à la hausse 2097, régulée à la baisse 1616 (|log2FC| > 1, P.< 0,05). (B) Carte thermique des 20 gènes les plus hauts et baissés exprimés différemment. (C) Analyse de corrélation par échantillon. (D)La corrélation entre les modules géniques co-exprimés et les phénotypes a été analysée par WGCNA. (E) analyse PCA (groupe NA était significativement différente du groupe AP). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Analyse KEGG. L’analyse d’enrichissement des voies KEGG a été réalisée séparément sur les gènes à expression différentielle à la hausse (A) et à la baisse (B) dans le groupe pathologique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Analyse GSEA. (A) L’analyse GSEA a montré que les gènes principaux du groupe expérimental étaient principalement enrichis au sommet, montrant une tendance à la hausse de la régulation. (B) Dans le groupe témoin, les gènes principaux étaient principalement enrichis au bas et présentaient une tendance à la baisse. En conclusion, les gènes inflammatoires ont été augmentés dans le groupe expérimental (AP) et baissés dans le groupe témoin (NA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Diagramme du réseau PPI. (A) Coloré par identifiant de cluster, où les nœuds partageant le même identifiant de cluster sont généralement proches les uns des autres. (B) Coloration avec des valeurs P, où les éléments contenant plus de gènes ont des valeurs P plus significatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : analyse mcode des DEG. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse génique du hub. (A) Les 20 meilleurs gènes hub (panel gauche) et les 10 gènes hub principaux (panel droit) obtenus par méthode de calcul des degrés via le plugin CytoHubba dans Cytoscape, qui sont principalement associés à l’immunité et à l’inflammation. (B) L’intersection des gènes hubs et des gènes du panel inflammatoire olink 92 identifiait 5 gènes d’intersection. (C) L’algorithme CIBERSORT a été utilisé pour comparer l’abondance d’infiltration de 22 sous-ensembles de cellules immunitaires entre les groupes AP et NA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Analyse bioinformatique des gènes hub. (A) Annotation fonctionnelle des gènes hub à l’aide de la base de données Metascape. (B) Analyse d’enrichissement des régulateurs transcriptionnels associés aux gènes hubs basée sur les signatures de type cellulaire. (C) Analyse d’enrichissement de maladies des gènes hub réalisée avec la base de données DisGeNET. (D) Schémas d’expression spécifiques aux tissus des gènes hubs identifiés via la base de données PaGenBase. (E) Réseau régulateur transcriptionnel des gènes hub analysé à l’aide de la base de données TRRUST. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

MCODE	GO	Description	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Récepteurs de l’acétylcholine nicotinique hautement perméables au calcium	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Récepteurs présynaptiques de l’acétylcholine nicotinique	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Récepteurs postsynaptiques de l’acétylcholine nicotinique hautement perméables au calcium	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canaux potassiques à domaine tandem	-10.3
MCODE_2	GO : 0030322	Stabilisation du potentiel membranaire	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Phase 4 - potentiel de membrane au repos	-9.7

Tableau 1 : Caractéristiques de référence des patients atteints de PA

MCODE	GO	Description	Log10(P)
MCODE_1	GO : 0030322	Récepteurs de l’acétylcholine nicotinique hautement perméables au calcium	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Récepteurs présynaptiques de l’acétylcholine nicotinique	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Récepteurs postsynaptiques de l’acétylcholine nicotinique hautement perméables au calcium	-16.7

Tableau 2 : L’analyse d’enrichissement MCODE des DEG.

MCODE	GO	Description	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Récepteurs de l’acétylcholine nicotinique hautement perméables au calcium	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Récepteurs présynaptiques de l’acétylcholine nicotinique	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Récepteurs postsynaptiques de l’acétylcholine nicotinique hautement perméables au calcium	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canaux potassiques à domaine tandem	-10.3
MCODE_2	GO : 0030322	Stabilisation du potentiel membranaire	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Phase 4 - potentiel de membrane au repos	-9.7

Tableau 3 : L’analyse d’enrichissement MCODE du gène central.

Fichier supplémentaire 1 : Contrôle (n=3) Expression génique.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Patients (n=10) Gène de la table centrale.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Avec l’approfondissement continu de la recherche sur la PA, de nouvelles cytokines sont constamment détectées dans la PA, et l’inflammation est devenue un facteur important dans la genèse et le développement de^{l’AS 21,22}. L’activation de l’albumine peut rompre la connexion entre les cellules endothéliales et la matrice vasculaire intimaire et favoriser la décollation des cellules endothéliales de l’intima vasculaire. Lésion vasculaire induite^{de l’intimité 23,24}. L’inflammation induit une modification oxydative du LDL-C, et le LDL-C modifié conduit à son tour au processus inflammatoire dans l’intima de l’artère, accélérant ainsi la formation^{de l’AP 25}. Les plaques instables peuvent finir par se rompre et provoquer le SCA à l’aide de causes internes et^{externes 26}. Lors de la rupture de la plaque, les macrophages, les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) et les lymphocytes sécrètent des facteurs inflammatoires tels que l’interleucine-1 leucocytaire-1 (IL-1), l’IL-6, le facteur d’adhésion intervasculaire 1 et le facteur d’adhésion intercellulaire 1. Parallèlement, l’expression de l’intégrine leucocytaire (CD11b/CD18), un récepteur sur les monocytes et les granulocytes, est^{augmentée de 27,28}. Cependant, le mécanisme moléculaire de l’inflammation menant à la formation de la PA reste à explorer davantage.

L’apparition et le développement de la PA causés par l’inflammation constituent un parcours complexe d’action multifactorielle, de changement multi-gène et de maladies à plusieurs stades, particulièrement étroitement lié à l’expression anormale de nombreux gènes. Dans cette étude, l’analyse de l’ARN-Seq et de la bioinformatique a révélé qu’entre les tissus témoins sains et la PA, le graphique volcanique des DEG montrait 2097 gènes régulés à la hausse et 1616 à la baisse. Une analyse supplémentaire d’enrichissement KEGG des DEG a montré que ces derniers étaient principalement enrichis dans les voies immunitaires et inflammatoires. L’analyse des gènes hub a identifié les 10 principaux gènes hub, soit CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 et CCR5. L’intersection des gènes hubs avec les gènes du panel inflammatoire olink 92 a révélé 5 gènes communs, dont CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 et CCL4. Ces résultats suggèrent que les facteurs liés à l’inflammation CCL3, CCL4 et CXCL1 pourraient jouer un rôle crucial dans le processus pathologique de la PA. L’analyse d’infiltration immunitaire a révélé un microenvironnement distinct caractérisé par une augmentation significative des macrophages M0 ainsi que des réductions des cellules T CD8⁺, des cellules NK activées et des mastocytes au repos dans les plaques.

Les macrophages M0 représentent un pool non engagé capable d’interniser facilement le LDL oxydé et de se différencier en cellules mousseuses, un événement caractéristique de l’athérogenèse^{précoce 29}. La proportion élevée de macrophages M0 observée dans le groupe pathologique indique une accumulation de ces cellules précurseurs dans le microenvironnement de la plaque. CCL4, principalement produit par des macrophages et des lymphocytes T activés, sert de stimulus persistant qui soutient l’activation des macrophages via la voie de signalisation NFκB, favorise l’expression des molécules d’adhésion et induit la métalloprotéinase matricielle-2 et la -9, facilitant ainsi la transition des macrophages M0 vers un état pro-athérogène et compromettant directement la stabilité de la^{plaque 30}. La proportion réduite de lymphocytes T CD8⁺ pourrait refléter la suppression médiée par CCL3 des sous-ensembles athéroprotecteurs de cellules T. Komissarov et al. ont démontré que la migration des lymphocytes T vers les plaques athérosclérotiques humaines se produit principalement via l’axe CCR5-CCL3³¹. De plus, Döring et ^al.32 ont découvert une voie non canonique par laquelle CCL17 signale via CCR8 pour induire l’expression de CCL3, ce qui supprime à son tour la différenciation régulatrice des cellules T ; l’ablation génétique de CCL3 dans les cellules T CD4⁺ augmentait les taux de FoxP3⁺ Treg et limitait l’athérosclérose, tandis que l’administration de CCL3 aggravait la maladie et restreignait la différenciation de Treg. Ce changement diminue probablement les lymphocytes T régulateurs athéroprotecteurs CD8⁺ tout en favorisant les lymphocytes T effecteurs pathogènes, entraînant la diminution nette de la proportion de cellules T CD8⁺ observée dans notre analyse. La réduction des cellules NK activées et des mastocytes au repos reflète probablement des altérations de l’état d’activation plutôt qu’une perte absolue de ces populations. Bonaccorsi et ^al.33 ont rapporté que les plaques carotides symptomatiques présentent une infiltration accrue des cellules NK et une production accrue de γ d’IFN, liant directement l’activation des cellules NK à l’instabilité clinique de la plaque. Pour les mastocytes, Wezel et ^al.34 ont démontré que les chimiokines libérées par les mastocytes activés, en particulier CXCL1, induisent le recrutement de neutrophiles via les axes CXCL1/CXCR2, aggravant ainsi la réponse inflammatoire en cours et favorisant la progression et la déstabilisation de la plaque. Ainsi, la diminution de la proportion de cellules NK activées et de mastocytes au repos reflète probablement leur activation, dégranulation ou épuisement dans le milieu de la plaque inflammatoire, plutôt qu’une véritable déplétion numérique.

Cette étude présente plusieurs limites. Premièrement, cette étude repose uniquement sur le séquençage du transcriptome et est limitée par la petite taille de l’échantillon. Au-delà de la taille limitée de l’échantillon, plusieurs limitations techniques du protocole RNA-seq doivent être notées. L’ARN-seq en vrac masque l’hétérogénéité cellulaire ; Des approches monocellulaires sont nécessaires pour résoudre l’expression spécifique à chaque type de cellule de CCL3, CCL4 et CXCL1. La déconvolution immunitaire computationnelle (CIBERSORT) fournit uniquement des estimations, pas des mesures directes. L’abondance d’ARN ne correspond pas toujours aux niveaux de protéines ; une validation orthogonale est requise. Les études futures devraient répondre à ces limites en utilisant la transcriptomique unicellulaire, des cohortes plus grandes et indépendantes, la validation orthogonale des protéines.

En conclusion, les présentes conclusions ont souligné le rôle important des facteurs inflammatoires dans le processus physiopathologique de la PA. De plus, nous avons identifié les gènes hub CCL3, CCL4 et CXCL1, qui pourraient former un réseau coordonné de chimiokines alimentant l’athérosclérose en favorisant l’accumulation de macrophages M0, en supprimant les sous-ensembles protecteurs des lymphocytes T et en modifiant les états d’activation des cellules NK et des mastocytes. Dans l’ensemble, ces résultats mettent en lumière les trois chimiokines comme des régulateurs essentiels du microenvironnement immunitaire contre la plaque et des cibles thérapeutiques potentielles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Trizol	Invitrogen	15596026CN	Extraction d’ARN
Spectrophotomètre Nanodrop ND-2000   ;	Thermo Fisher Scientific	ND2000	Détection de la concentration d’ARN
Bioanalyseur Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Contrôle qualité ARN
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Séquençage du transcriptome
Billes magnétiques Oligo D (T)	New England Biolabs	S1550S	Enrichissement de l’ARN