Method Article

Test de neutralisation de la réduction de la fluorescence du virus de l’hépatite E pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il n’existe pas de test standard de neutralisation virale pour le virus de l’hépatite E (HEV), un virus à ARN positif non cytopathique. Ici, un test de neutralisation de réduction de fluorescence (FRNT) basé sur la quantification de la protéine de capside virale marquée par fluorescence est décrit pour évaluer l’efficacité des anticorps anti-HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le test de neutralisation virale mesure le potentiel de neutralisation d’un anticorps ou d’un mélange d’anticorps contre le virus correspondant. C’est une technique précieuse pour évaluer l’efficacité des candidats vaccins et des anticorps neutralisants développés contre le virus. Le test de neutralisation de réduction de la plaque (PRNT) est une méthode populaire pour évaluer le titre des anticorps neutralisants spécifiques au virus. Cependant, la PRNT n’est pas réalisable dans le cas des virus non cytopathiques. Le virus de l’hépatite E (HEV) est un virus à ARN simple brin à sens positif, appartenant à la famille des Hepeviridae. C’est une cause majeure d’hépatite virale aiguë dans le monde. Il ne présente aucun effet cytopathique dans la culture cellulaire de mammifères. Un vaccin contre le VHE est disponible en Chine. Cependant, les vaccins ou les anticorps thérapeutiques contre le VHE ne sont pas disponibles dans la plupart des régions du monde. Plusieurs laboratoires travaillent sur des candidats vaccins contre le HEV. Un test de neutralisation pour mesurer l’efficacité des vaccins contre le VHE sera un outil très utile pour les chercheurs. Ici, nous décrivons un test de neutralisation par réduction de fluorescence (FRNT) pour estimer le titre de neutralisation de 50 % (NT50) des anticorps anti-HEV. Neutralisé anti-HEV ORF2, ou HEV neutralisé par IgG chez le lapin, a été utilisé pour infecter les cellules Huh7, suivi d’une coloration immunofluorescente de la protéine virale ORF2. Les cellules fluorescentes positives ont été quantifiées dans l’application ImageJ, et NT50 a été estimé à 2,1 x 103. Cette méthode peut être appliquée pour estimer le NT50 des anticorps anti-HEV présents chez les sérums de souris immunisées, les sérum individuels récupérés par le HEV, et les anticorps anti-HEV produits en laboratoire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le virus de l’hépatite E (HEV) est un virus à ARN simple brin à sens positif appartenant à la famille des Hepeviridae 1,2. Elle provoque généralement une hépatite aiguë auto-limitante mais peut provoquer une hépatite chronique chez les personnesimmunodéprimées 3,4. Les femmes enceintes présentent un risque élevé de développer une insuffisance hépatique fulminante, le taux de mortalité pouvant atteindre jusqu’à 30 %. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a rapporté environ 19,47 millions de cas d’hépatite aiguë E (AHE) et 3450 décès causés par le VHE dans le monde en 20216. Le HEV est transmis principalement dans les pays en développement par la nourriture et l’eau contaminées, en raison d’une mauvaise hygiène, tandis que des infections professionnelles sporadiques dans les pays développés sont associées à la consommation de viande crue ousous-cuite 6. Le HEV est classé en huit génotypes. Le génotype (g) 1- et g2- HEV infecte exclusivement les humains. g3- et g4-HEV disposent d’une large gamme d’hôtes tels que humains, lapins, porcs, sangliers et cerfs. g5- et g6-HEV infectent les sangliers, tandis que g7- et g8-HEV infectent les chameaux. Un seul cas de transmission humaine du g7-HEV a été signalé au Moyen-Orient par la consommation de viande et de lait dechameau 7,8. L’infection par le HEV est principalement fréquente dans les pays à revenu faible ou intermédiaire. Plusieurs épidémies d’origine hydrique ont été signalées dans des régions endémiques d’Asie du Sud et du Sud-Est, d’Afrique et du Mexique, principalement causées par l’infection par le g1 et moins fréquemment par l’infection par le VIH G2. Les cas d’infection sporadiques dans les pays développés d’Europe et d’Asie de l’Est sont principalement causés par le g3-HEV 6,7.

Le génome HEV est un ARN plus brin de 7,2 kb qui contient un capuchon de 7-méthylguanine à l’extrémité 5′, trois référentiels de lecture ouverts (ORF) suivis d’un extrémité 3' poly-adénylée. ORF1 code la polyprotéine non structurelle, composée de sept domaines distincts : méthyltransférase (Met), domaine Y, protéase cystéine de type Papain (PCP), domaine V, macrodomaine (domaine X), hélicase (Hel) et ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp). ORF2 code la protéine de la capside, responsable de l’assemblage de la capside virale. ORF3 code pour une phosphoprotéine qui agit comme une viroporine et aide à l’évacuationvirale 9. Un référentiel de lecture ouvert supplémentaire, ORF4, est présent dans le g1-HEV, qui est traduit via un mécanisme indépendant du capuchon, utilisant un élément interne de type site d’entrée de ribosome situé à l’intérieur de l’ORF1. L’expression d’ORF4 est renforcée par des composés endoplasmiques inducteurs de stress dans le réticule. ORF4 a été proposé pour promouvoir l’assemblage complexe de réplication g1-HEV10.

Bien que le HEV ne se réplique pas efficacement in vitro, certaines souches du virus, isolées chez des patients atteints d’hépatite E, ont été propagées avec succès dans des hépatocytes, une lignée cellulaire pulmonaire et une lignée cellulaire épithélialedu côlon 11. Cependant, il est difficile de propager le virus de manière robuste dans les cellules cultivées. Le clone d’ADNc infectieux de g1-HEV (souche Sar55) a été utilisé pour des études in vitro, mais la production et la propagation efficaces de souches de g1-HEV dans des cellules cultivées n’ont pas encore été obtenues. Certaines souches de g3- et g4-HEV se développent mieux dans les cellulescultivées 12. Néanmoins, le virus purifié obtenu à partir de cellules transfectées avec l’ARN génomique HEV transcrit in vitro et cappé par p6 n’est pas suffisant pour plusieurs tests. De plus, toutes les particules de HEV produites par culture cellulaire sont quasi-enveloppées, ce qui affecte leur infectiosité. En revanche, le VHE présent dans les aliments et l’eau contaminés n’est pas enveloppé et est hautement contagieux. Le HEV présent dans les excréments des patients est non enveloppé et constitue la source fréquente d’infection naturelle. Par conséquent, l’utilisation de HEV purifié à partir des excréments du patient assure une infection efficace dans le système de culture cellulaire des mammifères. Nos études antérieures ont démontré la fiabilité du g1-HEV purifié par les fèces chez le patient dans la quantification de la réplication virale dans les cellules d’hépatomes humaines (Huh7). Le virus purifié stocké à -80 °C conserve l’infectiosité pendant plusieurs années, et il a été utilisé dans de nombreuses études indépendantes pour estimer la réplicationvirale 10,13,14,15. Cette étude a conçu un test de neutralisation du HEV utilisant un g1-HEV purifié obtenu sur un patient. Le virus a été purifié, titré, caractérisé et stocké en aliquotes à -80 °C pour une utilisation future dans des tests de neutralisation. Parce que le HEV est non cytopathique, la méthode PRNT traditionnelle n’est pas utile pour estimer le potentiel de neutralisation virale des anticorps anti-HEV. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des tests de neutralisation pour le HEV, notamment un test de neutralisation basé sur la cytométrie en flux, un test de neutralisation ELISA en kit antigénique pour détecter le pORF2 sécrété dans les surnageants cellulaires, un test de liaison ELISA in vitro, un test basé sur RT-PCR, et un test de neutralisation basé surla fluorescence 16,17,18,19,20. Un test basé sur ELISA détecte indirectement la liaison des anticorps pour évaluer la neutralisation fonctionnelle du virus, mais ne peut pas mesurer l’infection réelle. La méthode basée sur la cytométrie en flux mesure généralement le pourcentage de cellules infectées utilisant un pseudovirus. La méthode de neutralisation basée sur RT-PCR est plus complexe que la FRNT ; par conséquent, les risques d’erreur de manipulation sont plus élevés. En revanche, la méthode FRNT décrite ici est limitée par la disponibilité de virus infectieux à haut titre et des capacités d’imagerie. Néanmoins, il s’agit d’une méthode efficace pour mesurer NT50 des anticorps anti-HEV.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’approbation du comité d’éthique institutionnelle (IEC) a été obtenue pour prélever un échantillon fécal d’un patient infecté par le VHE admis au Département de Gastroentérologie de l’AIIMS, New Delhi. Un consentement éclairé a été obtenu auprès des patients participant à l’étude. Les détails des réactifs et des équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement et quantification du virus

  1. Avec consentement éclairé, prélever l’échantillon fécal d’un patient infecté par le VHE pour la purification du virus.
  2. Resuspendez l’échantillon fécal dans la solution saline tamponnée phosphate (DPBS) de Dulbecco à 10 % de concentration finale (p/v) et centrifugez à 7800 x g pendant 1 h à 4 °C.
    REMARQUE : Utilisez des gants lors de la manipulation de l’échantillon fécal de HEV, et nettoyez la zone de travail avec 70 % d’éthanol après le travail (effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’un armoire de biosécurité).
  3. Collectez le surnageant et faites-le passer à travers un filtre de 0,45 μm.
  4. Ajoutez 8 % de PEG6000 préparé dans 0,4 M de NaCl au surnageant viral et incubez pendant 16 heures à 0 °C.
  5. Centrifugez l’échantillon à 18 000 x g pendant 30 minutes à 4 °C.
  6. Retirez le surnageant et resuspendez la pastille dans 40 mL de Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco.
  7. Concentrez la suspension à un volume de 5 mL par filtration à flux tangentiel (TFF) à l’aide d’une cartouche à membrane de 30 kDa. Filtrez-le à travers un filtre de 0,2 μm à l’intérieur de l’armoire de biosécurité, fabriquez des aliquotes, et stockez-le à -80 °C. Utilisez une aliquote pour isoler l’ARN total et effectuer la RT-qPCR.
  8. Utiliser plusieurs dilutions du plasmide pSK-HEV2 [vecteur pBluscript contenant l’ADNc d’un clone infectieux de g1-HEV (ID Genbank : AF444002.1)] (1 ng à 0,000001 ng ADN/réaction à dilution sérielle 10x) pour établir un standard de quantification de l’ARN viral.
  9. Tracez le graphique avec la quantité d’ADN pSK-HEV2 sur l’axe X et les valeurs Ct correspondantes sur l’axe Y. Extrapolez la concentration d’ARN viral à partir du graphique standard.
  10. Quantifiez le niveau d’ARN génomique du HEV à partir du graphique standard et calculez le nombre de copies du génome du virus en utilisant la formule suivante : Nombre de copies = ng*(nombre/mole) / bases *(ng/g)*(g/mole de bases).

2. Infection des cellules Huh7 par g1-HEV

  1. Prenez une fiole T75 contenant des cellules Huh7. Vérifiez au microscope si les cellules sont confluentes et saines.
  2. Retirer le milieu par aspirateur (effectuer toutes les étapes dans le cabinet de biosécurité). Ajoutez 10 mL de DPBS, faites tourner en tourbillon, puis retirez.
  3. Ajoutez 1 mL de solution de trypsine à 0,05 %, en veillant à ce qu’elle soit répartie uniformément en surface.
  4. Incubez dans un incubateur àCO-2 pendant 30 à 60 secondes, jusqu’à ce que les cellules soient détachées à 90 %.
  5. Ajoutez 5 mL de milieu complet, étalez-le uniformément sur toute la surface du T75, et pipettez plusieurs fois pour obtenir une population unicellulaire uniforme, sans agrégats.
  6. Transférez la suspension de la cellule dans un tube conique de 50 mL, centrifugez à 200 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
  7. Aspirez le milieu de culture à partir du tube conique à l’intérieur de l’armoire de biosécurité.
  8. Ajoutez 5 mL de milieu complet au tube, puis suspendez les cellules en suspension uniforme par un pipetage délicat.
  9. Prenez 10 μL de suspension de cellules et posez-les sur une glissière de compteur de cellule. Comptez les cellules dans 4 quadrants, calculez la moyenne/mL.
  10. Semez 0,5 x 106 cellules par puits d’une plaque à 6 puits dans 2 mL de DMEM (complétés avec 10 % de FBS).
  11. Le lendemain, retirez le substrat, lavez 1 mL de DPBS, puis ajoutez 50 μL du virus g1-HEV (équivalent à 4,5 × 10copies génometiquesdu g1-HEV purifié) dans 1 mL de milieux sans sérum (SFM).
  12. Incubez les cellules dans un incubateur à 5 % deCO-2 à 37 °C pendant 1 heure.
  13. Lavez les cellules avec 500 μL de DPBS, puis ajoutez 2 mL de milieu complet (DMEM complété par 2 % de FBS).
  14. Incubez les cellules pendant 72 heures dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
  15. Procédez aux tests en aval.

3. Essai RT-qPCR

  1. Retirez le milieu de croissance de la plaque à 6 puits (de l’étape 2.15) et lavez les cellules avec 1 mL de DPBS.
  2. Ajoutez 1 mL de réactif TRI directement sur la plaque à 6 puits pour lyser les cellules. Pipettez le lysat plusieurs fois, puis transférez dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    REMARQUE : Le réactif TRI est toxique s’il est inhalé, avalé ou s’il entre en contact avec la peau. Utilisez des gants protecteurs lors de l’utilisation du réactif et évitez de respirer des vapeurs. De préférence, à utiliser à l’intérieur de la hotte chimique. Tous les plastiques doivent être de qualité sans ARN.
  3. Incubez les échantillons à température ambiante pendant 5 minutes. Ajoutez 0,2 mL de chloroforme, bouchez fermement le tube, puis formez le vortex pendant 10 à 15 s (le chloroforme est dangereux et toxique ; manipulé avec un EPI approprié). Incubez pendant 2 à 3 minutes.
  4. Centrifugez les échantillons pendant 15 minutes à 12 000 × g à 4 °C. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 0,5 mL d’isopropanol à la phase aqueuse, et mélangez bien en inversant le tube plusieurs fois.
  5. Incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
  6. Centrifugez pendant 10 minutes à 12 000 × g à 4 °C. Jetez le surnageant.
  7. Résuspendez la pellete dans 1 mL d’éthanol à 75 %. Centrifugez pendant 5 minutes à 7500 × g à 4 °C. Jetez le surnageant.
  8. Faites sécher la pelote d’ARN à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
  9. Reposez le pellet dans de l’eau sans nucléase (NFW) de 50 μL, incubez à 55 °C pendant 10 minutes, mélangez par tapotage manuel, et mesurez la concentration d’ARN par spectrophotométrie.
  10. Effectuez une RT-qPCR en une étape basée sur une sonde TaqMan en utilisant les amorces suivantes :
    g1-HEV FP : 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′ ;
    g1-HEV RP : 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′ ;
    sonde g1-HEV : 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′ ; Ribonucléase P (RP) FP : 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′ ;
    RP RP : 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′ ;
    Sonde RP : 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG[BHQ1]3′.
  11. Calculez la quantification relative de l’ARN g1-HEV en utilisant la méthode 2−ΔΔCT .

4. Essai d’immunofluorescence (IFA)

  1. Divisez les cellules Huh7 comme décrit dans les étapes précédentes.
  2. Placez la gaine de verre de qualité microscopique dans une plaque à 12 puits et semez 0,2 ×10 6 cellules par puits dans un milieu complet de 1 mL (DMEM complété par 10 % de FBS).
  3. Infecter les cellules avec 1,8 × 10copies du génome 4 du g1-HEV purifié dans 500 μL SFM. Incubez les cellules dans un incubateur à 5 % deCO-2 à 37 °C pendant 1 heure.
  4. Lavez les cellules trois fois avec 500 μL de DPBS.
  5. Ajoutez 2 mL de support complet (DMEM complété par 2 % de FBS).
  6. Incubez les cellules pendant 72 h dans un incubateur à 5 % de CO2 , 37 °C.
  7. Lavez les cellules trois fois avec 500 μL de DPBS, en les incubant pendant 5 minutes à température ambiante entre chaque lavage.
  8. Ajoutez 500 μL de PFA à 4 % (paraformaldéhyde) aux cellules et faites éclore pendant 20 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Le PFA à 4 % est nocif s’il est inhalé, provoque une irritation de la peau et des yeux, et peut provoquer une réaction allergique cutanée. Pour la sécurité, portez des gants de protection et une protection oculaire pendant l’utilisation du réactif et évitez de respirer des vapeurs.
  9. Lavez les cellules avec 500 μL de DPBS, trois fois pendant 5 minutes chacune, puis incubez dans des DPBS pendant 30 minutes.
  10. Ajoutez 250 μL de solution bloqueante (5 % de sérum normal de chèvre, 0,5 % de BSA, 0,3 % de Triton X-100 dans DPBS) aux cellules et incubez pendant 1 heure à température ambiante (RT).
  11. Retirer la solution bloqueante, laver une fois avec 500 μL de DPBS, et incuber les cellules avec 250 μL d’anticorps primaire (DPBS, 0,3 % Triton X-100, 5 % BSA, 0,5 % sérum normal de chèvre, dilution 1:500 de l’anticorps anti-ORF2 ou IgG de lapin), toute la nuit à 4 °C.
  12. Lavez les cellules avec 500 μL de DPBS trois fois pendant 5 minutes chacune.
  13. Incubez les cellules avec un anticorps secondaire (DPBS, 0,3 % Triton X-100, 5 % BSA, 0,5 % sérum normal de chèvre, dilution 1:1000 de l’anticorps anti-lapin Alexa fluor 594) pendant 1 heure au RT.
  14. Lavez les cellules trois fois avec du DPBS pendant 5 minutes chacune. Ajoutez 10 μL de réactif antifade Prolong gold avec une solution DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) sur la lame en verre. Montez les cellules contenant le couverture, avec les cellules orientées vers la solution DAPI sur des lames en verre, évitant ainsi les bulles d’air.
  15. Scellez la couche de couverture avec de la peinture à ongles.
  16. Acquérir des images fluorescentes dans un microscope confocal avec un objectif 60x.
  17. Réglez le microscope pour la visualisation et l’acquisition du signal fluorescent.
  18. D’abord, concentrez les noyaux dans la lame correspondant aux cellules fictives (non infectées) à un grossissement de 60x. Ajustez la tension de seuil et le laser pour qu’aucun signal de fluorescence de fond ne soit visible. Vérifiez la lame témoin colorée à l’anticorps de lapin (IgG de lapin) et vérifiez qu’aucun signal de fluorescence de fond n’est visible.
  19. Visualisez les lames des cellules infectées par le HEV sans modifier les paramètres ci-dessus. Acquiers des images en 1028 x 1028 pixels.

5. Test de neutralisation par réduction de fluorescence (FRNT)

  1. Neutralisation virale et infection des cellules Huh7
    1. Divisez les cellules Huh7 comme décrit dans les étapes précédentes. Placez la gaine de couverture dans une plaque à 12 puits et semez 0,2 × 10cellules de 6 puits dans un milieu complet de 1 mL (DMEM + 10 % FBS).
    2. Le lendemain, préparez une dilution en série 10 fois des anticorps (anti-ORF2 et IgG de lapin) dans la SFM avec une concentration de départ de 25 μg/mL d’anticorps par étapes 1:10 jusqu’àune dilution 1:10 5. Le volume final de la dilution doit être de 100 μL.
    3. Ajouter 1,8 x 104 copies génomiques équivalentes au g1-HEV purifié à chaque dilution d’anticorps.
    4. Incubez le mélange d’anticorps et de virus à 5 % de CO2 , 37 °C pendant 1 heure.
    5. Retirez la plaque à 12 puits contenant les cellules Huh7 (ensemencées la veille) et lavez les cellules avec 500 μL de DPBS.
    6. Ajoutez le mélange anticorps-virus aux cellules et placez la plaque dans un incubateur à 5 % deCO-2 à 37 °C pendant 1 heure.
    7. Lavez les cellules avec 500 μL de DPBS.
    8. Ajoutez du DMEM + 2 % de milieux FBS aux cellules et incubez la plaque dans un incubateur à 5 % CO2 à 37 °C pendant 72 heures.
    9. Effectuez l’IFA comme mentionné à la section 4 (étape 4.7 et suivante).
    10. Acquérir des images fluorescentes de 5 champs aléatoires à l’aide d’un objectif 10x en 1028 x 1028 pixels.
    11. Enregistrez les images au format JPEG/TIFF. Quantifiez les taches fluorescentes à l’aide de l’analyse ImageJ comme décrit ci-dessous.
    12. Pour analyser l’image dans ImageJ, convertissez l’image RVB en une image 8 bits. Cliquez sur l’image > tapez > 8 bits.
    13. Ajustez le seuil de l’image. Cliquez sur l’image > ajustez > seuil. Sélectionnez le seuil inférieur à 40 et le seuil supérieur à 255.
    14. Pour compter, sélectionnez Analyser> Analyser les particules. Sélectionnez les résultats d’affichage, les résultats clairs, résumez, excluez sur les bords et les ROI composites. Désactivez Ajouter au manager, inclure les trous et superposer. Appuyez sur Ok et le nombre de taches fluorescentes apparaîtra.
  2. Estimation du NT50
    1. Calculez le pourcentage de neutralisation de chaque dilution à l’aide de la formule suivante :
      % Neutralisation = 100-[((cellules ORF2-positives en dilution)⁄(cellules ORF2-positives dans le contrôle du virus)) X 100]
    2. Calculez NT50 en utilisant la formule suivante :
      logaritme 10(NT50) =logaritmate 10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (logaritmie 10D2-log10D1)
      Où D1 = dilution à laquelle le % de neutralisation est inférieur à 50
      D2 = Dilution à laquelle % de neutralisation est supérieure à 50
      N1= % Neutralisation inférieure à 50
      N2= % Neutralisation au-dessus de 50
    3. Calculez l’antilog de Log10 NT50 à l’aide de la formule :
      NT50 = 10log10 (NT50)
    4. Tracez le graphique de (moyenne±SD) de tous les champs.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infection des cellules Huh7 avec la caractérisation du g1-HEV et du virus

Le g1-HEV a été isolé à partir d’un échantillon fécal à l’aide d’une série d’étapes, comme illustré (Figure 1A). Le nombre de copies génomiques du g1-HEV purifié a été estimé par RT-qPCR, suivi d’un stockage à -80 °C. Pour confirmer l’infection virale et la réplication, les cellules Huh7 ont été infectées par 1,8 × 10 équivalents de4

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La FRNT est une méthode basée sur l’immunocoloration permettant d’estimer le potentiel de neutralisation des anticorps. Il a été utilisé pour estimer les valeurs de NT50 pour les anticorps contre plusieurs virus, notamment le virus de la dengue (DENV), le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus-2 (SARS-CoV-2) et le virus de l’encéphalite japonaise (JEV)23,24,25. Dans cette métho...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été partiellement financée par une subvention du Biotechnology Industry Research Assistance Council, Département de la biotechnologie, gouvernement de l’Inde, attribuée à MS, S et BN. La recherche au laboratoire de la SEP est soutenue par une subvention principale de l’Institut des sciences et technologies de la santé translationnelle. SA est soutenue par un poste de chercheur de projet financé par le Conseil indien de la recherche médicale, gouvernement indien. L’UB est soutenue par une bourse de recherche senior du Département de biotechnologie du gouvernement indien.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNACustom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

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