Article de méthode

Conception et standardisation d’un modèle de lésion mandibulaire pour l’étude de la régénération des tissus craniofaciaux dans le modèle Ambystoma mexicanum

DOI :

10.3791/69895

⸱

24 avril 2026

 , 
1Departamento de Estudios Básicos Integrados, Facultad de Odontología, Universidad de Antioquia, 2Grupo Genética, Regeneración y Cáncer, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia, 3Instituto de Biología, Universidad de Antioquia

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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L’objectif de cette étude était de standardiser une approche chirurgicale sûre et reproductible pour réaliser une amputation transversale complète de la mandibule chez Ambystoma mexicanum pour l’étude de la régénération des tissus cranio-faciaux.

Résumé

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Le complexe craniofacial est une région anatomique qui, chez l’humain, peut être affectée par des malformations développementales, des traumatismes et des pathologies telles que le cancer, entraînant la perte des tissus affectés. Cela crée un besoin de rechercher des stratégies pour régénérer ces tissus perdus. Cela a favorisé l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires qui orchestrent la réponse régénérative des structures craniofaciales blessées chez les espèces régénérantes, Ambystoma mexicanum (A. mexicanum) étant une espèce d’un grand intérêt.

Conformément à ce qui précède, un modèle chirurgical reproductible de lésion a été conçu et standardisé dans la mâchoire des axolotls pour étudier la réponse régénérative des tissus blessés et simuler un défaut critique comme ceux observés chez l’humain. Ainsi, des animaux juvéniles/adultes âgés de 12-15 cm ont été anesthésés avec 0,1 % de tricaïne pendant 20 à 30 minutes. Par la suite, une amputation transversale complète a été réalisée à quatre mains sur le tiers distal de la mandibule, incluant les régions symphysaire et parasymphysaire, retirant les structures squelettiques correspondant à l’os dentaire et au cartilage de Meckel, ainsi que les tissus mous tels que muscle, tissu conjonctif, nerfs et peau. Par la suite, les restes osseux ont été régularisés et appliqués à 0,5 % de sulfamerazine. La réponse tissulaire a été évaluée à la fois de manière macroscopique et par diaphanisation. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d’expérimentation animale de l’Université d’Antioquia, Colombie. Les résultats montrent que les animaux amputés ont pu régénérer les structures craniofaciales retirées morphologiquement, structurellement et fonctionnellement.

D’une grande importance, ce travail fournit une technique chirurgicale reproductible permettant une survie de 100 % des animaux amputés et réamputés lorsque la collecte de tissus régénérés était nécessaire. Par conséquent, ce plan chirurgical constitue un élément de base pour mener des analyses comparatives avec d’autres vertébrés capables de régénérer des structures craniofaciales et pour étudier à l’avenir les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à cette réponse régénératrice.

Introduction

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La capacité à régénérer les tissus, organes et structures complexes a été largement décrite dans tout le règneanimal 1,2,3. Ainsi, l’intérêt pour comprendre comment ces espèces peuvent activer et réguler la réponse régénératrice après une blessure ou une amputation de diverses structures au sein des appendices, telles que les membres et les queues, a été au centre de l’attention dans l’étude de la biologie de la régénération 4,5,6,7,8.

D’une grande importance pour ce travail, l’étude de la régénération des tissus cranio-faciaux a également suscité un intérêt significatif dans le monde entier, étant donné que cette région anatomique est fortement affectée par les traumatismes faciaux, les troubles du développement cranio-facial, les maladies infectieuses et les pathologies tumorales, y compris le cancerbuccal 9. En présence de tumeurs, l’excision de structures ou de grandes zones tissulaires est nécessaire, soit dans les mâchoires, soit dans d’autres régions faciales, ce qui engendre ensuite la nécessité de reconstruire et de favoriser la réparation de la zoneaffectée 10,11,12. Par conséquent, ces dernières décennies, l’étude de la régénération des tissus craniofaciaux s’est accrue, en raison de la nécessité d’explorer et d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires pouvant améliorer la réponse régénérative de ces tissus chez des espèces à faible capacité régénérative, telles que l’humain13,14. Cela a conduit à l’utilisation de modèles animaux capables de régénérer des structures craniofaciales, telles que la mâchoire, pour explorer et élucider les mécanismes impliqués dans la réponse régénérative après la création de petites lésions ou de défauts critiques sur la mâchoire15.

Des études antérieures sur l’amputation mandibulaire ont mis en lumière la conception de divers types d’approches chirurgicales qui remettent en question la capacité de différentes espèces à régénérer cettestructure 16. Dans le cas du poisson-zèbre, les amputations transversales dans le tiers distal de la mâchoire et les approches latérales de la mâchoire ont révélé une réponse régénératrice dans laquelle le segment amputé est restauré morphologiquementet histologiquement 17,18. D’autre part, des études pionnières sur les amphibiens, telles que Notophthalmus viridescens, ont montré qu’après l’amputation transverse de la mandibule, qui inclut des structures telles que la langue et l’appareil pharyngé dans le plan d’amputation, les tissus perts, y compris l’os dentaire, le tissu musculaire et les dents, peuvent se régénérer. Cependant, la structure linguale et l’appareil pharyngé ne peuvent pas êtrerégénérés 19,20. Néanmoins, lorsque la langue et l’appareil pharyngien ne sont pas inclus dans le plan d’amputation de cette même espèce, tous les tissus régénérés récapitulent la forme et la structure des tissusamputés 21,22. De plus, les amputations transverses chez l’espèce Cynops pyrrhogaster qui n’incluent pas la langue dans le plan d’amputation montrent une réponse régénérative des structures mandibulairesamputées 23. D’autres études montrent que des amputations transverses complètes dans le tiers proximal de la mandibule et les récessions latérales de la mandibule chez des espèces telles qu’Ambystoma maculatum, Desmognathus fuscus, Plethodon cinereus, Eurycea bislineata et Ambystoma opacum favorisent une réponse régénératrice dans le tissublessé 24,25. Cela montre que chez les amphibiens, le succès de la réponse régénérative peut varier selon la conception et l’étendue des tissus impliqués dans le plan d’amputation.

D’autre part, l’une des espèces modèles parmi les amphibiens utilisée comme référence pour étudier les mécanismes sous-jacents à la réponse régénérative est l’amphibien urodélé A. mexicanum 26,27. Des rapports antérieurs ont démontré qu’il s’agit d’un modèle exceptionnel capable de régénérer les structures craniofaciales, y compris les tissus mous du plancher de la bouche, l’os dentaire, le cartilage de Meckel, ainsi que les structures musculaires etdentaires 28,29,30,31. Ces résultats résultent de diverses approches chirurgicales, notamment une blessure par coup de poing au plancher de la bouche, une dentectomie des dents ainsi qu’une partie de l’os dentaire, et une approche plus large caractérisée par l’amputation latérale d’une portion de lamandibule 28,29,30,31. Cependant, à ce jour, aucune approche chirurgicale transverse complète n’a été décrite créant un défaut critique, incluant simultanément la région distale des hémimandibules gauche et droite, ainsi que l’os dentaire, le cartilage de Meckel, la symphyse mandibulaire complète, ainsi que les tissus dentaires et musculaires bilatéralement.

Par conséquent, cet article décrit le processus étape par étape pour réaliser une amputation transversale complète de la mâchoire d’A. mexicanum, ce qui permet de surveiller la réponse régénérative des tissus amputés avec un taux de viabilité de 100 % chez les animaux opérés. De plus, compte tenu du manque de détails sur la manière de réaliser ce type d’amputation, ce guide chirurgical vise à garantir la reproductibilité de ce type d’approche chirurgicale pour tout chercheur envisageant de réaliser des analyses comparatives aux niveaux morphologique, tissulaire, cellulaire et moléculaire chez cette espèce et d’autres exposées à ce même type d’approche chirurgicale, ainsi que d’autres approches, y compris l’amputation latérale de la mandibule. En fin de compte, ce travail fournit une base pour identifier les futures molécules favorisant la réponse régénérative de ces structures, avec des applications potentielles en médecine régénérative des tissus craniofaciaux.

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Protocole

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L’organisme modèle utilisé dans ce projet était la salamandre A. mexicanum, endémique de Xochimilco, au Mexique. Cette colonie d’animaux a été légalement établie en 2014 avec l’importation de salamandres parentes du Ambystoma Genetic Stock Center de l’Université du Kentucky, et compte actuellement 32 parents et plus de 200 juvéniles. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université d’Antioquia (UdeA) en vertu de la loi n° 151 du 27 mars 2023, en tenant compte des normes nationales et internationales d’éthique dans l’expérimentation animale, telles que le chapitre VI de la loi 84 de 1989 et le titre V de la résolution 8430 de 1993 du ministère de la Santé de Colombie32,33.

1. Manipulation des animaux

REMARQUE : Des animaux mesurant environ 12 à 15 cm de long avec un phénotype sauvage ont été utilisés pour standardiser ce protocole. Cependant, les animaux plus petits et ceux présentant d’autres phénotypes ne sont pas exclus.

  1. Certains axolotls sélectionnent environ 12 à 15 cm de long (du museau à la queue).
  2. Placez les axolotls individuellement dans un récipient suffisamment grand pour qu’ils puissent se déplacer facilement, idéalement transparent et rectangulaire.
  3. Maintenez les animaux à une température comprise entre 19 °C et 21 °C dans une solution Holtfreter à 20 % avant la procédure et les cycles clair-obscur (12:12).
    REMARQUE : Dans la mesure du possible, évitez de suralimenter les animaux 24 heures avant la procédure. Cela vise à prévenir les épisodes de vomissements.

2. Amputation transversale complète dans le tiers distal de la mandibule

  1. Préparation de l’anesthésie et pré-chirurgie pour les animaux
    1. Préparez une solution anesthésiante de méthanassulfonate de tricaïne à 0,1 % : mélangez 1 g de méthanassulfonate de tricaïne, 100 μL d’acide éthylédidiaminetétraacétique (EDTA) de 1 M, pH 7,5, 50 μL de 0,5 % de phénol rouge, et préparez jusqu’à 1 L avec une solution de Holtfreter à 40 %. Ajustez le pH à 7,5 avec du NaOH.
    2. Préparez tous les instruments microchirurgicaux stériles (ciseaux, pinces, pinces, spatule 7A, tubes de 1,5 mL, dentimètre, pipette Pasteur, boîte de Petri et un plateau en plastique pour placer ensuite l’animal à opérer).
    3. Nettoyez la zone de travail avec de l’alcool antiseptique à 70 %, ajustez et placez la lumière directe sur le champ chirurgical de manière appropriée.
  2. Anesthésie
    1. Placez l’axolotl dans un récipient contenant environ 500 mL de solution anesthésiante de méthanassulfonate tricaïne à 0,1 % pendant 20 à 30 minutes pour assurer une anesthésie profonde.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’animal est complètement immergé dans la solution anesthésique.
    2. Vérifiez la présence de signes d’anesthésie générale en vérifiant l’absence totale de mouvements branchiales et la réponse aux stimuli tactiles.
      REMARQUE : Pour surveiller la régénération de la mâchoire, une fois l’animal anesthésié, prenez des photographies préopératoires au stéréomicroscope, en suivant les étapes de la section 4.
  3. Amputation transversale complète de la mâchoire
    REMARQUE : L’amputation doit être réalisée avec la plus grande prudence et rapidité possible en utilisant une technique à quatre bras, c’est-à-dire deux chirurgiens.
    1. Placez soigneusement l’animal en position allongée (face visible) sur le plateau en plastique.
    2. Mesurez la région à amputer avec un calipère (mètre dentaire endodontique) depuis le bord externe de la mâchoire vers l’extrémité proximale de cette structure, soit environ 2,5 mm dans la région menton/symphyse (Figure 1A).
      REMARQUE : La mesure avec un étrier est effectuée sur la peau de l’animal (extraoral).
    3. Marquez avec un crayon de cire rouge pour identifier la trajectoire du plan d’amputation et l’étendue du défaut chirurgical.
    4. Soulevez soigneusement l’axolotl et tenez-le fermement d’une main pour que l’animal ne glisse pas hors de la prise de l’opérateur.
      REMARQUE : Cette action doit être réalisée par l’un des opérateurs (opérateur 1), tandis que l’autre opérateur (opérateur 2) sera responsable de la manipulation des instruments chirurgicaux et de la réalisation de l’incision.
    5. Placez une lumière directe au-dessus de la région de la tête de l’axolotl, plus précisément sur la région anatomique à opérer.
    6. De l’autre main, utilisez le côté arrondi et plus large d’une spatule 7A pour séparer la langue du plancher de la bouche et de la région de la mâchoire à opérer. (Figure 1B).
      REMARQUE : Assurez-vous que la langue est légèrement superposée sur la mâchoire supérieure.
    7. D’abord, effectuez (opérateur 2) une coupure initiale avec la pince chirurgicale, du bord extérieur de la mâchoire sur la peau et les tissus durs (os de la dent et cartilage de Meckel) (Figure 1C).
      REMARQUE : Assurez-vous que les instruments sont suffisamment affûtés pour un meilleur contrôle lors de la coupe et de la manipulation des tissus.
    8. Continuez la coupe transversale avec des ciseaux chirurgicaux fins de sorte que l’incision traverse toute la largeur de la mâchoire, du site de la première coupure jusqu’au côté controlatéral, jusqu’à ce que le tissu distal de la mâchoire soit complètement retiré, suivant le plan d’amputation prévu (amputation transversale complète) (Figure 1D).
      REMARQUE : Dans le cas des axolotls plus grands avec des mâchoires plus robustes, il est recommandé de finir le plan de coupe avec des pinces pour une coupe plus propre et moins traumatisante des structures squelettiques (Figure 1E).
    9. Observez la rétraction immédiate des tissus mous restants (Figure 1F).
    10. Prélever le tissu amputé avec des pinces de dissection et l’immerger dans un tube de 1,5 mL avec la solution souhaitée selon la procédure à réaliser : 4 % de paraformoldéhyde (PFA) pour la fixation et l’histotechnologie ou immunofluorescence ultérieure, ou dans du Trizol ou ARN plus tard pour l’extraction d’ARN, d’ADN ou de protéines, entre autres techniques (Figure 1F).
      REMARQUE : Ce tissu peut être utilisé comme un contrôle non régénérant pour la comparaison avec les tissus régénérés d’un point de vue histologique, pour l’expression génique basale ou pour la détection de marqueurs de différenciation finale tissulaire.
    11. Placez l’axolotl dans une boîte de Petri, observez au stéréomicroscope, puis remodelez les bords des os et du cartilage exposés avec une pince.
    12. Replacez soigneusement l’axolotl dans le plateau en plastique et appliquez des bains antibiotiques à 0,5 % de sulfamerazine pendant 12 heures.

3. Récupération postopératoire d’A. mexicanum

  1. Après l’intervention, placez l’axolotl dans un contenant plastique transparent contenant 40 % de solution de Holtfreter et observez les signes de récupération après anesthésie générale, tels que des mouvements branchiaux, un réflexe de redressement ou une réponse aux stimuli tactiles. La récupération complète prend environ 30 à 60 minutes.
    REMARQUE : Conservez la solution Holtfreter à 40 % froide, à une température comprise entre environ 4 °C et 8 °C.
  2. Changez la solution froide de Holtfreter à 40 % toutes les 24 heures pendant au moins 8 jours.
    REMARQUE : Les 48 premières heures sont les plus critiques dans la récupération de l’animal, il doit donc être observé quotidiennement.
  3. Après 24 à 48 heures après la procédure, donnez à l’axolotl une nourriture à texture molle qui est plus facile à attraper et moins traumatisante pour l’animal.
    REMARQUE : Ne nourrissez pas l’axolotl pendant les 24 premières heures suivant l’opération.

4. Acquisition d’images et surveillance de la réponse régénérative

REMARQUE : Toutes les images doivent être prises le plus rapidement possible afin d’éviter une manipulation prolongée de l’animal récemment opéré.

  1. Une fois l’animal complètement anesthésié, soulevez-le soigneusement et emmenez-le au stéréomicroscope et à l’appareil photo numérique dans une boîte de Petri pour obtenir des images avant et après amputation.
    REMARQUE : Nettoyez et désinfectez le stéréomicroscope avec 70 % d’alcool au préalable.
  2. Utilisez une lumière incidente pointant vers la tête de l’axolotl pour mieux observer la zone de la mâchoire.
  3. Tenez fermement le corps de l’axolotl d’une main pour éviter qu’il ne glisse hors du champ d’acquisition de l’image.
    REMARQUE : Évitez de prendre des photos dans un milieu aqueux pour éviter toute distorsion de la taille réelle ; utilisez une boîte de Petri sans liquide. Humidifiez légèrement l’axolotl de temps en temps avec une solution de Holtfreter à 40 %.
  4. Identifiez correctement la zone de la mâchoire et concentrez-vous dessus de manière appropriée.
    REMARQUE : Pour les jours qui suivent (suivi) l’intervention, gardez à l’esprit la nécessité d’une bonne concentration, car la régénération des tissus aux premiers stades est souvent très subtile et, dans certains cas, imperceptible.
  5. Optimisez les paramètres d’acquisition d’image en ajustant les outils du programme (contraste, luminosité, exposition, gain, balance des blancs, etc.).
  6. Acquérir des images à l’aide d’un stéréomicroscope (0,7x) pour prendre des mesures et surveiller la régénération de la structure.
  7. Une fois la période de régénération terminée, les tissus régénérés ont été colorés avec du bleu d’alcian et du rouge d’alizarine selon le protocole34 précédemment rapporté.

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Résultats

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Compte tenu de l’importance et de la pertinence de l’étude de la réponse régénérative potentielle post-amputation des structures craniofaciales chez des espèces telles qu’A. mexicanum29, il est nécessaire de disposer d’une technique chirurgicale sûre et reproductible permettant non seulement d’évaluer la réponse régénérative des tissus, mais aussi d’offrir un taux de mortalité faible ou nul chez les animaux subis à la chirurgie. Par conséquent, cette étud...

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Discussion

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Cet article présente l’approche chirurgicale réussie pour l’amputation transverse complète de la mandibule dans le modèle animal d’A. mexicanum , ainsi que plusieurs recommandations nécessaires pour reproduire ce modèle chirurgical afin de surveiller la réponse régénérative de ces structures et l’identification potentielle des facteurs régulant ce processus régénératif.

Dans cette étude, une amputation transverse complète a été réalisée sur le tiers d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

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Nous tenons à remercier le Vice-Recteur à la Recherche de l’Université d’Antioquia pour les ressources fournies par le fonds pour le premier projet destiné aux enseignants affiliés. Nous tenons à remercier le Sistema General de Regalias de Colombia et le 15e appel à bourses de l’Université d’Antioquia pour le financement du master de Samanta Tarquino. Enfin, nous souhaitons également remercier chacun des étudiants qui participent à la prise en charge de la colonie d’axolotls dans notre laboratoire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Axolotl (Ambystoma mexicanum)Centre de stocks génétiques AmbystomaN/A15-18 cm et 16 g - 22 g de type sauvage
Chlorure de calcium dihydrateDuksan1098CaCl2 2H2O
Appareil photo numérique MotiCAM 5MotiCAM https://www.motic.com/upload/File/201407/2014071115335993.pdf
EDTA - Sel de sodium, dihydrateBiobasicEB0185C10H14N2O8Na2 . H2O
Plaques de Petri en verren'importe quel fabricantN/AVerre borosilicaté
Sulfate de magnésium 7-hydrateITW Reagents131404.1211MgSO4 7H2O
Instruments de microchirurgieN/AN/APinces, pince à bec, spatule 7A, demi-pouce et ciseaux
Pipette Pasteurn'importe quel fabricantN/APolyéthylène basse densité
Chlorure de potassiumDuksan372KCl
Crayon de cire rougen'importe quel fabricantN/A
Chlorure de sodiumMerkK48297604 717NaCl
Logiciel Motic Images Plus-Versión 2.0Motic https://www.motic.com/As_Support_Download/d42.html
Microscope stéréoOlympus SZX16 N/A
Sulfamérazine sodiumSigma- AldrichS08004-Amino-N-(4-méthyl-2-pyrimidinyl) benzènesulfonamide
Méthanesulfonate de tricaïneSigma- AldrichE10521Méthanesulfonate d'éthyl 3-aminobenzoate
Tubes de 1,5 mLAxygenMCT150CPolypropylène pur

Références

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Mots-clés

R g n ration craniofacialeMod le de l sion chirurgicaleAmputation de la m choireR g n ration squelettiqueStructures craniofacialesR ponse r g n ratriceR g n ration comparative

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