Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement, la purification et la culture des cellules marginales primaires à partir de la strie vasculaire de la souris, ainsi que pour établir des modèles in vitro du stress oxydatif et de la sénescence cellulaire afin d’étudier les troubles de la paroi latérale cochléaire.
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Article de méthode
Isolement et culture des cellules marginales primaires de la strie vasculaire à partir de souris néonatales
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La strie vasculaire est une structure clé de l’oreille interne responsable de la génération et du maintien du potentiel endocochléaire (EP), et son dysfonctionnement est étroitement associé à diverses formes de perte auditive. La strie vasculaire est composée de cellules marginales, de cellules intermédiaires et de cellules basales, parmi lesquelles les cellules marginales jouent un rôle central dans la génération et le maintien de la PE. Par conséquent, établir un modèle de culture primaire in vitro des cellules marginales est essentiel pour étudier les caractéristiques biologiques de la strie vasculaire et son implication dans les troubles liés à la perte auditive.
Dans cette étude, nous avons réussi à isoler et à cultiver des cellules marginales primaires à partir de la strie vasculaire de souris néonatales. Les tissus de tension ont été obtenus par microdissection, digérés avec de la collagénase de type II, puis purifiés par un blindage différentiel pour éliminer la plupart des fibroblastes, les cellules cultivées atteignant plus de 80 % de confluence au septième jour. La coloration par immunofluorescence a démontré une expression stable de la cytokératine 18 (CK18) et du membre 1 de la sous-famille des canaux voltage-dépendants du potassium (KCNQ1), confirmant ainsi une isolation réussie, une haute pureté et la préservation de la fonction physiologique des cellules marginales.
Sur la base de ce modèle, des modèles in vitro de stress oxydatif et de sénescence cellulaire ont été établis à l’aide de peroxyde d’hydrogène (H2O2) et de D-galactose, respectivement. Les cellules traitées ont montré des niveaux d’espèces réactives d’oxygène intracellulaires (ROS) significativement accrus et une positivité β-galactosidase (SA-β-gal) associée à la sénescence, indiquant une forte sensibilité des cellules marginales primaires au stress oxydatif et aux stimuli inducteurs de sénescence. Collectivement, cette étude établit un système stable et reproductible pour la culture et la modélisation des cellules marginales primaires de la souris, fournissant une plateforme in vitro fiable pour étudier le dysfonctionnement de la strie vasculaire et les mécanismes associés.
Introduction
Dans le système auditif, divers tissus de la cochlée travaillent ensemble pour convertir des ondes sonores complexes en signauxélectriques 1. La strie vasculaire régule la composition ionique de l’endolymphe et génère le potentiel endo-cochléaire (EP), maintenant ainsi l’homéostasie cochléaire et assurant le fonctionnement normal des cellules ciliées internes et externes. Il est composé de trois types cellulaires distincts : les cellules marginales, les cellules intermédiaires et les cellules basales. Les cellules marginales forment une monocouche épithéliale polarisée qui fait directement face à l’endolymphe et est scellée par des jonctions serrées. La membrane basolatérale des cellules marginales est enrichie par deux transporteurs clés de potassium, Na⁺/K⁺-ATPase et NKCC1, qui régulent le transport des ions sodium et potassium dans la strie vasculaire. La fonction de la Na⁺/K⁺-ATPase a été démontrée comme étant directement associée à l’EP 2,3. Les canaux K⁺ KCNQ1/KCNE1 sont situés à la membrane apicale des cellules marginales et génèrent un potentiel de diffusion K⁺ supplémentaire qui contribue à la formation de l’EP4. Les cellules marginales sont enrichies en plusieurs protéines liées au potassium et servent d’unité cellulaire centrale qui stimule le recyclage du potassium dans l’endolymphe cochléaire. Ainsi, les cellules marginales sont les cellules clés responsables de la génération et du maintien de la EP.
La strie vasculaire (SV) a démontré un rôle crucial dans la pathogenèse de multiples troubles associés à la perte auditive sensorieneurale (NHL), notamment la perte auditive liée à l’âge (ARHL), la perte auditive induite par le bruit (NIHL), la perte auditive héréditaire (HHL) et la perte auditive induite par des médicaments (DIHL). De plus, plusieurs autres troubles de l’audition, tels que la maladie auto-immune de l’oreille interne (IDA), la maladie auto-inflammatoire de l’oreille interne (DIA) et la maladie de Ménière (DM), bien que distincts étiologiquement, ont également été démontrés par des études récentes impliquant le SV dans ses mécanismes pathogènessous-jacents 5,6. Par conséquent, il est essentiel d’établir des modèles cellulaires fiables pour étudier la pathogenèse de la perte auditive. Des études ont démontré que la réduction de la densité cellulaire marginale agit comme un fort prédicteur de l’EP tout au long de la vie murine, tandis que l’atrophie de la strie vasculaire représente une lésion caractéristique précoce dansARHL 7,8. La culture in vitro de cellules marginales peut fournir un modèle fiable pour étudier la pathogenèse de l’ARHL et explorer des cibles thérapeutiques potentielles. Au-delà de l’ARHL, des études récentes ont révélé une forte corrélation et une possible relation sous-jacente entre la strie vasculaire et d’autres troubles auditifs, suggérant que les modèles in vitro des cellules marginales pourraient avoir des applications pluslarges 5,9,10.
Cette étude décrit un protocole pour la dissection et la culture de la strie vasculaire à partir des cochlées de souris néonatales, suivies de la purification des cellules marginales à l’aide de plaques différentielles, fournissant ainsi un modèle cellulaire fiable pour la recherche sur les pathologies liées à la strie vasculaire.
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Protocole
Les petits souris nouveau-nés (P0-3) ont été fournis par Biont. Toutes les procédures expérimentales étaient conformes aux Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publiées par les National Institutes of Health des États-Unis (publication NIH, révisée en 2011) et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Renmin de l’Université de Wuhan (WDRM202400019).
1. Stérilisation et préparation des matériaux
- Préparez les outils de dissection, y compris deux paires de pinces de micro-dissection, une paire de pinces standard, une paire de ciseaux chirurgicaux et une paire de ciseaux de micro-dissection. Stérilisez tous les outils à l’aide d’un autoclave et séchez dans un four à 60 °C pendant 4 heures.
- Préparez 100 mL de milieu à cellules épithéliales pour animaux (EpiCM-a medium) selon les instructions du fabricant. Ajouter du sérum bovin fœtal (FBS), un complément de croissance des cellules épithéliales (EpiCGS-a) et une solution de pénicilline/streptomycine au milieu basal pour obtenir des concentrations finales de 2 % de FBS, 1 % d’EpiCGS-a et 1 % de pénicilline/streptomycine.
- Désinfectez l’étage stéréomicroscopique et le boîtier avec 75 % d’éthanol. Ensuite, placez les outils de dissection autoclavée et le microscope désinfecté dans une armoire de sécurité biologique. Exposez tous les objets à la lumière UV pendant 30 minutes pour assurer une stérilité complète avant d’entamer la procédure de dissection.
2. Dissection et isolement de l’os temporal pour la collecte de l’épithélium auditif
- Euthanasiez les petits souris nouveau-nés (P0-3) après anesthésie à l’isoflurane à 4 %, désinfectez avec 75 % d’éthanol et effectuez la décapitation sur glace. Utilisez d’autres méthodes éthiquement approuvées si nécessaire.
- Immobilisez la tête, ouvrez le cuir chevelu le long de la suture sagittale à l’aide de ciseaux de micro-dissection, séparez le cuir chevelu bilatéralement, puis excisez-le.
- Coupez la tête de la souris nouveau-née le long de la ligne médiane à l’aide de ciseaux de micro-dissection. Retirer le tissu cérébral à l’aide de pinces pour exposer les os temporaux (Figure 1A).
- Observez les os temporaux bilatéraux à la base crânienne, retirez d’autres os inutiles et conservez le tissu osseux temporal contenant la cochlée (Figure 1B).
- Transférez un os temporal dans une plaque stérile de 35 mm contenant de la solution salée équilibrée Hank’s (HBSS) fraîche sur glace.
- Transférez l’autre os temporal sous le microscope, sécurisez le tissu osseux temporal avec une paire de pinces, puis utilisez une autre paire pour effectuer une dissection contondante du tissu musculaire de surface jusqu’à ce que l’anneau ossiculaire blanc semi-circulaire soit visible (Figure 1C). Après confirmation du positionnement cochléaire, poursuivre la dissection contondante vers le bas jusqu’à ce qu’un tissu cochléaire translucide soit observé (Figure 1D).
REMARQUE : Les étapes 2.6-2.7 doivent être effectuées sur la glace. - À l’aide de pinces de microdissection, retirez soigneusement un petit morceau de la paroi osseuse à l’extrémité apicale de la cochlée, insérez délicatement un côté de la pince dans la cochlée, puis séparez la paroi osseuse du labyrinthe membraneux. Retirez la paroi osseuse et prolongez le tissu labyrinthique membraneux dans une solution selle équilibrée de Hank (HBSS) fraîche (Figure 1E).
- Sécuriser la membrane basilaire avec une paire de pinces, puis séparer soigneusement la strie vasculaire avec une autre paire de pinces. Transférez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 1 mL de solution de collagénase de type II à 1 mg/mL posée sur de la glace (Figure 1F).
- Répétez les étapes ci-dessus pour prélever la strie vasculaire de l’autre côté.
3. Disagrégation enzymatique pour obtenir des cellules marginales de la strie vasculaire
- Incubez le tube de microcentrifuge contenant le tissu prélevé dans une solution de collagénase de type II à 1 mg/mL à 37 °C pendant 30 minutes.
REMARQUE : La solution de collagénase de type II a été préparée en diluant la collagénase de type II dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS ; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mMNa 2HPO 4). - Centrifugez le tube à 300 × g pendant 8 minutes.
- Retirez soigneusement le surnageant. Ajoutez 1 mL de milieu de culture pour terminer la digestion, triturez doucement pour resuspendre les cellules, puis centrifugez à nouveau à 300 × g pendant 8 minutes.
- Aspirez le surnageant et ajoutez 1 mL de substrat de culture frais. Triturez pour obtenir une suspension monocellule, transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL, puis ajoutez un milieu supplémentaire pour ajuster le volume total à 10 mL.
- Mélangez soigneusement la suspension à cellules par pipetage répété, puis transférez 1 mL de la suspension dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Cultivez les cellules dans 2 mL de DMEM complétés avec 2 % de FBS, 1 % d’EpiCGS-a et 1 % de solution de pénicilline/streptomycine à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO-2 .
- Remplacez le support quotidiennement et surveillez l’état des cellules. La croissance en grappe des cellules marginales peut généralement être observée 2 jours après le plaquetage.
4. Purification des cellules marginales
- Au troisième jour de culture, observez l’apparition de nombreux fibroblastes en forme de fuseau entourant les groupes de cellules marginales en forme de pavés (Figure 2B).
- En exploitant les différences de taux d’adhérence, pipetez doucement pour retirer partiellement les fibroblastes en forme de fuseau. À l’aide d’une pipette de 1 mL, rincez doucement la solution salée équilibrée de D-Hanks sur de grandes surfaces dans chacun des quatre quadrants. Surveillez la purification cellulaire au microscope et ajustez la force et la direction de la pipette en conséquence. En général, un rinçage sur une grande surface est effectué deux fois. Après chaque cycle, examinez la densité des fibroblastes au micro ; Sur la base de ces observations, appliquez une pipetage doux localisée sur des zones densément peuplées de fibroblastes afin d’obtenir une distribution clairsemée et uniforme à travers la boîte de culture.
REMARQUE : Une densité appropriée de fibroblastes a été conservée, car un retrait complet ou une purification excessive peuvent limiter la croissance des cellules primaires. Nous recommandons de maintenir un ratio approximatif de 2:1 entre cellules marginales et fibroblastes. - Cesser la purification lorsque les fibroblastes apparaissent faiblement répartis parmi des groupes cellulaires marginaux sous examen microscopique. Retirez le surnageant et ajoutez 2 mL de substrat frais pour la culture afin de continuer la culture.
5. Coloration par immunofluorescence
- Le deuxième jour après la purification, examinez la morphologie cellulaire au microscope. Lors de l’observation d’une formation adéquate de groupes cellulaires et d’une densité appropriée, aspirez le milieu de culture et lavez les cellules trois fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS, pH 7,4).
- Fixez les cellules avec 4 % de paraformoldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir retiré la solution fixative, lavez les cellules trois fois avec du PBS (5 min par lavage).
- Perméabiliser les cellules avec 0,5 % de Triton X-100 pendant 15 minutes. Retirez la solution et lavez les cellules trois fois avec du PBS (5 min par lavage).
- Bloquez les cellules avec du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre pendant 30 minutes à température ambiante.
- Incuber les cellules avec l’anticorps monoclonal anti-souris CK18 (dilué à 1:300 dans un PBS contenant 3 % de sérum de chèvre) ou l’anticorps KCNQ1 (G-8) (dilué à 1:100 dans un PBS contenant 3 % de sérum de chèvre) pendant la nuit à 4 °C.
- Laver les cellules trois fois avec PBS (10 min par lavage). Incubez avec l’anticorps secondaire correspondant (dilué à 1:300 dans un PBS contenant 3 % de sérum de chèvre) pendant 1 h à température ambiante.
- Retirez les anticorps secondaires et lavez les cellules trois fois avec PBS (10 min par lavage).
- Appliquez 1 à 2 gouttes de support antifade contenant du DAPI sur les lames, montez les couverdisses, et examinez les échantillons à l’aide d’un système de balayage laser confocal.
REMARQUE : À l’exception des étapes de lavage, toutes les solutions d’incubation, y compris les anticorps, ont été ajoutées en volumes suffisants pour recouvrir complètement les cellules.
6. Traitement H2O 2 et coloration ROS
- Après 7 jours de culture, lorsque les cellules marginales ont formé une monocouche confluente, induisez un stress oxydatif par traitement avec 1 mMH2O2. Préparez la solution de travail de 1 mM en diluant la solution stock à 30 %H2O2 1:10000 dans un milieu cellulaire épithélial. Incubez les groupes expérimentaux avec cette solution de travail, tout en traitant les groupes témoins avec un seul milieu cellulaire épithélial.
- Après 16 heures de traitement, retirez soigneusement le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Évaluer les niveaux de ROS intracellulaires dans les cellules marginales à l’aide d’un kit de test d’espèces réactives en oxygène selon le protocole du fabricant.
- Retirez le milieu de culture, puis ajoutez du MitoTracker Red CMXRos dilué (un colorant sélectif des mitochondries) et du DCFH-DA aux cellules, puis incubez à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes.
- Lavez les cellules trois fois avec du PBS (5 min chacun), montez les cache-couvertures, et observez les échantillons à l’aide d’un microscope laser confocal à balayage.
7. Traitement au D-galactose et coloration SA-β-gal
- Après 7 jours de culture, lorsque les cellules marginales forment une monocouche confluente, la poudre de D-galactose a été dissoute dans un milieu EpiCM-a pour préparer une solution de travail de 40 mg/mL de D-gal. Incuber des groupes expérimentaux avec cette solution (2 mL par puits d’une plaque à 6 puits, 48 h, à 37 °C) pour induire la sénescence cellulaire, tout en traitant les groupes témoins avec le même volume de milieu Epi.
- Après 48 heures de traitement, retirez soigneusement le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Évaluez la sénescence cellulaire dans les cellules marginales à l’aide du kit de coloration SA-β-gal selon les instructions du fabricant.
- Fixez les cellules avec une solution fixative pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le fixateur, lavez les cellules trois fois avec du PBS (5 minutes par lavage).
- Incubez les cellules avec une solution de travail de coloration SA-β-gal contenant 5 % de X-Gal (1 mL par puits d’une plaque à 6 puits) toute la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié sans CO2.
- Capturez des images de coloration SA-β-gal sous éclairage en champ clair à l’aide d’un microscope.
8. Analyse statistique
- Pour comparer les groupes traités à H₂O₂ et témoins concernant l’intensité moyenne d’immunofluorescence de la coloration ROS, et entre les groupes témoins et traités au D-galactose concernant la proportion de cellules positives à β gal SA, appliquer des tests t après évaluations de normalité et de log-normalité.
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Résultats
Croissance et caractéristiques morphologiques des cellules cultivées
Grâce à ce protocole, nous avons établi avec succès des cultures primaires de cellules marginales isolées de la cochlée murine. Le deuxième jour de culture, la microscopie optique a révélé que les cellules avaient adhéré au substrat et commençaient à former des colonies en grappe (Figure 2Aa). Le troisième jour, nous avons purifié les cellules (Figur...
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Discussion
Depuis des décennies, la recherche sur la perte auditive se concentre principalement sur le rôle des cellules ciliées sensorielles et de leurs connexions synaptiques avec les neurones des ganglionsspirales 11. De nombreuses études publiées ont été consacrées à l’établissement et à l’optimisation de modèles de culture in vitro des cellules ciliées, qui ont joué un rôle indispensable dans l’étude des dommages aux cellules ciliées, de la régénération et des ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs affirment que la recherche ne présente aucun conflit d’intérêts commercial ou financier.
Remerciements
Nous exprimons notre gratitude au Département d’Oto-rhino-Laryngologie-Chirurgie de la Tête et du Cou, de l’Hôpital Renmin de l’Université de Wuhan (Wuhan, Chine) et à l’Institut de Recherche en Oto-rhino-Laryngologie-Chirurgie de la Tête et du Cou, Hôpital Renmin de l’Université de Wuhan (Wuhan, Chine) pour leur généreux soutien et leur encouragement. Ce travail a été soutenu par la Fondation de Construction et d’Incubation des Centres du Service National de Santé de Chine (ZX0000000037), la Fondation Nationale des Sciences Naturelles de Chine (81700916, 82301294), la Fondation des Sciences Naturelles de la province du Hubei (2017CFB242) et le Projet de Recherche Scientifique de la Commission de la Santé de la Province du Hubei (WJ2017Q005).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube centrifuge de 15 mL | Servicebio | EP-1501-J | Utilisation pour la culture |
| Plat de culture cellulaire de 35 mm | NEST | 706001 | Utilisation pour la dissection |
| 4 % de paraformaldéhyde | Servicebio | G1101 | Coloration immunofluorescente |
| Plaque à 6 puits | Servicebio | CCP-6H | Utilisation pour la culture |
| Anticorps anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488 | Proteintech | SA00013-2 | Coloration immunofluorescente |
| Milieu de montage antifade avec DAPI | Absine | abs9235 | Coloration immunofluorescente |
| Kit de comptage cellulaire-8 | Beyotime | C0037 | utilisation pour le comptage de cellules |
| Colagnase de type II | Biosharp | BS164 | Utilisation pour la culture |
| Système de balayage laser confocal | Olympus ; | FV1200 | Coloration immunofluorescente |
| DCFH-DA | Invitrogen | C2938 | Coloration ROS |
| D-gal | Solarbio | D8310 | Utilisation pour la modélisation cellulaire |
| EpiCM-a Medium | Sciencell | 4131 | Utilisation pour la culture |
| Pinces fines | Propulsion | F11020-11 | Utilisation pour la dissection |
| Sérum de chèvre | Beyotime | C0265 | Coloration immunofluorescente |
| H2O2 | Mkbio | MM0707 | Utilisation pour la modélisation cellulaire |
| La solution salée équilibrée de Hank (HBSS) | Biosharp | BL561A | Utilisation pour la culture |
| Isoflurane | Propulsion | R510-22-10 | Utilisation pour la dissection |
| Anticorps KCNQ1 (G-8) | Santa Cruz | SC-365186 | Coloration immunofluorescente |
| Microscope | Olympus ; | SZX7-1063 | Utilisation pour la dissection |
| Microscope | Olympus ; | IX71 | Utilisé pour observer les résultats de la coloration par immunofluorescence |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | Coloration ROS |
| Petits souris néonatales (P0-P3) | fourni par BIONT | ||
| PBS | Servicebio | G4202 | Coloration immunofluorescente |
| Anticorps monoclonal anti-souris CK18 du lapin | Proteintech | 10830-1-AP | Coloration immunofluorescente |
| Kit de coloration sénescence &beta ;-Galactosidase | Beyotime | C0602 | Coloration vieillissante |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Coloration immunofluorescente |
Références
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Réimpressions et autorisations
