Patchs à microaiguilles dissolvables fabriqués par la technique de moulage au solvant et caractérisation essentielle des dispositifs biomédicaux à microaiguilles

Résumé

Le présent travail vise à servir de guide pratique permettant aux chercheurs de préparer leurs propres dispositifs DMAP en utilisant la méthode de moulage par solvant, également appelée micromoulage, et d’effectuer une caractérisation de base.

Résumé

La technologie basée sur les microaiguilles a révolutionné le domaine de la recherche sur la peau et la délivrance transdermique et est aujourd’hui considérée comme l’approche la plus simple pour administrer des médicaments par la peau. Le succès des patchs à réseau microaiguille (MAPs) est principalement dû à leur capacité à neutraliser la fonction de barrière cutanée qui empêche l’entrée des médicaments appliqués localement en perceant sans douleur la couche cornée . Les MAP dissolvables (DMAP) se distinguent des autres types de dispositifs basés sur les MAP en raison de la biocompatibilité de leurs matériaux constitutifs, de la possibilité d’auto-administration par les patients et de l’absence de déchets pointus générés après utilisation. Les DMAP sont généralement fabriqués à partir de matériaux polymères qui se redispersent lors de l’insertion dans la peau lorsqu’ils sont en contact avec des fluides interstitiels, libérant ainsi leur cargaison. Au niveau de l’établi, les DMAP sont couramment fabriqués selon la méthode de coulée par solvant, qui consiste à utiliser des moules maîtres négatifs de la forme et de la longueur MAP souhaitées, sur lesquels des dispersions polymériques chargées en médicament sont coulées. Ils sont ensuite forcés de remplir les cavités du moule par l’application d’une force centrifuge ou d’une pression positive. Après séchage, les DMAP deviennent solides et se décollent des moules maîtres, et ils subissent régulièrement diverses études de caractérisation avant utilisation. Ces tests comprennent généralement l’étude des propriétés mécaniques des DMAP, la détermination de la teneur résiduelle en eau, la capacité ex vivo à pénétrer la structure cutanée, la performance de libération du médicament et l’évaluation in vitro de la biocompatibilité.

Introduction

Bien que l’administration topique et transdermique de substances pharmacologiquement actives à travers et dans la peau soit considérée comme une alternative prometteuse à l’administration orale, elle présente des défis importants en raison de la fonction naturelle de barrière cutanée exercée par la couche du stratum cornéen . Cette limitation touche particulièrement les grosses molécules, en particulier celles dont le poids moléculaire est >500 Da¹. De plus, la diffusion passive à travers la peau d’autres molécules ayant des propriétés physicochimiques spécifiques, telles que l’hydrophilicitie notable ou la lipophilicitat, est également restreinte. Différentes stratégies technologiques ont été proposées pour surmonter cette barrière, notamment l’iontophorèse, la sonophorèse, l’électroporation, l’utilisation d’amplificateurs chimiques, les méthodes thermiques et les systèmes nanométriques. Néanmoins, les patchs à microaiguilles (MAP) se distinguent parmi eux par plusieurs avantages : une efficacité extrême pour neutraliser la fonction du stratum corneum , un rapport qualité-prix, une expérience indolore pour les patients, et la possibilité d’auto-administration sans besoin de personnel^{médical 2}.

Les MAP sont des dispositifs contenant des projections en forme d’aiguille de taille microscopique qui percent la couche cornique et contournent la barrière épidermique. Plusieurs types de MAPs sont décrits dans la littérature, à savoir : les MAP solides, revêtues, dissolvantes, gonflantes et creuses. Les MAP dissolvables (DMAP) sont composés de matériaux polymériques solubles dans l’eau et utilisent une stratégie de « piquer et relâcher », ce qui explique leurs caractéristiques plus intéressantes. En particulier, ils se dissolvent lors de leur insertion dans la structure cutanée lorsqu’ils sont en contact avec des fluides interstitiels, libérant ainsi leur contenu. Comparée à la stratégie « piquer et patcher » utilisée par les PAM solides, où elles sont utilisées pour créer des microcanaux dans la structure cutanée permettant le passage d’une^{formulation 3,4} appliquée localement ^{par la} suite, l’approche « piquer et relâcher » n’est pas soumise au temps où les microcanaux restent ouverts. La stratégie « poke and flow » nécessite la préparation de cartes cartographiques creuses, dont l’architecture est nettement plus complexe et difficile à fabriquer. Un avantage supplémentaire des DMAP est qu’ils ne génèrent pas de déchets tranchants après application, réduisant ainsi le risque de blessures par piqûre d’aiguille et de contamination biologique. De plus, leur application simple et peu invasive permet une auto-administration potentielle par les patients, soutenant leur utilisation dans des environnements à ressources limitées ou géographiquement éloignés où l’accès à un personnel de santé formé, à l’infrastructure médicale et à des systèmes sûrs d’élimination des objets tranchants est^{limité 2}. La communauté scientifique axée sur l’administration de médicaments dermiques et transdermiques s’est de plus en plus tournée vers la technologie MAP, en particulier les DMAP, pour surmonter les limites des stratégies mentionnées précédemment. Bien que la première publication sur les MAPs remonte aux années 1980, la technologie a connu un essor majeur au début des années 2000. Depuis, le nombre de publications a augmenté de façon exponentielle, atteignant aujourd’hui environ 500 articles par^{an, soit 5}.

Les DMAP sont généralement fabriqués par la méthode de coulée par solvant ou^{micromoulage 6}. Cette technique de fabrication repose sur l’utilisation de moules maîtres négatifs de la forme et de la longueur des MAP souhaitées. Après avoir coulé des dispersions polymériques chargées de médicaments ou même de systèmes nanométriques, une force externe est appliquée pour remplir les cavités en forme de micro-aiguille du moule maître. Une fois séchés, les DMAP peuvent être démoulés soigneusement en les décollant ou en dissolvant le moule maître avec un agent chimique. Ces moules maîtres sont fabriqués à partir de matériaux différents, le polydiméthylsiloxane (PDMS) étant le plus courant, grâce à sa flexibilité et sa faible adhérence, ce qui facilite le démoulage des DMAP. La préparation des moules maîtres est généralement réalisée par des méthodes lithographiques ; cependant, des moules PDMS commerciaux de différentes formes, longueurs et densités de microaiguilles sont désormais disponibles.

Ici, une directive pour la préparation des DMAP utilisant la technique de coulée par solvant est fournie. Dans ce cas, le procédé est réalisé en utilisant la force centrifuge ou l’application d’une pression positive. Cela permet une alternative à un protocole à coût efficace aux méthodes de fabrication coûteuses de dispositifs biomédicaux basés sur les MAP, permettant à un groupe plus large de chercheurs d’intégrer les MAP dans leurs travaux de recherche sur la peau. De plus, la caractérisation essentielle pour des fins académiques et de recherche fondamentale qui précède les tests in vivo inclut la longueur et la géométrie de l’aiguille, la résistance mécanique à la compression, la performance d’insertion ex vivo, la charge et la libération du médicament, la teneur en eau résiduelle, la stabilité, l’absorption ex vivo des médicaments et le profil de sécurité in vitro .

Protocole

Les réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Fabrication de réseaux de microaiguilles dissolvables par centrifugation

1. Préparez la dispersion colloïdale aqueuse des matériaux constitutifs des DMAP en les dissolvant dans la quantité d’eau appropriée et en remuant vigoureusement. Selon les polymères sélectionnés et la concentration, le temps de dispersion peut varier. Si nécessaire, réchauffez l’eau modérément (40-45 °C) pour faciliter la dispersion du polymère.
   REMARQUE : Les polymères les plus couramment utilisés pour préparer les DMAP sont le poly(pyrroldone vinyle) (PVP), la gomme karaya, l’acide hyaluronique (HA), le poly(méthyl éther éther alt-maléique) (PMVE-MA), le poly(alcool vinylique) (PVA), la carboxyméthyl cellulose (CMC), la chitosan, etc., cependant, tout autre matériau hydrosoluble aux propriétés optimales peut être utilisé. Pour la plupart des formulations, la concentration de travail typique varie de 5 % à 30 % en mousse par mois. Des concentrations plus faibles produisent généralement des DMAP à dissolution rapide, tandis que des concentrations plus élevées produisent des dispositifs à dissolution lente. Cependant, la concentration optimale doit être déterminée empiriquement en préparant différents prototypes DMAP, car elle dépend du poids moléculaire du polymère, de sa viscosité et des propriétés mécaniques souhaitées des microaiguilles.
2. Laissez les polymères remuer au minimum pendant la nuit pour obtenir une dispersion complète, tout en permettant d’éliminer les bulles d’air.
3. Centrifugez la dispersion polymérique si les bulles d’air persistent (1000 x g ; 5 min ; 25 °C).
4. Ajoutez la cargaison (particule de type médicament ou nanovolume) à la concentration désirée et remuez modérément jusqu’à ce qu’elle soit homogène sans incorporer de nouvelles bulles d’air.
5. Éliminez les moules PDMS dans des plaques à 12 puits. Pour cela, installez les moules dans les puits avec de l’argile à modeler, du ciment dentaire ou tout autre matériau similaire.
6. On coule 50 μL du mélange polymérique chargé en médicament sur les moules PDMS et la centrifugeuse (3000 x g ; 5 min ; 25 °C). Ensuite, tournez les plaques à 180° et répétez le processus de centrifugation pour assurer le remplissage de toutes les cavités en forme d’aiguille.
7. Retirez soigneusement l’excès de dispersion polymérique chargée en médicaments. Utilisez une pipette pour transférer la dispersion polymérique si elle est liquide ; Utilisez une spatule si elle est très visqueuse.
8. Répétez le processus de double centrifugation (étape 1.6) pour remettre dans le moule toute dispersion polymérique chargée de médicaments qui aurait pu déborder lors de l’étape précédente.
9. Séchez la dispersion polymérique chargée en médicament dans les moules sous vide (600 mBar ; 30 min ; 25 °C).
10. Répétez le protocole au moins deux fois entre les étapes 1.6 et 1.9 pour garantir le remplissage correct des moules maîtres avec la dispersion polymérique chargée en médicament.
    REMARQUE : La force centrifuge peut être progressivement réduite de 500 x g (25 °C) à chaque répétition.
11. Préparez une dispersion polymérique hautement concentrée, libre de médicament, pour former la plaque de base du dispositif DMAP. Cela garantira que le médicament présent dans la dispersion remplie dans les cavités de la moisissure ne revienne pas vers la plaque de base.
12. On coule 50 μL de dispersion polymérique libre sur les moules PDMS et on s’étale en centrifugant deux fois, y compris sur des plaques médianes, à une rotation de 180° (500 x g ; 5 min ; 25 °C ; 2x). Après centrifugation, ajoutez 100 μL de dispersion à chaque moule, puis ajoutez 50 μL supplémentaires à la plaque de base après 12 heures.
13. Laissez les DMAP dans les moules PDMS à sécher pendant 3 à 5 jours à température ambiante dans un dessiccateur à scellement sec.
14. Démoldez soigneusement les DMAP du PDMS avec des pinces ou décollez-les avec du ruban scotch cellulose (Figure 1).
15. Caractérisez les DMAP fabriqués (voir étape 3).

2. Fabrication de réseaux de microaiguilles dissolvables par application de pression positive

1. Procédez de manière similaire à celle décrite dans la section précédente jusqu’à l’étape 1.5.
2. Coulez 150 μL du mélange polymère chargé en médicament sur les moules PDMS et placez-les dans un réservoir sous pression.
3. Remplissez le réservoir de pression d’air jusqu’à ce qu’il atteigne une pression de 3-4 bars pendant au moins 15 minutes.
4. Retirez soigneusement l’excès de dispersion polymérique chargée en médicaments. Pour cela, si la dispersion polymérique est liquide, utilisez une pipette, tandis que si elle est très visqueuse, on la retire avec une spatule.
5. Répétez l’application de pression (étapes 2.2-2.3) pour remettre dans le moule toute dispersion polymérique chargée de médicament qui aurait pu déborder lors de l’étape précédente.
6. Séchez la dispersion polymère chargée en médicament dans les moules sous vide (600 mbar ; 30 min ; 25 °C).
7. Préparez une dispersion polymérique hautement concentrée, libre de médicament, pour former la plaque de base du dispositif DMAP. Cela garantira que le médicament présent dans la dispersion remplie dans les cavités de la moisissure ne revienne pas vers la plaque de base.
8. Couler 0,2 g de dispersion polymère libre sur les moules PDMS et appliquer une pression positive, comme décrit à l’étape 2.3.
9. Procédez de manière similaire à celle décrite dans la section précédente à partir de l’étape 1.13.

3. Caractérisation des DMAP

REMARQUE : À cette étape, des méthodes impliquant l’utilisation de tissus cutanés humains et/ou animaux ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles. De plus, les méthodes impliquant l’utilisation d’échantillons de peau animale ont été réalisées conformément au principe des 3R pour l’expérimentation animale.

1. Visualisez les DMAP à l’aide d’une micro-caméra avec le grossissement approprié pour distinguer les projections en forme^{d’aiguille 7}.
   REMARQUE : Si elles ont été chargées d’un médicament ou d’un colorant coloré, une couleur différente doit être observée entre les extrémités et la plaque de base.
2. Fixez les DMAP à un dispositif de support et visualisez la morphologie et la longueur des projections en forme de microaiguille par microscopie optique. Une structure de pointe tranchante doit être observée. Enregistrez la durée des projections de type microaiguille avec le logiciel approprié pour votre microscope optique.
   REMARQUE : Pour mesurer la longueur de la microaiguille par microscopie optique, les MAP doivent être affichées perpendiculairement aux objectifs. Les mesures de longueur et la forme des projections en forme de microaiguille doivent être confirmées par microscopie électronique à balayage.
3. Évaluer les propriétés mécaniques des DMAP face à la déformation des microaiguilles après compression sur une surface solide. Pour cela, placez l’appareil DMAP dans un applicateur DMAP commercialement disponible et compressez-le contre une surface plane en acier inoxydable pendant 30 s. Après compression, enregistrez la longueur des projections de type microaiguille et calculez le pourcentage de déformation en le comparant avec la longueur initiale selon l’équation^{suivante 7} :
   
   Où h_o et_{h f} représentent respectivement la longueur des microaiguilles avant et après la compression.
   REMARQUE : Si disponible, l’utilisation d’un analyseur de textures standardise la force de compression. Dans ce cas, une force de 32 N/array imite la force moyenne du pouce que les patients appliquent lors de l’auto-administration des dispositifs DMAP.
4. Déterminer la capacité d’insertion préliminaire des DMAP par une méthode de peau artificielle de substitution basée sur des feuilles thermoplastiques en matériau^{oléfine 8}. Pour cela, compressez le dispositif DMAP contre huit feuilles liées en suivant les conditions décrites à l’étape 3.4. Le nombre de trous créés dans chaque couche est observé par microscopie optique ou à l’aide d’une caméra microscopique, et le pourcentage de pénétration à différentes profondeurs est calculé.
   REMARQUE : Les feuilles thermoplastiques disponibles dans le commerce présentent généralement une épaisseur de 127 μm.
5. Déterminer la capacité d’insertion ex vivo des DMAP à partir d’explantes cutanées humaines, porcines ou rongeurs préalablement excisées et soigneusement taillées. Nettoyez l’explant de peau avec beaucoup d’eau en le faisant tremper 1 à 2 minutes dans l’eau, puis placez-le sur une mousse enveloppée de papier aluminium avec le côté stratum corneum vers le haut.
   1. Procéder à l’insertion dans les conditions décrites à l’étape 3.4. Laissez les DMAP insérés dans la peau jusqu’à la dissolution des pointes de microaiguilles. Si les DMAP sont chargés d’un colorant ou d’un médicament coloré, la coloration des côtés interne et externe de la peau révèle une insertion réussie^{des DMAPs 9}. De plus, des microcanaux peuvent être observés par analyse histologique des sections^{cutanées 7}.
      REMARQUE : Cette étape, impliquant la peau humaine ou animale ex vivo , a été réalisée conformément aux directives et à l’approbation du Comité d’éthique de la recherche humaine et animale de l’Université de Valence. Le consentement éclairé a été obtenu lorsque cela était applicable, et toutes les expériences respectaient les normes éthiques institutionnelles et européennes pour l’utilisation des tissus humains et animaux dans la recherche biomédicale.
6. Déterminer la teneur en eau résiduelle par analyse thermogravimétrique. La perte de poids observée jusqu’à 100-110 °C est attribuée aux résidus^{d’eau 10}.
   REMARQUE : Selon la source de la littérature, la teneur maximale en eau résiduelle autorisée est de 5 % à 10 % du poids total afin d’assurer un séchage optimal des DMAP.
7. Quantifiez la charge de la cargaison en immergeant les DMAP dans 5 à 10 mL d’eau (ou, alternativement, un milieu de libération aqueux approprié pour le médicament analysé) à 32-37 °C et quantifiez la quantité de cargaison à l’aide d’une méthode analytique optimale.
   REMARQUE : La spectrophotométrie UV-Vis est couramment utilisée pour l’analyse de petites molécules. Pour les composés à faibles limites de détection et de quantification, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la détection UV-Vis, à la fluorescence ou électrochimique est fortement recommandée. Le HPLC couplé à la spectrométrie de masse peut être utilisé lorsque une sensibilité et une spécificité exceptionnelles sont requises. La détermination analytique des cargaisons de protéines et d’anticorps est généralement réalisée à l’aide de tests d’acide bicinchoninique (BCA) et d’immunodosages, tels que le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) ou le Western bloting, respectivement. Les profils de libération de médicaments sont obtenus par échantillonnage (0,2-1 mL) à des moments prédéterminés à partir du milieu aqueux^{de libération 11}. Après chaque point d’échantillonnage, le volume soustrait est remplacé par le même volume de média de libération trempée afin d’éviter les erreurs liées à l’auto-concentration des échantillons.
8. Évaluer la stabilité des DMAP en répétant les tests de caractérisation mentionnés ci-dessus afin de garantir que les caractéristiques des DMAP restent constantes pendant la période de stockage dans les conditions de stockage conçues.
   REMARQUE : Si la cargaison est thermostable, les DMAP sont généralement stockés à température ambiante (25 °C). Pour les ingrédients actifs thermosensibles, les DMAP sont stockés à 4 °C. L’humidité relative doit rester en dessous de 30 %. La stabilité des DMAP est régulièrement surveillée sur une période de six mois.
9. Déterminez le dépôt et l’absorption de la peau ex vivo à travers la peau à l’aide d’un système de cellules de diffusion franzienne (FDC). Pour cela, préparez la peau comme décrit et insérez les DMAP dans la structure cutanée pendant 30 s, comme décrit à l’étape 3.6.
   1. Ensuite, collez la chambre donneuse de FDC à la peau avec une quantité appropriée de cyanoacrylate. Une fois séché, fixez le complexe de chambre donneuse de peau à la chambre réceptrice à l’aide de pinces^{appropriées 12}. Enfin, procéder au protocole d’échantillonnage décrit à la sous-section 3.5.
      REMARQUE : Cette étape impliquant la peau humaine ou animale ex vivo a été réalisée conformément aux directives et à l’approbation du Comité d’éthique de la recherche humaine et animale de l’Université de Valence. Le consentement éclairé a été obtenu lorsque cela était applicable, et toutes les expériences respectaient les normes éthiques institutionnelles et européennes pour l’utilisation des tissus humains et animaux dans la recherche biomédicale. Si les DMAP se dissolvent lentement, fixez-les à la peau à l’aide de bandes adhésives chirurgicales pour éviter l’auto-expulsion de la structure cutanée.
10. Évaluer la biocompatibilité in vitro à l’aide de tests d’activité métabolique, tels que des tests à base de tétrazolium et de resazurine, ou des tests de prolifération, y compris les tests 5-Bromo-2'-désoxyuridine bromodoxyuridine (BrdU), selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les lignées cellulaires préférées sont les kératinocytes, les fibroblastes ou les mélanocytes. Les cellules non exposées aux DMAP sont généralement utilisées comme témoins négatifs, tandis que les cellules traitées avec du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 1 % servent de témoins positifs. L’évaluation de la biocompatibilité dépend du profil de dissolution des DMAP. Pour les DMAP à dissolution rapide (dissolution en moins de 24 heures), la méthode à base d’extraction est utilisée, où le dispositif est dissous avant l’exposition cellulaire. Pour les DMAP à dissolution lente, la méthode du contact direct est appliquée, l’appareil étant ajouté directement aux puits ensemencés. Selon la norme internationale ISO 10993, les résultats de viabilité cellulaire >70 % sont considérés comme non toxiques.

Résultats

Les DMAP fabriqués doivent présenter une apparence homogène avec une formation réussie de projections en forme de micro-aiguilles, comme montré à la Figure 2A. Lorsqu’une cargaison colorée est chargée uniquement dans la structure à microaiguilles, une petite quantité de médicament peut contaminer la plaque de base des DMAP en raison d’un débordement des embouts ou d’un nettoyage incomplet avant la dispersion polymérique libre du médicament. Cependant, une di...

Discussion

Le protocole décrit ici permet la préparation de DMAP. Cependant, la polyvalence et la large gamme de matériaux polymériques pouvant être utilisés pour la fabrication des DMAP permettent la production de dispositifs dissolvables avec différentes caractéristiques. Les résultats présentés correspondent aux DMAP à dissolution rapide, car ils ont été produits avec du PVP, un polymère hautement dispersable dans l’eau à faible concentration. Le temps de dissolution des DMAP peut être facilemen...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque de culture cellulaire à 12 puits	N/A	N/A	Aucune spécification. Toute plaque commerciale de culture cellulaire à 12 puits convient
Centrifugeuse	Eppendorf	Centrifugeuse 5810 G	Remplaçable par toute autre centrifugeuse adaptable aux plaques de culture cellulaire
Bleu de méthylène	Sigma Aldrich	66720	CAS 122965-43-9. Remplaçable par n’importe quelle autre teinture ou marque
Pâte à modeler	N/A	N/A	Aucune spécification. Toute pâte à modeler commerciale convient
Feuilles thermoplastiques de type oléfine	Amcor	PM996	Parafilm M
Poly (alcool vinylique) (PVA) MW : 9-10 kDa	Sigma Aldrich	363146	CAS 9002-89-5. Remplaçable par n’importe quelle autre marque
Poly (pyrroldone vinyle) (PVP) MW : 40 kDa	Sigma Aldrich	PVP40	CAS 9003-39-8. Remplaçable par n’importe quelle autre marque
Moules en polydiméthylsiloxane (PDMS)	Micropoint Technologies	ST-06	Distribution des aiguilles en réseau 15 x 15 ; Hauteur 600 et micro ; m; Base 200 & micro ; m; Pas de l’aiguille à 500 µ. Remplaçable par n’importe quel autre moule PDMS avec une autre forme et longueur de cavité
Réservoir de pression	Protrima	AT-10HT	Remplaçable par n’importe quel autre réservoir de pression supportant une pression de 4 bars