Analyse spectrale Raman assistée par apprentissage automatique du nanocapteur ssDNA-SWCNT sensible à la sérotonine pour une meilleure sélectivité contre la dopamine

Summary

Le protocole décrit l’analyse spectrale Raman d’un nanocapteur SWCNT enveloppé dans ssDNA, permettant une meilleure mesure sélective de la sérotonine par rapport à la dopamine grâce à un modèle d’apprentissage automatique.

Abstract

La sérotonine (5-hydroxytriptamine, 5-HT) joue un rôle crucial dans la neuromodulation, mais les méthodes de détection actuelles peinent à détecter en temps réel la 5-HT avec une sensibilité et une sélectivité élevées. Nous avions auparavant développé un nanocapteur de sérotonine proche infrarouge (nIRHT), qui consiste en un nanotube de carbone à paroi simple enveloppé dans de l’ADN ss, détectant sensiblement le 5-HT. Cependant, la réponse de fluorescence du nIRHT ne peut pas faire de distinction entre la 5HT et la dopamine (DA), limitant ainsi ses applications pratiques. Dans cette étude, la spectroscopie Raman combinée à l’apprentissage automatique surmonte ce défi de sélectivité. Les caractéristiques spectrales en bande G ont révélé des signatures distinctes pour la liaison 5HT par rapport à la DA à nIRHT, la DA provoquant une meilleure suppression de la bande G. Nous avons utilisé le Raman différentiel (ΔRaman) pour isoler les changements spectraux spécifiques à l’analyte et entraîné trois modèles d’apprentissage automatique pour la classification. Le modèle de forêt aléatoire avec ΔRaman a obtenu une performance optimale avec une précision de 95,8 %, surpassant nettement les modèles utilisant des spectres Raman bruts. Cette approche a montré une spécificité améliorée, avec des réponses négligeables à l’acétylcholine, au GABA et au glutamate, et a atteint une limite de détection de 0,1 μM adaptée aux applications physiologiques. Cette approche basée sur Raman transforme le capteur de fluorescence nIRHT non sélectif en une plateforme capable de discrimination robuste des neurotransmetteurs, surmontant les problèmes de sélectivité dans la détection moléculaire basée sur des nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT).

Introduction

La sérotonine (5-hydroxytriptamine, 5-HT) est un neurotransmetteur essentiel qui régule l’humeur, la cognition, le sommeil et l’appétit, avec des dysfonctionnements impliqués dans la dépression, l’anxiété et d’autres troubles^{neuropsychiatriques 1}. La surveillance en temps réel de la dynamique de la sérotonine dans les systèmes biologiques reste difficile en raison de l’échelle de temps millisecondaire de transmission synaptique et de l’environnement chimique complexe des tissus^{neuronaux 2}. Malgré des avancées significatives dans les technologies de détection des neurotransmetteurs, atteindre à la fois une sensibilité élevée et une sélectivité moléculaire pour la sérotonine continue de poser d’importants défis analytiques.

Les méthodes actuelles de détection de la sérotonine vont des techniques analytiques traditionnelles aux plateformes émergentes de nanocapteurs. La chromatographie liquide haute performance avec détection électrochimique (HPLC-ED) reste la référence absolue, atteignant des limites de détection de 0,056 nM avec une excellente^{reproductibilité 3}. Cependant, le HPLC nécessite une préparation approfondie de l’échantillon et des analyses de 15 à 30 minutes, ce qui empêche la surveillance en^{temps réel 4}. La voltamétrie cyclique à balayage rapide (FSCV) permet une résolution temporelle de moins de seconde aux microélectrodes en fibre de carbone, mais souffre d’encrassement des électrodes et d’une sélectivité limitée entre des neurotransmetteurs structurellement^{similaires 5,6}. Les développements récents dans les capteurs fluorescents codés génétiquement, notamment iSeroSnFR⁷ et GRAB-5HT⁸, atteignent une sensibilité et une plage dynamique remarquables mais nécessitent une modification génétique des tissus cibles, limitant ainsi la traduction clinique.

Les capteurs optiques à nanotubes de carbone à paroi unique (SWCNT) se sont imposés comme des plateformes prometteuses pour la détection de neurotransmetteurs sans^{marqueur 9}. Les SWCNTs fonctionnalisés par ADN présentent une modulation de fluorescence proche infrarouge (nIR) lors de la liaison à l’analyte, permettant la détection dans la fenêtre transparente au tissu (900-1400 nm^)10,11. Le groupe de Landry a développé le capteur nIRHT par évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEC), en criblant ~10¹⁰ séquences uniques d’ADN ssl pour identifier des constructions sensibles à la^{sérotonine 12}. Ce capteur atteint une sensibilité aux micromolaires avec une augmentation de fluorescence de 200 % lors de la liaison à la sérotonine, fonctionnant indépendamment de l’oxydation de la dopamine ou de la sérotonine. Pour exclure toute interférence oxydative, notre étude précédente a confirmé la stabilité de ces solutions de neurotransmetteurs ; Les analyses UV-Vis et RMN n’ont révélé aucun changement oxydatif ni nouvelle formation de pics par rapport au 5HT¹² pur. De plus, le temps d’incubation court et les conditions de pH neutre utilisées dans le système sont conçus pour empêcher la formation significative de quinone. De même, le groupe Strano a été pionnier de la reconnaissance moléculaire en phase corona (CoPhMoRe), démontrant que les SWCNTs enveloppés dans (GT)₁₅ détectent la dopamine à 11 nM concentrations¹³. Notre groupe a récemment fait progresser ce domaine grâce à l’optimisation guidée par apprentissage automatique, obtenant des améliorations de sensibilité multipliées par 2,5 grâce à un criblage à haut débit de séquences systématiquement^{mutées 14}.

Malgré ces avancées, une limitation fondamentale persiste dans l’insuffisance de la sélectivité entre la sérotonine et la dopamine. Les deux neurotransmetteurs contiennent des anneaux aromatiques et des chaînes d’éthylamines, ne différant que par un seul groupe^{hydroxyle 15}. Les capteurs SWCNT actuels à base de fluorescence atteignent généralement des rapports de sélectivité inférieurs à 5:1, insuffisants pour distinguer les neurotransmetteurs co-libérés dans les environnements^{synaptiques 16}. Ce défi de sélectivité est particulièrement critique étant donné que la sérotonine et la dopamine colocalisent souvent dans les régions cérébrales régissant la récompense et la motivation¹⁷.

La spectroscopie Raman offre des informations chimiques complémentaires grâce à l’analyse des modes vibrationnels du complexe SWCNT-analyte¹⁸. La bande G (~1580 cm⁻¹) des SWCNTs se divise en composants G⁺ et G⁻, avec des fréquences sensibles à l’adsorption moléculaire et au dopage^{électronique 19}. Une étude précédente a démontré que les tensioactifs non covalents sur SWCNT induisent des changements spectraux Raman distincts dans la région^{de la bande G 20}.

Dans ce travail, nous démontrons une analyse spectrale Raman assistée par apprentissage automatique du capteur nIRHT afin d’obtenir une sélectivité accrue entre la sérotonine et la dopamine. Nous avons systématiquement caractérisé les réponses Raman dépendantes de la concentration de 0,01 à 100 μM, révélant des empreintes spectrales distinctes pour chaque neurotransmetteur. Trois modèles d’apprentissage automatique — réseau neuronal convolutionnel (CNN), machine à vecteurs de support (SVM) et forêt aléatoire (RF) — ont été entraînés sur des ensembles de données spectraux pour classifier l’identité des analytes. De manière cruciale, nous introduisons le traitement Raman différentiel, qui supprime les signaux de base pour isoler les caractéristiques spécifiques à l’analyte. Le modèle RF optimisé avec traitement DR atteint une précision de classification de 95,8 %, ce qui représente une avancée significative dans la discrimination moléculaire. Cette approche multimodale combinant sensibilité à la fluorescence nIR avec spécificité chimique Raman offre une voie vers une surveillance sélective de la sérotonine en temps réel dans des environnements biologiques complexes.

Protocol

1. fabrication de nanocapteurs SWCNT nIRHT fonctionnalisée par ADN ss.

1. Combinez 1 mg de nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNTs), 100 μL de 1 mM d’ADN ssl E6#9, et 900 μL de 1 solution saline tamponnée phosphate (PBS) dans un tube de 1,5 mL.
   ATTENTION : La poudre de SWCNT sèche représente un risque potentiel d’inhalation. Manipulez la poudre à l’intérieur d’une hotte chimique certifiée et portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris un masque et des gants.
2. Dispersez le mélange à l’aide d’un sonicateur de bain pendant 5 minutes. Sonicez le mélange à l’aide d’un sonicateur à pointe équipé d’une sonde de 3 mm à 50 % d’amplitude pendant 30 minutes dans un bain de glace.
3. Centrifugez la solution sonique à 21 500 x g pendant 1 h pour précipiter les SWCNT non dispersés. Prélevez soigneusement 850 μL de surnageant et transférez-les dans un nouveau tube.
4. Mesurez l’absorption de la suspension SWCNT collectée à une longueur d’onde de 632 nm. Calculez la concentration en utilisant le coefficient d’extinction SWCNT de 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Conservez la solution finale du capteur nIRHT à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Mesure des spectres Raman

1. Chargez 90 μL de la dispersion nIRHT de 10 mg/L dans une plaque à 96 puits. Mesurez le spectre Raman du capteur dans un tampon PBS à l’aide d’une source d’excitation laser de 532 nm. Fixez ce spectre enregistré comme référence.
   ATTENTION : Il est crucial de maintenir strictement la puissance laser à 10 mW et la longueur d’onde à 532 nm lors de l’étude d’échantillons biologiques vivants. Des puissances laser plus élevées peuvent induire une phototoxicité sévère et compromettre la viabilité cellulaire. Le laser à 532 nm à 10 mW utilisé dans ce protocole a été bien établi comme sûr et non destructeur pour l’analyse de cellules vivantes, préservant les organites^{sensibles 21} et l’activité électrophysiologique des neurones^{primaires 22} tout en assurant une acquisition robuste du signal Raman.
2. Injectez chaque solution captrice de 90 μL (10 mg/L) avec 10 μL de solution analytique pour atteindre des concentrations finales de 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 et 100 μM. Attendez 5 minutes après l’ajout de l’analyte pour permettre une incubation suffisante.
3. Mesurez les spectres Raman des échantillons incubés. Préparez les échantillons en triple exemplaire pour chaque concentration et répétez les étapes 2.1 à 2.2 pour garantir leur reproductibilité.

3. Analyse de données basée sur l’apprentissage automatique

1. Construisez le jeu de données à partir d’un total de 208 spectres Raman, comprenant 77 réponses à la dopamine (DA), 76 réponses à la sérotonine (5HT) et 47 réponses du groupe témoin (PBS).
2. Effectuer la soustraction de fond sur la région de la bande G des données spectrales. Normaliser les données soustraites en arrière-plan à partir du pic de la bande G+.
3. Appliquez un filtre médian pour réduire le bruit dans les spectres normalisés. Isoler les changements spectraux (ΔRaman) en soustrayant le spectre de contrôle normalisé de chaque spectre traité par un analyte.
4. Développer un modèle de réseau de neurones convolutionnel (CNN), de forêt aléatoire (RF) et de machine à vecteurs de support (SVM) pour la classification ternaire de 5HT, DA ou du témoin.
5. Divisez l’ensemble de données en ensembles d’entraînement, de validation et de test en utilisant un ratio de 6:2:2.
6. Configurez l’architecture CNN avec trois couches de convolution 1D utilisant une fonction d’activation ReLU et une taille maximale de pooling de 2, suivie de deux couches entièrement connectées.
7. Configurez la SVM à l’aide d’un noyau de fonction de base radiale (RBF) pour une classification non linéaire.
8. Configurez le modèle RF en utilisant des hyperparamètres par défaut.
9. Entraînez les modèles construits en utilisant une validation croisée à 5 ans. Calculez les métriques de performance moyennes sur les 5 volets pour garantir la robustesse statistique.
10. Sélectionnez le modèle qui offre la plus grande précision sur les données de validation pour l’analyse finale.
11. Évaluer le modèle sélectionné sur l’ensemble de test pour vérifier sa capacité de généralisation.
12. Déterminer la limite indirecte de détection (LOD) en excluant séquentiellement les données de l’ensemble d’entraînement qui tombent en dessous d’un seuil de concentration de 0,1 μM.
13. Tester le modèle entraîné sur toute la plage de concentration, y compris les concentrations inférieures aux critères, afin d’établir le LOD final.

Results

Le nanocapteur SWCNT fonctionnalisé par ADN ssDNA E6#9 (nIRHT), précédemment développé grâce à la méthodologie SELEC, démontre une amélioration réversible de la fluorescence nIR lors de la liaison 5HT, permettant l’imagerie 5HT en temps réel in vitro et ex^{vivo 12}. La séquence E6#9 (5'-CCCCCCAGCACCACAGCACACTCCCCCCCC-3') entoure les SWCNTs pour créer des sites de liaison pour le 5HT. Cependant, ce capteur manque de spécificité : le 5-HT et le DA en...

Discussion

L’analyse spectroscopique Raman a apporté une amélioration significative de la spécificité du capteur nIRHT, une capacité impossible à atteindre avec sa réponse de fluorescence conventionnelle. Nous avons observé que la DA induisait une suppression plus prononcée de la bande G⁻ (1570 ^cm-1) comparée à la 5HT. Ces signatures différentielles proviennent probablement de différentes orientations moléculaires et géométries de liaison sur la surface du SWCNT. Plus précisément, la moi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	; Nanointégris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Photon
Vibra Cell 130	SONIQUES