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Évaluation de l’effet de la thymoquinone sur la signalisation Keap-1/NRF-2, le stress oxydatif et le comportement chez les rats

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DOI :

10.3791/69924

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13 mars 2026

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1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole montre comment évaluer les effets de la thymoquinone sur la voie Keap-1/Nrf-2, les biomarqueurs du stress oxydatif et les résultats comportementaux dans un modèle de rat d’exposition subchronique à la deltamétrine.

Résumé

Les développements récents dans la recherche sur l’exposition aux pesticides ont accru l’intérêt pour les stratégies protectrices basées sur les antioxydants. La thymoquinone (TQ), un composé bioactif d’origine végétale, a été rapporté comme ayant des effets protecteurs contre divers agents toxiques. Cette étude décrit un protocole pour évaluer les effets de la QT sur les paramètres de stress oxydatif, la voie de signalisation Keap-1/Nrf-2, ainsi que les résultats comportementaux chez les rats exposés à de faibles doses de Deltaméthrine (DTM). Ici, 24 rats albinos Wistar mâles adultes (250 ± 20 g) ont été répartis aléatoirement en quatre groupes (n = 6/groupe) : témoin, TQ, DTM et DTM+TQ. La DTM (1,28 mg/kg) et la TQ (10 mg/kg) ont été administrées de façon intragastroque pendant 30 jours. Le poids corporel a été surveillé tout au long de l’étude. L’activité locomotrice et le comportement anxieux ont été évalués à l’aide du test en plein champ au 31e jour, et les comportements de type dépression au 32e jour. À la fin de la période expérimentale, le plasma et les tissus cérébraux ont été prélevés pour des analyses biochimiques, histopathologiques et moléculaires. Des marqueurs de stress oxydatif, incluant le malondiadéhyde, l’oxyde nitrique total, le glutathion et les niveaux de groupe sulfhydryle, ont été mesurés dans des échantillons de plasma et de cortex cérébral. Les niveaux d’expression de la protéine associée ECH de type kelch (Keap-1) et du facteur érythroïde 2 (Nrf-2) liés au facteur nucléaire 2 (Nrf-2) ont été analysés à l’aide de Western blotting et de l’immunohistochimie. Ce protocole offre une approche globale et reproductible pour étudier la neurotoxicité induite par les pesticides et les effets modulateurs des composés antioxydants.

Introduction

Les insecticides sont largement utilisés en agriculture et dans les environnements domestiques pour contrôler les ravageurs ; Cependant, une exposition chronique à de faibles doses peut entraîner une contamination de l’environnement et des effets néfastes sur la santé, tant chez l’homme que chez les animaux. Une telle exposition, en particulier par des aliments et de l’eau contaminés, a été associée à un risque accru de troubles neurologiques et d’autres toxicitéssystémiques 1.

Les pyréthroïdes ont en grande partie remplacé les insecticides organophosphorés en raison de réglementations plus strictes sur ces derniers et de leur toxicité relativement faible chez les mammifères. Le DTM, un pyréthroïde de type II contenant un groupe α-cyano, est l’un des insecticides les plus couramment utilisés dans le monde et est considéré comme très efficace contre lesinsectes 2. Malgré cela, des études expérimentales ont démontré que l’exposition au DTM induit un stress oxydatif et une neurotoxicité dans les modèlesanimaux 3,4.

Le DTM est un composé hautement lipophile qui traverse facilement la barrière hémato-encéphalique et perturbe la fonction neuronale en prolongeant l’ouverture des canaux sodium voltage-dépendants. Cet effet entraîne une activation neuronale répétée, une augmentation de l’apport intracellulaire de sodium et une génération accrue d’espèces réactives d’oxygène, entraînant finalement des dommages oxydatifs, de l’inflammation et des altérations comportementales, en particulier dans des régions cérébrales vulnérables telles que l’hippocampe et le cortexcérébral 1. Compte tenu de l’inquiétude croissante concernant la neurotoxicité induite par les pesticides, une attention croissante a été portée aux stratégies protectrices basées sur les antioxydants issues de sources naturelles. TQ, un constituant bioactif majeur de l’huile essentielle Nigella sativa, a été rapporté comme possédant de puissantes propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires etneuroprotectrices. Plusieurs études ont démontré ses effets bénéfiques contre le stress oxydatif induit chimiquement et les processusneurodégénératifs 5,6,7,8,9.

L’un des principaux mécanismes sous-jacents aux effets protecteurs de la TQ implique la modulation de la voie de signalisation Keap-1/Nrf-2. Cette voie joue un rôle central dans le maintien de l’homéostasie redox cellulaire en régulant l’expression des enzymes antioxydantes et détoxifiantes. Sous des conditions de stress oxydatif, la répression médiée par Keap-1 de Nrf-2 est soulagée, permettant à Nrf-2 de se translocer vers le noyau et d’activer l’expression génique dépendante de l’élément de réponseantioxydant 9.

Parce que l’exposition au DTM induit des altérations aux niveaux moléculaire, biochimique, histologique et comportemental, une approche analytique unique est insuffisante pour capturer l’étendue complète de ses effets neurotoxiques. Ainsi, ce protocole intègre des évaluations comportementales, des analyses de biomarqueurs de stress oxydatif, une évaluation histopathologique et une investigation moléculaire de la voie Keap-1/Nrf-2 afin de fournir un cadre complet et reproductible pour étudier la neurotoxicité induite par les pesticides et les effets modulateurs de composés antioxydants tels que TQ.

Pris ensemble, les preuves résumées ci-dessus soulignent la nécessité d’une approche expérimentale intégrée pour clarifier les mécanismes sous-jacents à la neurotoxicité induite par le DTM et évaluer les interventions protectrices potentielles. En combinant des évaluations comportementales avec des analyses biochimiques, histopathologiques et moléculaires de la voie Keap-1/Nrf-2, le protocole actuel permet une évaluation multidimensionnelle des lésions neuronales liées au stress oxydatif. L’interprétation des résultats expérimentaux dans ce cadre mécaniste met l’accent sur la façon dont la TQ module la signalisation redox, atténue les lésions tissulaires et améliore les résultats comportementaux dans le contexte de l’exposition subchronique à la DTM.

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Protocole

Le Comité local d’éthique de l’expérimentation animale institutionnelle a approuvé le protocole expérimental sous le numéro d’enregistrement 68429034/35. La durée totale de l’étude était de 32 jours. Avant ces expériences, les animaux étaient acclimatés aux conditions standard de laboratoire. Toutes les procédures expérimentales ont été menées en stricte conformité avec les directives institutionnelles et internationales d’éthique animale. Les matériaux expérimentaux utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

REMARQUE : Les déchets chimiques et biologiques ont été éliminés conformément aux directives de sécurité des laboratoires et de gestion des déchets de l’institution. Les acides, bases et solvants organiques étaient collectés dans des contenants séparés et étiquetés et livrés à l’unité institutionnelle de déchets dangereux. Les matériaux biologiques et les consommables contaminés étaient collectés dans des contenants à biohazard, stérilisés et transférés à l’établissement institutionnel approprié pour leur élimination finale.

1. Conception expérimentale

  1. Obtenir 24 rats albinos mâles adultes pesant 250 ± 20 g auprès du laboratoire d’expérimentation animale. Hébergez chaque rat individuellement dans des cages à 24 ± 2 °C sous un cycle clair/obscur de 12 heures, avec un accès improvisé à la nourriture standard pour rats et à l’eau du robinet.
  2. Divisez aléatoirement les animaux en quatre groupes (n = 6 par groupe) : Groupe 1 : Contrôle (C), Groupe 2 : TQ, Groupe 3 : DTM, Groupe 4 : DTM + TQ.
  3. Dissoudre le DTM (pureté 98 %) dans de l’huile de maïs et administrer à une dose de 1,28 mg/kg via une gavage intragastrique pendant 30 jours.
  4. Dissoudre le TQ à une dose de 10 mg/kg dans de l’huile de maïs et administrer par une gavage intragastrique pendant 30 jours. Préparez tous les médicaments frais chaque jour et administrez-les à un volume total de 1 mL/kg.
  5. Dans le groupe de traitement combiné, administrez la QT immédiatement après la DTM. Administrez de l’huile de maïs seule au groupe témoin pour gérer le stress lié au gâchette.
    REMARQUE : La dose de DTM a été sélectionnée sur la base de la littérature antérieure pour induire un stress oxydatif sans provoquer de morbidité et correspond à environ 1/100 de la LD501.

2. Mesure du poids corporel

  1. Mesurez le poids corporel aux jours 1, 10, 20 et 30 de l’étude (Figure 1).

3. Paramètres comportementaux

  1. Effectuez tous les tests comportementaux dans des conditions standardisées afin d’assurer la cohérence. Enregistrez à la fois le test de nage forcé (FST) et le test en champ ouvert (OFT) à l’aide d’une caméra aérienne offrant une vue complète de l’appareil d’essai. Maintenir l’éclairage à environ 100–150 lux. Définissez l’immobilité comme l’absence de mouvement actif, sauf pour les mouvements minimes nécessaires à la posture et à la respiration. Nettoyez toutes les pistes de test avec 70 % d’éthanol entre animaux pour éviter les influences olfactives.
  2. FST
    1. Effectuer la FST au jour 32 pour évaluer un comportement proche de la dépression. Effectuer une séance de pré-test de 15 minutes, 24 heures avant la session de test de 5 minutes, afin d’habituer les animaux à l’environnement aquatique et de minimiser le stress induit par la nouveauté. Ne faites pas de notation comportementale pendant la séance pré-test.
    2. Placez individuellement les rats dans des contenants cylindriques (diamètre : 35 cm, hauteur : 50 cm) contenant 30 cm d’eau maintenus à 25 ± 1 °C pendant 5 minutes.
    3. Enregistrez les durées de la natation, de l’escalade et de l’immobilité à l’aide d’une caméra vidéo. Quantifiez les paramètres comportementaux en quelques secondes à partir des enregistrementsvidéo 10.
    4. Définissez les comportements comme suit :
      Immobilité : Considérez l’animal immobile lorsqu’il flotte sans mouvements actifs, ne faisant que des mouvements minimes nécessaires pour garder sa tête hors de l’eau.
      Natation : Définissez la natation comme un mouvement horizontal actif dans tout le cylindre avec des mouvements coordonnés des quatre pattes.
      Escalade : Définissez l’escalade comme des mouvements vigoureux vers le haut dirigés vers le haut contre la paroi cylindrique tandis que l’animal reste en position verticale.
    5. Si l’animal reste complètement immobile, notez le comportement comme étant immobile selon les critères prédéfinis.
    6. N’appliquez pas de stimulation externe ni de correction de trajectoire pendant la séance de test. Laissez l’animal se comporter librement pendant toute la période de 5 minutes, sauf intervention nécessaire pour des raisons de sécurité (par exemple, risque de noyade).
  3. OFT
    1. Réaliser l’OFT au jour 31 pour évaluer l’activité locomotrice et les comportementsanxieux 11. Enregistrez des mouvements individuels pendant 5 minutes dans une arène de 90 x 35 cm, divisés en 24 unités égales par des lignes noires.
    2. Quantifier les paramètres comportementaux suivants à partir d’enregistrements vidéo réalisés par un enquêteur aveuglé à l’allocation de groupe :
      Le nombre de croisements avec les quatre pattes (activité locomotrice)
      Temps passé dans les zones centrales et périphériques (comportement anxieux)
    3. Si un animal reste complètement immobile, notez le comportement comme étant immobile et attribuez zéro passage pour cette période.
    4. N’appliquez pas de stimulation externe, de repositionnement ou de correction de trajectoire pendant la séance de test.
    5. Laissez l’animal se comporter librement pendant toute la période de 5 minutes, sauf intervention nécessaire pour des raisons de sécurité.
    6. Nettoyez l’arène avec 70 % d’éthanol entre les animaux pour éliminer les signaux olfactifs.

4. Évaluation des marqueurs de stress oxydatif

  1. Effectuez toutes les interventions au jour 32. Anesthésiez profondément les rats avec de la xylazine intramusculaire (5 mg/kg) et de la kétamine (45 mg/kg). Confirmez l’anesthésie profonde en l’absence du réflexe de retrait des pédales. Prélever environ 3 à 5 mL de sang par ponction cardiaque dans des tubes recouverts d’EDTA.
  2. Euthanasie complète par exsanguination sous anesthésie profonde et confirmation de la mort avant prélèvement des tissus. Centrifugez les échantillons sanguins à 3 000 x g pendant 10 à 15 minutes à 4 °C. Collectez soigneusement le plasma sans déranger la couche buffy et stockez les aliquotes à −80 °C. Disséquer rapidement le cerveau sur la glace. Séparer l’hémisphère cérébral gauche et l’hippocampe pour des analyses biochimiques et congeler instantanément dans de l’azote liquide (stockage à −80 °C). Fixez l’hémisphère cérébral droit dans du formol tampon neutre à 10 % pour une évaluation histologique.
  3. Analyses du stress oxydatif plasmaque
    1. Peroxydation lipidique plasmatique (test TBARS)
      1. Échantillons de plasma centrifugeuse (3 000 x g, 10 min, 4 °C). Mélangez 0,5 mL de plasma avec 1 mL de réactif TCA–TBA–HCl (acide trichloroacétique (TCA) à 15 %, acide thiobarbiturique à 0,375 % (à déterminer), acide chlorhydrique (HCl) à 0,25 N). Centrifugez à 1 000 x g pendant 10 minutes et transférez le surnageant dans des tubes en verre. Ajoutez 50 μL d’hydroxytoluène butylé (BHT) à 0,02 % pour éviter l’oxydation artificielle.
      2. Chauffez à 100 °C pendant 15 minutes, refroidissez à température ambiante, centrifugez à 1 000 x g pendant 10 minutes, et mesurez l’absorption surnageante à 532nm 10. Calculer la concentration de MDA en utilisant la loi de Beer–Lambert
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm et s’exprime sous forme de plasma nmol/mL.
    2. Niveaux de thiol plasmaque (RSH)
      1. Mélangez 0,5 mL de plasma avec un tampon Tris-HCl (100 mM, pH 8,2) contenant 1 % de dodécyle sulfate de sodium (SDS) et 2 mM d’acide éthylédidiaminetétraacétique (EDTA). Incubez 5 min à 25 °C et centrifugez (3 000 x g, 10 min, 4 °C). Utilisez le surnageant pour l’analyse.
      2. Ajoutez 0,3 mM 5,5′-dithiobis-(acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) et incubez à 37 °C pendant 15 minutes. Mesurez l’absorbance à 412nm 10. Calculer les concentrations de RSH en utilisant ε = 13 600 M⁻1 cm⁻1 et exprimer en plasma μmol/L.
    3. Niveaux de NOx en plasma (réaction de Griess)
      1. Dématérialiser le plasma avec 0,3 M d’hydroxyde de sodium (NaOH) et 5 % de sulfate de zinc (ZnSO₄). Centrifugez à 20 000 x g pendant 5 minutes et récupérez le surnageant.
      2. Préparez des solutions de stock nitrate (100, 10 et 1 mmol/L) et générez une courbe standard (1–100 μmol/L). Chargez 100 μL de surnageant (puits dupliqués) dans une microplaque.
      3. Ajoutez 100 μL de chlorure de vanadium (III) (VCl₃), suivis de 50 μL de sulfanilamide et 50 μL d’éthylédiamine N-(1-naphthyl). Incubez 30 à 45 minutes à température ambiante et mesurez l’absorbance à 540nm 10. Déterminer les concentrations de NOx à partir de la courbe standard et exprimer en plasma μmol/L.
  4. Analyses du stress oxydatif tissulaire
    1. Utilisez environ 100 mg de tissu de l’hémisphère cérébral gauche pour toutes les analyses biochimiques.
    2. Peroxydation des lipides tissulaires (test TBARS)
      1. Homogénéisez le tissu (1:10 p/v) dans un ATC à 10 % glacé. Ajoutez un volume égal de 0,67 % à cuillères à cuire et chauffez à 100 °C pendant 15 minutes. Refroidissez et centrifugez (3 000 x g, 10 min, 4 °C)10. Mesurez l’absorption surnageante à 535 nm. Calculer la MDA en utilisant ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 et exprimer en nmol/g de tissu humide.
    3. Niveaux de glutathion tissulaire (GSH)
      1. Homogénéisez les tissus en 10 % de TCA (1:10 p/v) et centrifugez (3 000 x g, 10 min, 4 °C). Mélangez 0,5 mL de surnageant avec 2 mL de solution DTNB (0,4 mg/mL dans 1 % de citrate de sodium)10. Mesurez immédiatement l’absorbance à 412 nm. Calculez la GSH en utilisant ε = 13 600 M⁻1 cm⁻1 et exprimez-les en μmol/g de tissu humide.
    4. Niveaux de NOx tissulaires (réaction de Griess)
      1. Homogénéisez les tissus dans une solution physiologique phosphatée tamponnée (PBS) (1:5 p/v) et une centrifugeuse (2 000 x g, 5 min). Déprotéiniser le surnageant avec 0,3 M de NaOH et 5 % de ZnSO₄. Centrifugez (3 000 x g, 20 min) et récupérez le surnageant transparent.
      2. Préparez des étalons nitrates (1–100 μmol/L). Chargez 100 μL de surnageant dans des puits en double. Ajoutez des réactifs VCl₃ et Griess comme décrit ci-dessus. Incubez 45 minutes à 37 °C et mesurez l’absorbance à 540nm 10. Déterminer les concentrations à partir de la courbe standard et exprimer en tissu μmol/g.
        ATTENTION : Les procédures impliquant des produits chimiques dangereux, y compris le TCA, le HCl, le NaOH et les solvants organiques, ont été réalisées dans une hotte chimique certifiée. Des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés, tels que des blouses de laboratoire, des gants résistants aux produits chimiques, des lunettes de protection et, si nécessaire, des visières, ont été utilisés lors de toutes les expériences. Tous les produits chimiques ont été manipulés conformément aux directives de sécurité institutionnelles et aux fiches de données de sécurité des matériaux (MSDS) pertinentes.

5. Détermination des niveaux de Keap-1 et Nrf-2 par analyse Western blot

  1. Découpez le tissu hippocampique en morceaux de 50 mg et placez dans des tubes d’homogénéisation contenant 500 μL de tampon RIPA complétés par un cocktail inhibiteur de protéase.
  2. Ajoutez une quantité appropriée de billes magnétiques et homogénéisez à 1 000 x g pendant deux cycles. Centrifugez à 14 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C.
  3. Transférez le surnageant pour nettoyer les tubes de la microcentrifugeuse et centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions. Conservez les échantillons sur de la glace et déterminez les concentrations en protéines.
  4. Mesurez les concentrations de protéines à l’aide d’un fluoromètre avec le kit de test BR des protéines, en suivant les instructions du fabricant.
  5. Préparez des gels SDS–PAGE à 10 % pour l’électrophorèse. Ajustez la concentration de protéines à 30 μg/μL.
  6. Ajoutez 4 tampons de Laemmli à un ratio 3:1 et complétez avec 10 % de β-mercaptoéthanol. Chauffez les échantillons à 95 °C pendant 5 minutes, puis centrifugez brièvement.
  7. Chargez 5 μL de marqueur protéique et 30 μg de protéines par voie. Faites fonctionner les gels à 110 V pendant 60 à 90 minutes.
  8. Activez les membranes PVDF à 100 % de méthanol pendant 3 à 5 minutes, puis équilibrez en 1× tampon de transfert pendant 10 minutes à température ambiante avant le transfert.
  9. Humidifier les papiers filtres et les éponges avec un tampon de transfert et assembler soigneusement le sandwich de transfert, afin d’éliminer complètement les bulles d’air. Effectuer le transfert de protéines à l’aide d’un système de transfert humide à 100 V pendant 90 minutes à 4 °C (tension constante).
  10. Bloquez les membranes dans une albumine sérique bovine à 3 % (BSA) pendant 1 h à température ambiante sur un shaker orbital. Incuber les membranes toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dilués à 3 % de BSA (Keap-1 et Nrf-2, 1:3 000 ; β-actine, 1:1 000).
  11. Lavez les membranes 5 fois pendant 5 minutes avec 1 × de solution physiologique tamponnée Tris-buffer avec un détergent Tween 20 à 0,1 % (TBS-T). Incubez avec un anticorps secondaire (1:15 000) pendant 1 h à température ambiante dans le noir.
  12. Laver les membranes comme décrit et incuber avec un substrat à chimiluminescence améliorée (ECL) (par exemple, substrat HRP à base de luminol) selon les instructions du fabricant (mélanger des volumes égaux de réactifs A et B juste avant utilisation). Appliquez suffisamment de substrat pour recouvrir complètement la surface de la membrane (environ 1 mL par membrane) et incubez pendant 1 à 2 minutes à température ambiante.
  13. Détecter les signaux chimiluminescents à l’aide d’un système d’imagerie numérique équipé pour la détection chimiluminescence (aucune longueur d’onde spécifique d’excitation n’est requise, car l’émission lumineuse résulte de la réaction HRP–luminol). Acquérir des images en utilisant des réglages d’exposition automatiques tout en assurant des bandes non saturées. Maintenez les mêmes paramètres d’exposition pour tous les échantillons dans la même tache.
  14. Effectuer une analyse densitométrique à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image sous les mêmes paramètres de sélection du ROI, de soustraction de fond et de normalisation. Normaliser les intensités des bandes Keap-1 et Nrf-2 à la protéine de maintien correspondante β-actine. Exportez les valeurs normalisées sous forme de fichiers .csv pour l’analyse statistique.

6. Analyse histopathologique

  1. Fixez l’hémisphère cérébral droit dans du formol neutre à 10 % pendant 72 heures. Déshydrater par une série d’éthanol graduée (70 %–100 %), s’insérer dans la paraffine, et sectionner à 5 μm.
    Obtenir des sections cérébrales coronales aux niveaux du cortex hippocampal et entorhinal selon les coordonnées stéréotaxiques définies dans Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Utilisez le visualiseur interactif d’atlas cérébral de rat (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas pour vérifier et affiner la localisationanatomique 11.
  2. Préparez quatre sections coronales consécutives (5 μm d’épaisseur) à partir de tissu cérébral incrusté de paraffine en utilisant des procédures histologiques standard. Colorez les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) selon les protocolesconventionnels 12. Examinez toutes les lames au microscope optique à un grossissement de 200×. Assurez-vous que l’évaluation histologique est réalisée par un enquêteur aveugle afin de minimiser le biais del’observateur 13.
    REMARQUE : Cette procédure a permis une comparaison anatomique cohérente entre les groupes.
  3. Évaluer semiquantitativement la perte neuronale, l’œdème cellulaire, la pyknose nucléaire, l’infiltration inflammatoire et la congestion vasculaire dans 10 champs aléatoires par section.
  4. Calculez les scores moyens pour chaque paramètre par groupe. Les critères de notation étaient les suivants : 0 (aucun, <5 %), 1 (léger, <33 %), 2 (modéré, 33–66 %) et 3 (sévère, >66 % ; Tableau 1).

7. Analyse immunohistochimique de la réactivité de Nrf-2 et Keap-1 dans l’hippocampe et le cortex entorhinal

  1. Préparez des sections de 5 μm d’épaisseur provenant de l’hippocampe et du cortex entorhinal et montez-les sur des lames en verre.
  2. Déparaffinez et réhydratez les sections, puis lavez-les dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS) à température ambiante.
  3. Incubez des sections avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 5 minutes pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase. Lavage des sections avec PBS
  4. Effectuer la récupération d’antigènes en chauffant les lames dans un tampon de citrate de sodium (pH 6,0) pendant 10 à 15 minutes. Laissez refroidir les lames pendant 30 minutes, puis lavez avec du PBS.
  5. Incubez à nouveau avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 15 minutes pour assurer une inhibition complète de la peroxydase. Lavez les sections avec du PBS.
  6. Appliquez une solution de blocage pendant 10 minutes pour réduire les liaisons non spécifiques. Incubez les sections toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre Nrf-2 (dilution 1:100) et Keap-1 (dilution 1:200). Lavez les sections avec du PBS après l’incubation.
  7. Incubez les sections avec un anticorps secondaire approprié pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les sections avec du PBS.
  8. Appliquez de la streptavidine et de la peroxydase sur les sections et incubez pendant 20 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée (maintenez une humidité relative de 95 à 100 % à l’aide d’une boîte d’incubation scellée contenant du papier filtre humidifié). Lavez les sections avec du PBS après l’incubation.
  9. Appliquez le chromogène DAB et surveillez le développement des couleurs sous un microscope optique à un grossissement de 100×. Arrêtez la réaction en rinçant les lames à l’eau du robinet.
  10. Contre-teinte les sections avec de l’hématoxyline diluée à 1:9 pendant 5 minutes à température ambiante. Rincez soigneusement avec du PBS et de l’eau distillée. Montez les sections avec un support de montage permanent.
  11. Examinez les sections colorées au microscope optique. Capturez des photomicrographies à un grossissement de ×400 à partir de 16 champs représentatifs par section.
  12. Quantifier l’immunoréactivité du Nrf-2 et du Keap-1 à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Enregistrer et analyser les données quantifiées pour une évaluation statistique ultérieure.
  13. Pour l’analyse immunohistochimique, ouvrez les images dans ImageJ et calibrez à l’aide de l’outil Set Scale. Convertir toutes les images en niveaux de gris 8 bits pour standardiser les mesures d’intensité. Définissez manuellement les régions d’intérêt (ROI) pour les zones positivement colorées et les régions adjacentes en arrière-plan et enregistrez-les dans le ROI Manager.
  14. Quantifier l’intensité de coloration en utilisant une déconvolution colorée H-DAB cohérente, suivie de paramètres de seuil identiques pour tous les échantillons. Mesurez la valeur moyenne de gris, la densité optique et le pourcentage de surface positive.
  15. Pour l’analyse basée sur les cellules, segmentez les images à seuil avec l’outil Bassin versant, et quantifiez les cellules positives avec Analyze Particles. Toutes les données ont été exportées sous forme de fichiers .csv pour l’analyse statistique.

8. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques en utilisant SPSS version 29.0. Entrez les données brutes dans l’onglet Vue des données, chaque ligne représentant un animal individuel et les variables définies dans l’onglet Vue des variables ; le groupe expérimental était codé comme une variable catégorielle (Contrôle, TQ, DTM et DTM+TQ).
  2. Évaluez la normalité des données à l’aide du test de Shapiro–Wilk en sélectionnant Analyser > statistiques descriptives > Explorer, en assignant les variables de résultat à la liste des dépendants et le groupe à la liste des facteurs, et en activant les graphiques de normalité avec les tests. Pour les variables normalement distribuées, effectuez des comparaisons de groupes en utilisant l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) via Analyse > Comparaison des moyennes > ANOVA unidirectionnelle, avec des statistiques descriptives et le test de Levene pour l’homogénéité des variances activés dans la section Options.
  3. Lorsqu’un effet principal significatif a été détecté, appliquer le test post hoc de Tukey via le menu Post Hoc pour identifier les différences par deux groupes. Utilisez les résultats du test de Levene pour confirmer l’homogénéité de la variance (p > 0,05).
  4. Pour les données de notation histopathologique ne répondant pas aux hypothèses paramétriques, effectuer une analyse non paramétrique en utilisant le test de Kruskal–Wallis en sélectionnant Analyser > tests non paramétriques > dialogues hérités > K échantillons indépendants, suivi du test post hoc de Dunn avec correction de Bonferroni utilisant le module de test non paramétrique Independent Samples.
  5. Exportant les résultats statistiques et les tableaux résumés sous forme de fichiers .xls ou .csv, les résultats étaient exprimés en moyenne ± écart-type (SD), et une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Mesures de poids corporel
Le poids corporel a été enregistré les jours 1, 10, 20 et 30. Les rats des groupes C et TQ ont montré une augmentation progressive du poids corporel sur la période expérimentale, sans différence significative entre ces groupes au 30e jour. En revanche, les rats exposés au DTM ont montré une réduction significative du poids corporel par rapport aux témoins. La co-administration de TQ a atténué la perte de poids associée au DTM. Aucune mortalit...

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Discussion

Cette étude démontre que l’exposition orale subchronique au DTM induit des altérations comportementales, biochimiques, moléculaires et histopathologiques constantes chez les rats, et que le TQ atténue efficacement ces effets lorsqu’il est administré concomitantement. En intégrant des tests comportementaux standardisés avec le profilage de stress oxydatif, l’analyse au niveau des voies de signalisation Keap-1/Nrf-2 et l’évaluation histopathologique, le protocole fournit un cadre robuste e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts ni intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Cette recherche n’a reçu aucun financement externe.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5,5'-Dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque)Thermo Scientific & nbsp ;  ; 69-78-3  ;
Centrifugeuse de laboratoire NF048Nü ; ve43560
Beta_Actin  ;ThermoFisher Scientific, États-Unis7D2C10
Solution BSA   ;Proteintech, États-Unis)66201-1-IG
Hydroxytoluène butyléSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö ; R  ;Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a ?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM  ;   ;Bayer  ;TR01426058O
Hématoxyline et trait de trait ; éosin  ;Bio OpticaW01030708
Acide chlorhydriqueMerck7647-01-0
Image J logiciel programme  ;NIH ; Washington, États-Unishttps://imagej.net/ij/
Kit de coloration immunohistochimique   ;Lab VisionTM UltraVisionTM Système de détection à grand volume : anti-polyvalentHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Allemagnehttps://www.leicabiosystems
.com/équipement-histologie/mi
crotomes/histocore-autocut/
Microscope optique   ;Nikon, Eclipse  ;Ni-U, 940728
N-(1-Naphthyl)éthylénediamineThermo Scientific & nbsp ;1465-25-4
Lecteur nano microplaqueBMG LABTECHSPECTROstar Nano
solution physiologique tamponnée phosphate & nbsp ;MerckP4417
Anticorps primaires Keap-1  ;ProteintechCatégorie n° 10503-2-AP, 1:200
Anticorps primaires Nrf-2 & nbsp ;ProteintechCatégorie n° 16396-1-AP, 1/100
Kit de test BR pour la protéine qubit & nbsp ;ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
Citrate de sodiumMerck03-04-6132
Dodécyle sulfate de sodiumThermo Scientific & nbsp ;151-21-3
Hydroxyde de sodiumMerck1310-73-2
Nitrate de sodiumMerck7631-99-4
Streptavidine Peroxydase   ;Thermo Scientific & nbsp ;SHRP248-B
SulfanilamideThermo Scientific & nbsp ;  ; 63-74-1  ;
acide thiobarbiturique   ;Merck504-17-6
TQ  ;CAYMAN  ;490-91-5
Acide tricarballylique, 99 %Thermo-Sciences Chimiques  ; 139360500
Acide trichloroacétiqueThermo-Sciences Chimiques76-03-9
Tris-HClThermo Scientific & nbsp ;  ; 1185-53-1  ;
Chlorure de vanadium(III)Sigma Aldrich7718-98-1
Substrat chimiluminescent West Pico PLUS et iBright 750  ;Système scientifique Thermo Fisherhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system ?gad_source=1& GAD
_campaignid=16224184202& gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-& gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
Solution de sulfate de zincMerck7733-02-0

Références

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