Test de neutralisation de la réduction de la fluorescence du virus de l’hépatite E pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants

Summary

Il n’existe pas de test standard de neutralisation virale pour le virus de l’hépatite E (HEV), un virus à ARN positif non cytopathique. Ici, un test de neutralisation de réduction de fluorescence (FRNT) basé sur la quantification de la protéine de capside virale marquée par fluorescence est décrit pour évaluer l’efficacité des anticorps anti-HEV.

Abstract

Le test de neutralisation virale mesure le potentiel de neutralisation d’un anticorps ou d’un mélange d’anticorps contre le virus correspondant. C’est une technique précieuse pour évaluer l’efficacité des candidats vaccins et des anticorps neutralisants développés contre le virus. Le test de neutralisation de réduction de la plaque (PRNT) est une méthode populaire pour évaluer le titre des anticorps neutralisants spécifiques au virus. Cependant, la PRNT n’est pas réalisable dans le cas des virus non cytopathiques. Le virus de l’hépatite E (HEV) est un virus à ARN simple brin à sens positif, appartenant à la famille des Hepeviridae. C’est une cause majeure d’hépatite virale aiguë dans le monde. Il ne présente aucun effet cytopathique dans la culture cellulaire de mammifères. Un vaccin contre le VHE est disponible en Chine. Cependant, les vaccins ou les anticorps thérapeutiques contre le VHE ne sont pas disponibles dans la plupart des régions du monde. Plusieurs laboratoires travaillent sur des candidats vaccins contre le HEV. Un test de neutralisation pour mesurer l’efficacité des vaccins contre le VHE sera un outil très utile pour les chercheurs. Ici, nous décrivons un test de neutralisation par réduction de fluorescence (FRNT) pour estimer le titre de neutralisation de 50 % (NT₅₀) des anticorps anti-HEV. Neutralisé anti-HEV ORF2, ou HEV neutralisé par IgG chez le lapin, a été utilisé pour infecter les cellules Huh7, suivi d’une coloration immunofluorescente de la protéine virale ORF2. Les cellules fluorescentes positives ont été quantifiées dans l’application ImageJ, et NT₅₀ a été estimé à 2,1 x 10³. Cette méthode peut être appliquée pour estimer le NT₅₀ des anticorps anti-HEV présents chez les sérums de souris immunisées, les sérum individuels récupérés par le HEV, et les anticorps anti-HEV produits en laboratoire.

Introduction

Le virus de l’hépatite E (HEV) est un virus à ARN simple brin à sens positif appartenant à la famille des Hepeviridae ^1,2. Elle provoque généralement une hépatite aiguë auto-limitante mais peut provoquer une hépatite chronique chez les personnes^{immunodéprimées 3,4}. Les femmes enceintes présentent un risque élevé de développer une insuffisance hépatique fulminante, le taux de mortalité pouvant atteindre jusqu’à 30 ^%. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a rapporté environ 19,47 mill....

Protocol

L’approbation du comité d’éthique institutionnelle (IEC) a été obtenue pour prélever un échantillon fécal d’un patient infecté par le VHE admis au Département de Gastroentérologie de l’AIIMS, New Delhi. Un consentement éclairé a été obtenu auprès des patients participant à l’étude. Les détails des réactifs et des équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement et quantification du virus

1. Avec consentement éclairé, prélever l’échantillon fécal d’un patient infecté par le VHE pour la purification du virus.
2. Resuspendez l’échant....

Results

Infection des cellules Huh7 avec la caractérisation du g1-HEV et du virus

Le g1-HEV a été isolé à partir d’un échantillon fécal à l’aide d’une série d’étapes, comme illustré (Figure 1A). Le nombre de copies génomiques du g1-HEV purifié a été estimé par RT-qPCR, suivi d’un stockage à -80 °C. Pour confirmer l’infection virale et la réplication, les cellules Huh7 ont été infectées par 1,8 × 10 équivalents de⁴

Discussion

La FRNT est une méthode basée sur l’immunocoloration permettant d’estimer le potentiel de neutralisation des anticorps. Il a été utilisé pour estimer les valeurs de NT₅₀ pour les anticorps contre plusieurs virus, notamment le virus de la dengue (DENV), le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus-2 (SARS-CoV-2) et le virus de l’encéphalite japonaise (JEV^)23,24,25. Dans cette métho.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes microfuge de 1,5 mL	Axygène	MCT-150-C
Plat de culture cellulaire à 12 puits	Corning	3512
Vibrateur à 37 degrés	Thermo Scientific	50163013
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole	Abcam	AB104139	DAPI
Tube centrifugeuse de 50 mL	Faucon	352070
Antenne de culture cellulaire à 6 puits	Corning  ;	3516
Anticorps secondaire IgG de la farine Alexa 594	Thermo Scientific	A-11012
Anticorps anti-ORF2	Genscript	NA	Synthétisé sur mesure par Genscript et caractérisé dans notre laboratoire 14
Anticorps IgG anti-lapin	Genscript	NA
Albumine sérique bovine	HIMEDIA	MB083	BSA
Microscope confocal	Olympe	FV3000
DMEM, glycémie élevée	HIMEDIA	AL007A
Sérum fœtal bovin	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org (Wayne Rasband et contributeurs, NIH, États-Unis)
Sérum de chèvre normal	HIMEDIA	RM-10701
Paraformélélidoïde	HIMEDIA	GRN3660	PFA
Solution tampon phosphate pH 7,4	HIMEDIA	TL1006	PBS
Polyéthylénéglycol 6000	SIGMA	81255	PEG6000
Kit de sonde en 1 étape SOLIScript	SOLIS BIODYNE	08-57-00250
Réactif TRI	Centre de Recherche Moléculaire	TR118
Triton X100	SIGMA	X100
Trypsine-EDTA	GIBCO	25300-54